《生物大分子分离与分析》课件

生物大分子分离与分析生物大分子分离与分析是现代生物技术和生命科学研究的核心技术之一该课程涵盖蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化原理、技术方法和实际应用通过系统学习各种分离分析技术，学生将掌握从样品制备到产品纯化的完整工艺流程本课程不仅介绍传统的分离技术，还涉及最新的自动化设备和高通量分析方法学习内容与生物医药、食品工业、环境监测等多个领域密切相关，为学生未来的科研和工业实践奠定坚实基础生物大分子的基本概念蛋白质由氨基酸通过肽键连接形成的复杂分子，具有多级结构和特定功能，分子量从几千到几百万道尔顿不等核酸包括DNA和RNA，由核苷酸组成的遗传信息载体，具有双螺旋或单链结构，分子量可达数亿道尔顿多糖由单糖单位通过糖苷键连接形成的高分子化合物，如淀粉、纤维素和糖原，具有储能和结构功能脂类包括磷脂、胆固醇等，虽然分子量相对较小，但在生物膜结构和信号传导中发挥重要作用生物大分子的理化性质溶解性特征电荷性质与构象生物大分子的溶解性取决于其表面亲水和疏水区域的分布蛋白生物大分子携带的电荷分布不均匀，形成复杂的电场环境蛋白质表面的极性氨基酸残基与水分子形成氢键，而疏水残基倾向于质的表面电荷随pH变化而改变，在酸性条件下带正电，在碱性聚集在分子内部这种两亲性质影响着分子在不同溶剂中的溶解条件下带负电行为分子构象具有动态性，在生理条件下不断发生微小变化这种结溶解性还受到pH值、离子强度和温度的显著影响在等电点附构柔性对分子功能至关重要，同时也增加了分离分析的复杂性近，蛋白质溶解度最低，这一特性常被用于分离纯化过程中温度升高会增强分子运动，可能导致构象改变甚至变性生物大分子的主要来源天然产物提取细胞提取物重组表达从植物、动物或微生物通过细胞破碎获得的复利用基因工程技术在微组织中直接提取的生物杂混合物，含有多种蛋生物或细胞系中表达的大分子，保持原有的生白质、核酸和代谢产目标蛋白质可以大量物活性和天然结构特物需要经过多步分离生产特定分子，并通过征提取过程需要温和纯化才能获得目标分标签技术简化纯化过的条件以避免分子损子，但保持了分子间的程，是现代生物技术的伤，常用的来源包括植天然相互作用关系重要手段物叶片、动物器官和发酵产物分离与纯化流程总览样品制备细胞破碎、提取、初步处理初步分离离心、沉淀、粗分离精细纯化层析、电泳、最终纯化质量检测纯度分析、活性测定成功的分离纯化流程需要综合考虑目标分子的理化性质、纯度要求和成本效益每个步骤都应该最大化目标分子的回收率，同时去除杂质流程设计遵循从粗到细、从易到难的原则，先用简单快速的方法去除大部分杂质，再用精密技术获得高纯度产品工艺优化是一个迭代过程，需要不断调整参数以达到最佳效果细胞破碎方法机械破碎法化学破碎法包括匀浆器破碎、高压匀浆和超声利用化学试剂破坏细胞结构，包括波破碎等物理方法匀浆器通过高酶解法和渗透压法溶菌酶可以特速旋转的刀片产生剪切力破坏细胞异性降解细胞壁多糖，温和有效壁，适用于大多数细胞类型高压渗透压冲击通过改变细胞内外离子匀浆利用高压强迫细胞通过狭小孔浓度导致细胞破裂，适用于脆弱的径，瞬间压降导致细胞破裂，效率细胞类型化学法条件温和，但可高且温度可控能影响目标分子活性方法选择原则破碎方法的选择取决于细胞类型、目标分子性质和后续纯化要求革兰氏阳性细菌需要更强的破碎力，而动物细胞相对脆弱对于热敏性蛋白质，应选择低温操作的方法工业化生产中还需考虑成本效益和放大可行性抽提技术基础缓冲液设计选择合适的缓冲体系维持稳定的pH环境，常用的包括磷酸盐、Tris-HCl和HEPES缓冲液缓冲液的pKa值应接近目标pH，浓度通常为10-50mM条件优化温度控制在4°C以减少蛋白降解，添加蛋白酶抑制剂防止酶解离子强度通过添加NaCl调节，影响蛋白质溶解性和稳定性值影响pHpH值直接影响蛋白质的电荷状态和构象稳定性在等电点附近蛋白质容易聚集沉淀，偏离等电点则增加溶解性最适pH通常在

6.0-

8.0之间离子强度效应低离子强度有利于离子交换结合，高离子强度促进疏水相互作用盐浓度影响蛋白质的水化层和分子间相互作用，需要根据分离原理精确调节离心分离原理差速离心分离密度梯度离心基于颗粒大小和密度差异进行分离的最常用方法在恒定离心力利用密度梯度介质（如蔗糖、氯化铯）形成连续或不连续的密度作用下，大颗粒沉降速度快，小颗粒沉降速度慢，从而实现分级梯度，样品在离心过程中迁移到与其密度相等的位置达到平衡分离典型的分离程序包括低速离心去除细胞碎片（1000×g，10分该方法分辨率高，可以分离密度差异很小的组分常用于分离不钟），中速离心收集细胞器（10000×g，20分钟），高速离心同类型的细胞器、病毒颗粒和蛋白质复合物梯度浓度范围通常获得膜组分（100000×g，1小时）离心力的选择需要根据目为10-60%，离心时间较长，可达数小时甚至过夜标颗粒的沉降系数确定沉淀分离法盐析法溶剂沉淀法30-60%饱和度50-80%乙醇硫酸铵是最常用的盐析试剂，通过降低有机溶剂降低介电常数，破坏蛋白质水蛋白质溶解度使其沉淀不同蛋白质在化层乙醇和丙酮是常用溶剂，需要在不同盐浓度下沉淀，可实现初步分离低温下操作以防止蛋白质变性等电点沉淀冷沉淀法pH=pI4°C以下在等电点附近蛋白质净电荷为零，分子某些蛋白质在低温下溶解度降低而沉间静电排斥力最小，容易聚集沉淀是淀这种方法温和，不会引入化学试最温和的沉淀方法之一剂，但适用范围有限过滤与膜分离技术膜材料选择常用膜材料包括聚醚砜、聚偏氟乙烯和再生纤维素膜的截留分子量范围从1kDa到1000kDa，根据目标分子大小选择合适的孔径膜材料的化学兼容性和蛋白吸附特性也是重要考虑因素超滤浓缩利用压力驱动大分子溶液通过半透膜，实现浓缩和脱盐可以将蛋白质溶液浓缩10-100倍，同时去除小分子杂质操作压力通常为1-5bar，温度控制在4°C透析脱盐通过半透膜平衡原理去除小分子盐类和其他杂质透析过程缓慢但温和，不会对蛋白质造成剪切损伤可以同时实现缓冲液置换和浓度调节层析分离法分类与原理离子交换基于电荷差异的分离原理凝胶过滤根据分子大小进行筛分吸附层析利用分子间特异性结合分配层析基于溶解度差异的分离层析技术是生物大分子分离的核心方法，通过不同的分离机理实现高效纯化每种层析方法都有其特定的适用范围和优势，在实际应用中常常需要组合使用多种技术层析柱的设计、填料选择和操作条件优化是获得理想分离效果的关键因素离子交换层析阳离子交换洗脱策略使用磺酸基或羧基作为功能基团，结合带正电荷的蛋白质在低pH条件下蛋通过增加盐浓度或改变pH进行梯度洗脱盐梯度洗脱温和且可控性好，pH白质质子化带正电，与负电荷基团结合典型填料包括SP Sepharose和CM梯度洗脱分辨率高但可能影响蛋白活性洗脱曲线的优化是获得最佳分离效Sepharose果的关键阴离子交换含有季铵基或二乙氨基等正电荷基团，结合带负电荷的蛋白质在高pH条件下蛋白质去质子化带负电常用填料有Q Sepharose和DEAE Sepharose凝胶过滤层析4000Sephadex G-25分离范围1-5kDa，适用于脱盐和小分子去除30000Sephadex G-75分离范围3-80kDa，常用于蛋白质初步分离200000Sephacryl S-200分离范围5-250kDa，高分辨率蛋白质分离600000Sepharose6B分离范围10-4000kDa，适用于大分子复合物凝胶过滤层析基于分子筛分效应，大分子无法进入凝胶孔隙而首先洗脱，小分子深入孔隙内部而延迟洗脱这种方法温和无损，不需要有机溶剂，特别适用于生物活性分子的分离填料的选择应使目标分子的分子量位于分离范围的中央区域，以获得最佳分辨率吸附亲和层析/配体结合洗涤去杂目标蛋白与固定化配体形成特异性结合用结合缓冲液洗涤柱子，去除非特异性复合物His标签蛋白与镍离子、抗体结合的杂质蛋白洗涤条件要足够严格与蛋白A等都是经典的亲和对结合过以去除杂质，但不能破坏目标蛋白与配程高度特异，可以从复杂混合物中一步体的结合通常需要多次洗涤直到洗脱纯化目标蛋白液中无蛋白检出竞争洗脱柱子再生通过改变缓冲液条件破坏蛋白质与配体用再生缓冲液清洗柱子，去除残留的蛋的相互作用His标签蛋白用咪唑竞争白质和杂质，为下次使用做准备适当洗脱，抗体用低pH洗脱洗脱条件需要的柱子保养可以延长使用寿命并维持分在保持蛋白活性和获得高纯度之间找到离性能平衡高效液相色谱（）HPLC高压泵系统高效分离柱多元检测器提供稳定的高压流动相，压填料颗粒小（

1.7-5μm），紫外检测器监测280nm蛋力可达400bar以上双泵柱效高，分离能力强C18白质吸收，荧光检测器提高系统可以进行梯度洗脱，提反相柱适用于疏水性分子，检测灵敏度，质谱检测器进高分离分辨率流速精确控离子交换柱用于电荷分离，行分子量确认和结构分析制在

0.1-10mL/min范围尺寸排阻柱按分子大小分内离数据处理自动化数据采集和处理系统，实时监控分离过程，自动进行峰识别、积分和纯度计算可以建立数据库进行样品比对和质量控制气相色谱（）与生物大分子GC适用范围限制GC要求样品具有挥发性，大多数生物大分子分子量大、极性强，不能直接分析主要用于分析生物大分子的降解产物或小分子代谢物分析前需要化学衍生化处理衍生化预处理通过化学修饰增加分子的挥发性和热稳定性硅烷化试剂如BSTFA可以修饰羟基和氨基，提高糖类和氨基酸的挥发性衍生化条件需要优化以获得完全和重现性好的反应糖类分析实例多糖经酸水解产生单糖，再经乙酰化或硅烷化处理后进行GC分析可以定量分析葡萄糖、果糖、蔗糖等组分，建立糖谱指纹图谱用于食品质量控制脂类组分分析脂肪酸甲酯化后适合GC分析，可以确定脂肪酸的碳链长度和不饱和度与质谱联用（GC-MS）可以进行结构鉴定，广泛用于食品和生物膜脂质分析毛细管电泳电泳分离机理微量样品优势生物大分子应用在高电场强度（200-500V/cm）作用进样体积仅需nL级别，适合珍贵样品特别适用于蛋白质、多肽、DNA片段下，带电分子按照电荷密度差异进行分析检测限可达10^-18mol水平，的高分辨分析可以检测蛋白质的微分离毛细管内径通常为25-100比HPLC高2-3个数量级高电场强度异构体、磷酸化修饰等微小差异在μm，长度20-100cm电渗流提供额提供极高的分离效率，理论塔板数可基因分析、蛋白质组学和药物分析中外的传输机制，影响分离选择性和分达百万级有重要应用析时间电泳分离技术原理等电聚焦技术SDS-PAGE十二烷基硫酸钠（SDS）是一种强阴离子去垢剂，能够破坏蛋白利用pH梯度将蛋白质分离到其等电点位置载体两性电解质在质的非共价键，使蛋白质完全变性并结合大量SDS分子结合电场作用下形成稳定的pH梯度，蛋白质在电场驱动下迁移直到SDS后的蛋白质带有均匀的负电荷密度，在聚丙烯酰胺凝胶中的到达净电荷为零的位置迁移速度仅取决于分子量大小分辨率极高，可以分离等电点相差

0.01pH单位的蛋白质常用凝胶浓度影响分离范围，8-12%适合中等分子量蛋白质，15-pH范围为3-10，也可以选择窄范围pH梯度进一步提高分辨率20%适合小分子肽段梯度凝胶可以扩大分离范围，在同一块凝结合SDS-PAGE形成二维电泳，是蛋白质组分析的经典技术胶上分离不同大小的蛋白质等电聚焦技术梯度建立pH载体两性电解质在电场作用下按pKa值排列形成线性pH梯度蛋白质聚焦2蛋白质迁移到等电点位置，净电荷为零时停止移动高分辨检测可分离等电点差异极小的蛋白质异构体和修饰形式等电聚焦是基于蛋白质等电点差异的高分辨分离技术在稳定的pH梯度中，蛋白质会自动聚焦到其等电点位置，形成极窄的蛋白质带这种自聚焦效应使得即使初始样品分布很宽，最终也能获得高度集中的蛋白质带技术特别适用于分离等电点相近的蛋白质同工酶、翻译后修饰产物等实验条件需要严格控制，包括脱盐处理、尿素浓度和聚焦时间优化二维凝胶电泳第一维等电聚焦第二维SDS-PAGE蛋白质按等电点分离按分子量进一步分离使用固相化pH梯度胶条，pH范围3-10或窄胶条经平衡处理后转移至SDS聚丙烯酰胺凝范围梯度，聚焦时间12-16小时胶，垂直电泳分离不同分子量蛋白质比较分析蛋白质图谱不同样品间蛋白表达差异形成二维蛋白质分布图通过图像分析软件进行斑点匹配和定量比每个蛋白质斑点对应唯一的等电点和分子量较，识别差异表达蛋白质坐标，可同时分离数千个蛋白质萃取分离法水相组成含有目标生物大分子的水溶液，通常需要调节pH值和离子强度亲水性蛋白质主要分布在水相中，疏水性组分倾向于进入有机相有机溶剂选择常用溶剂包括氯仿、正丁醇、乙酸乙酯等溶剂的极性、密度和生物相容性是选择的关键因素氯仿适合脂类提取，正丁醇用于蛋白质分离分配系数优化通过调节pH、盐浓度和温度改变目标分子在两相间的分配比例分配系数越大，萃取效率越高多级萃取可以提高纯化倍数安全与环保有机溶剂具有毒性和易燃性，需要在通风橱中操作废液需要分类收集和专业处理正在发展绿色萃取技术，如离子液体和超临界流体萃取组合分离纯化策略捕获步骤快速从大体积粗提液中富集目标分子，常用离子交换或亲和层析，处理能力强中间纯化去除主要杂质，提高纯度至90%以上，可使用疏水作用层析或第二次离子交换精制步骤最终抛光获得高纯度产品，凝胶过滤去除聚合体，反相HPLC除去微量杂质成功的纯化策略需要平衡纯度、收率和成本三个因素三步策略是工业化生产的标准模式第一步快速浓缩和初步纯化，第二步大幅提高纯度，第三步获得最终产品规格每步之间需要进行缓冲液调节和样品预处理工艺开发过程中要建立中间控制点，监测关键质量属性规模放大时需要考虑设备限制和经济性，优化操作参数以实现稳定的工业化生产浅谈蛋白质纯化案例细胞培养与收获重组CHO细胞表达单克隆抗体，培养7-14天达到最高产量细胞培养上清含有目标抗体和各种杂质蛋白，需要先澄清去除细胞碎片离心条件通常为3000×g离心30分钟，然后过

0.22μm滤膜除菌蛋白亲和捕获A蛋白A对抗体Fc段具有高特异性结合能力，是抗体纯化的金标准上样时使用中性PBS缓冲液，结合容量可达40-50mg抗体/mL填料洗涤用高盐PBS去除非特异结合蛋白，然后用pH

3.5的甘氨酸缓冲液洗脱抗体中间纯化优化洗脱液立即用Tris缓冲液中和至生理pH，防止抗体在酸性条件下聚集通过阳离子交换层析进一步去除宿主细胞蛋白和DNA污染物洗脱采用盐梯度，目标抗体在特定电导率下洗脱核酸（）分离分析DNA/RNA细胞裂解策略琼脂糖凝胶分析DNA提取通常使用SDS裂解液破坏细胞膜和核膜，释放基因组琼脂糖凝胶浓度根据DNA片段大小选择，

0.7%适合大片段DNA裂解液含有EDTA螯合金属离子，抑制DNase活性蛋白DNA，2%适合小片段PCR产物电泳缓冲液通常使用TAE或酶K在65°C消化蛋白质，彻底去除与DNA结合的组蛋白和非组TBE，电压控制在5-10V/cm避免过热蛋白溴化乙啶或SYBR染料结合DNA发出荧光，紫外透射仪下观察条RNA提取需要更严格的条件防止RNA酶降解使用胍盐变性剂带分子量标准品帮助确定DNA片段大小，条带亮度反映DNA如胍异硫氰酸盐立即灭活RNase操作过程中所有器具需DEPC浓度凝胶成像系统可以定量分析DNA纯度和完整性处理，工作环境保持无RNA酶污染多糖和脂类的分离多糖醇沉淀薄层色谱显色检测TLC向多糖水溶液中缓慢加入2-3脂类样品溶于氯仿-甲醇混合溶脂类斑点用碘蒸气熏染或喷洒倍体积的无水乙醇，多糖因溶剂中，点样于硅胶板上流动显色剂显现磷脂用钼酸铵试解度骤降而析出沉淀过程需相通常为氯仿甲醇水剂显蓝色，胆固醇用硫酸-乙醇要在低温下进行，避免多糖降=65254的混合系统不显紫红色不同显色剂具有一解析出的多糖呈絮状或纤维同脂类根据极性差异在硅胶板定选择性，可以初步鉴定脂类状，可用离心或过滤收集上呈现不同的Rf值类型提取纯化确定目标斑点位置后，刮取相应区域的硅胶，用有机溶剂提取目标化合物多次提取确保完全回收，然后浓缩溶剂获得纯化的脂类化合物分离过程中的检测与定量紫外分光光度法蛋白质在280nm处有特征吸收峰，主要来自色氨酸和酪氨酸残基A260/A280比值用于评估核酸污染程度，纯蛋白质该比值应小于

0.6该方法快速简便，但受到核酸和其他芳香族化合物干扰比色定量方法考马斯亮蓝染料结合蛋白质后颜色由棕色变为蓝色，在595nm测定吸光度该方法灵敏度高，不受核酸干扰，但不同蛋白质的响应系数有差异标准曲线使用牛血清白蛋白建立蛋白定量BCA蛋白质中的肽键在碱性条件下将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA形成紫色络合物反应在37°C进行30分钟，562nm测定吸光度该方法重现性好，受氨基酸组成影响较小荧光定量技术荧光染料如FITC、罗丹明等可标记蛋白质进行定量检测荧光偏振技术用于检测蛋白质-配体相互作用荧光方法灵敏度极高，可检测ng级样品，适用于微量分析分子量分析方法质谱分析精确度±

0.01%，可检测修饰SDS-PAGE精确度±5%，操作简便凝胶过滤测定天然分子量，精确度±10%光散射法动态光散射测定溶液中分子量分子量测定是蛋白质表征的基本要求MALDI-TOF质谱提供最高精确度，可以检测到单个氨基酸的差异和翻译后修饰SDS-PAGE虽然精确度较低，但操作简便，是实验室常规检测方法凝胶过滤层析能够测定蛋白质在天然状态下的分子量，反映蛋白质的寡聚状态多种方法结合使用可以全面了解蛋白质的分子量特征和聚集状态分析纯度与活性评估电泳纯度分析生物活性检测SDS-PAGE是评估蛋白质纯度的酶活性测定是功能性蛋白质质量金标准方法纯蛋白质应显示单控制的关键指标比活性（单位一条带，杂质蛋白以额外条带形蛋白质的酶活性）反映蛋白质的式出现条带密度扫描可以定量功能完整性抗体的抗原结合能计算纯度百分比银染比考马斯力通过ELISA或表面等离子共振亮蓝染色灵敏度高100倍，能检技术检测细胞生长因子的活性测ng级杂质蛋白通过细胞增殖实验评估杂质控制标准宿主细胞蛋白残留量应低于100ppm，DNA残留量小于10pg/mg蛋白质内毒素含量对于注射用蛋白质尤其重要，应低于

0.25EU/mg重金属、有机溶剂等工艺相关杂质也需要严格控制在安全限度内仪器自动化与分离分析自动液体工作站配备多通道移液器和机械臂，可以自动完成移液、混合、温育等操作8或16通道移液头同时处理多个样品，大幅提高通量软件控制确保操作的重现性和精确性智能控制系统集成的软件平台控制整个分离过程，实时监测pH、电导率、压力等参数自动进行梯度优化和峰收集，减少人工干预数据自动记录和分析，符合GMP规范要求高通量筛选96孔或384孔板格式进行并行分离实验，快速筛选最佳分离条件微型化层析柱减少样品和试剂消耗机器学习算法优化分离参数，预测最佳工艺条件数据集成管理LIMS系统管理样品信息和实验数据，实现数据的可追溯性云端数据存储和分析，支持远程监控和协作人工智能辅助故障诊断和预防性维护生物大分子样品保存温度控制稳定剂添加短期保存4°C，长期保存-20°C或-80°C甘油、蔗糖等低温保护剂酶类蛋白质在4°C下可保存数天，-20°C保存甘油浓度10-50%防止冰晶形成，蔗糖数月抗体类蛋白质相对稳定，4°C可保存stabilizes蛋白质构象BSA作为载体蛋白防数周止稀溶液中蛋白质吸附损失包装与标记冻干技术避光、密封、惰性气体保护升华脱水获得稳定粉末紫外光会引起蛋白质交联和氧化，需要棕色冻干前添加赋形剂如甘露醇、海藻糖保护蛋瓶或铝箔包装充入氮气或氩气置换空气，白质结构冻干产品在室温下稳定保存数防止氧化标签注明保存条件和有效期年，复溶后活性基本不变分离分析的数据管理原始记录保存实验条件、操作步骤、观察结果需要详细记录在实验记录本中电子数据应包括色谱图、电泳图像、质谱数据等原始文件记录必须真实、完整、及时，不得随意修改或销毁数据可追溯性建立从原材料到最终产品的完整数据链每个样品分配唯一编号，记录处理历史和检测结果审计轨迹记录所有数据修改操作，包括修改人、时间和原因备份与安全重要数据采用多重备份策略，本地和云端同时保存访问权限控制确保数据安全，防止未授权修改定期进行数据完整性检查，及时发现和修复损坏文件法规合规性数据管理符合GLP、GMP等质量标准要求电子签名确保数据的法律效力保存期限按照法规要求执行，通常为10-30年监管机构检查时能够快速提供相关数据分离过程的常见难题蛋白质聚集问题高浓度蛋白质容易发生聚集形成不溶性沉淀，导致回收率下降聚集通常由疏水相互作用、静电作用或二硫键形成引起解决策略包括降低蛋白质浓度、调节pH和离子强度、添加变性剂如尿素或盐酸胍、使用还原剂断裂二硫键蛋白质降解控制蛋白酶污染是导致目标蛋白降解的主要原因预防措施包括在缓冲液中添加蛋白酶抑制剂如PMSF、EDTA、蛋白酶抑制剂混合物低温操作减缓酶反应速度，快速处理缩短暴露时间建立中间控制点监测蛋白质完整性文献对比优化查阅相关文献了解类似蛋白质的分离经验，借鉴成功的工艺条件对比不同研究组的方法差异，分析各自的优缺点结合自己的实验条件和设备限制，设计改进的分离方案建立问题解决的知识库，积累故障排除经验。