《细胞观察实验室演示：血涂片制作与分析》课件

细胞观察实验室演示血涂片制作与分析课程概述12血涂片的临床意义与应用制作方法与质量标准深入了解血涂片在临床诊断中的重要地位，掌握其在血液系学习标准化的血涂片制作流程，掌握质量评价标准和常见问统疾病筛查、形态学分析和疾病监测中的关键作用题的解决方法，确保涂片质量达到诊断要求3染色技术与原理显微镜检查与细胞识别理解瑞吉染色的原理机制，掌握标准染色程序和质量控制要点，学会评价染色效果和故障排除血涂片的临床意义血液系统疾病筛查的基础检查血涂片检查是血液系统疾病诊断的第一道防线，能够早期发现贫血、白血病、血小板疾病等多种血液病变通过形态学观察，可以获得自动血液分析仪无法提供的重要诊断信息形态学分析的重要依据细胞形态学分析是血液病诊断的金标准，血涂片提供了观察细胞大小、形态、染色特征和内部结构的直接手段这些形态学特征往往具有特异性诊断价值，是确定疾病类型和严重程度的关键依据白细胞分类计数的标准方法人工白细胞分类计数仍然是WHO推荐的标准方法，特别在识别异常细胞、幼稚细胞和进行精确分类方面具有不可替代的作用标准的分类计数为临床治疗决策提供准确的数据支持血涂片在诊断中的应用贫血类型的鉴别诊断白血病的初步筛查血小板数量与形态评估通过观察红细胞的大小、形态和染色特血涂片检查能够发现循环血液中的原始血涂片能够准确评估血小板的数量和形征，可以有效区分缺铁性贫血、巨幼细细胞和异常细胞，是白血病初步筛查的态，识别巨大血小板、血小板聚集等异胞性贫血、溶血性贫血等不同类型的贫重要手段特殊的形态学标志如Auer小常现象，对血小板疾病的诊断具有重要血形态学特征常常是确定贫血病因的体、异常颗粒等具有重要的诊断价值意义同时可以排除假性血小板减少等重要线索干扰因素•原始细胞比例评估•缺铁性贫血低色素小细胞•血小板计数验证•特异性形态学标志识别•巨幼细胞性贫血高色素大细胞•形态异常识别•细胞系列的判断•溶血性贫血破碎红细胞增多•功能状态评估血涂片制作的重要性35%85%误诊率准确性提升不良涂片导致的误诊率可达35%，强调标标准制作流程可将诊断准确性提高至85%准制作的重要性以上3-4cm理想长度标准血涂片的理想长度范围血涂片的制作质量直接影响细胞形态的观察和诊断的准确性不规范的制作过程会导致细胞变形、分布不均、染色异常等问题，严重影响诊断结果的可靠性研究表明，不良涂片是导致形态学误诊的主要原因之一，因此掌握标准的制作技术至关重要血液采集方法静脉血采集使用EDTA抗凝管采集静脉血，是最常用和标准的采血方法适用于大多数常规血液学检查，样本量充足，结果稳定可靠采集后需要充分混匀，避免凝血毛细血管血液采集适用于婴幼儿、老年患者或静脉采血困难的情况采集部位通常选择指尖或足跟，使用自动采血针可以减少患者痛苦并确保采血深度一致时限要求血液采集后应在4小时内完成涂片制作，最好在2小时内完成时间过长会导致细胞形态发生变化，影响诊断结果的准确性静脉血采集步骤患者识别与资料确认严格核实患者身份信息，确认采血医嘱和检验申请单信息一致向患者说明采血目的和注意事项，获得配合检查患者有无出血倾向和特殊用药史采血管选择与采血操作选择K2EDTA抗凝管，检查管身完整性和有效期按照标准操作程序进行静脉穿刺，确保采血量达到标准要求（通常2-4ml），避免过度负压导致溶血样本处理与质量控制采血完成后立即轻柔颠倒混匀8-10次，确保血液与抗凝剂充分混合避免剧烈震荡导致溶血标记采血时间，及时送检或适当保存毛细血管血液采集适用情况操作要点毛细血管采血主要适用于婴幼选择指尖外侧或足跟部位，彻底儿、老年患者、血管条件差的患消毒后使用标准采血针穿刺穿者以及急诊快速检查等情况这刺深度控制在2-3mm，角度垂种方法创伤小，操作简便，患者直于皮肤表面弃去首滴血液，接受度高，特别适合儿科和老年收集后续流出的血液制作涂片科的临床应用质量控制毛细血管血液容易受到组织液稀释和局部代谢产物的影响，因此需要确保血液流出顺畅，避免过度挤压同时要注意采血环境的清洁，防止污染影响检查结果血涂片制作所需材料载玻片推片器选择优质的载玻片，表面光滑无划痕，建议可使用另一片载玻片或专用推片器推片器使用磨砂边载玻片便于标记使用前需要彻边缘应光滑无缺损，宽度略小于载玻片宽底清洁，确保无油脂和灰尘污染度，确保推片过程中接触均匀辅助材料血液样本酒精棉球用于清洁，铅笔或标记笔用于标记新鲜的EDTA抗凝血或毛细血管血液血液患者信息，干燥架用于涂片晾干所有材料应无凝块，混匀充分室温下放置时间不宜应保持清洁干燥，避免交叉污染过长，以免细胞形态发生变化血涂片制作原理毛细管作用力血液在推片器与载玻片间形成的楔形空间中，受毛细管作用力影响向前扩散推片角度控制30-45度的推片角度是关键，角度过大涂片偏厚，角度过小涂片偏薄速度与均匀性推片速度要均匀稳定，太快会造成细胞变形，太慢会影响涂片质量血液量控制血液量影响涂片厚度，理想的血液滴大小为2-3mm直径血涂片制作步骤-1患者信息标记在磨砂边用铅笔标记患者姓名、ID和日期血液滴放置距离磨砂边约1cm处放置血液滴血液量控制血液滴直径控制在2-3mm载玻片清洁确保表面无油脂、灰尘和划痕血涂片制作步骤-2推片器定位血液接触扩散将推片器以30-45度角度放置在载玻片轻轻回拉推片器接触血液滴，等待血液上，准备接触血液滴角度的准确控制沿推片器边缘自然扩散形成连续的血液是制作高质量涂片的关键因素膜不要急于推动立即风干稳定向前推动完成推片后立即将涂片置于水平位置自以均匀稳定的速度向前推动推片器，整然风干避免用口吹气或甩动，防止细个过程保持角度恒定推动速度过快或胞变形和污染过慢都会影响涂片质量血涂片质量评价标准评价指标标准要求检查要点涂片长度3-4cm从血液滴起始点到涂片尾端的距离厚薄过渡均匀渐变从厚端到薄端应呈现平滑的厚度梯度边缘形态规则羽毛状涂片两侧边缘应光滑，尾端呈羽毛状读取区厚度单层红细胞在10x物镜下红细胞应排列成单层表面质量无缺陷无条纹、气泡、空洞等缺陷常见的涂片问题与原因涂片过厚主要原因包括血液量过多、推片角度过大（超过45度）、推片速度过慢过厚的涂片会导致细胞重叠，无法准确观察细胞形态和进行有效计数涂片过薄血液量不足、推片角度过小（小于30度）、推片速度过快是主要原因过薄的涂片细胞密度过低，不利于细胞分类计数和异常细胞的发现条纹和空洞载玻片或推片器不洁净、推片速度不均匀、血液部分凝固等因素会造成条纹空洞通常由推片时间延迟、血液开始凝固引起边缘不规则推片速度过快、推片器边缘有缺损、血液粘度异常等会导致锯齿状边缘规则的边缘对于涂片质量评价和细胞观察都很重要不同血涂片质量的比较理想涂片特征过厚涂片表现过薄涂片表现红细胞排列成单层，分布均匀，细胞形态红细胞重叠严重，难以区分单个细胞白细胞密度过低，计数困难细胞可能出现清晰完整细胞间有适当间隙，便于观察细胞和血小板被红细胞掩盖，影响分类计变形，特别是红细胞可能呈现棘状变形和计数染色均匀，背景清洁，无人工制数染色偏深，细胞形态观察困难异常细胞发现率降低，影响诊断敏感性品干扰血涂片染色的意义增强细胞结构可见性未染色的血细胞在显微镜下几乎透明，难以观察染色后细胞核、细胞质和细胞器结构清晰可见，为形态学分析提供基础区分不同细胞类型不同类型的血细胞对染料的亲和性不同，染色后呈现特征性的颜色模式这种差异性染色是细胞分类识别的重要依据显示细胞内结构特征染色能够显示细胞核的形态、核质比例、胞质颗粒等细微结构，这些特征对于细胞分类和疾病诊断具有重要价值辅助病理状态判断异常细胞的染色特征常常反映病理状态如毒性颗粒、Auer小体等特殊结构只有在适当染色后才能清晰显示常用染色方法对比染色方法主要特点适用范围染色时间瑞氏染色经典方法，效常规血液学检15-20分钟果稳定查姬姆萨染色核染色清晰寄生虫检查30-45分钟瑞-姬染色综合优势临床常规应用8-15分钟快速染色操作简便，时急诊检查30-60秒间短特殊染色特异性强特殊诊断需求变化较大瑞吉染色原理酸碱性染料复合作用瑞吉染色液含有酸性和碱性染料，通过与细胞不同成分的结合产生特征性颜色pH值影响染色效果缓冲液的pH值控制在

6.4-

6.8，确保染料与细胞成分的最佳结合时间温度控制染色时间和温度影响染料渗透和结合程度，需要严格控制瑞吉染色步骤1涂片干燥确认确保血涂片完全干燥，避免残余水分影响染色效果通常需要自然晾干15-30分钟2染色液覆盖将瑞吉染色液完全覆盖涂片1-3分钟染色液用量要充足，确保涂片完全浸润3缓冲液混合按1:1比例加入缓冲液，轻轻吹气混匀至出现金属光泽，继续染色5-10分钟4水洗干燥用蒸馏水轻柔冲洗，去除多余染料立式晾干，避免水渍影响观察染色质量评价标准红细胞染色标准白细胞染色标准血小板染色标准正常红细胞应呈现浅红色或粉红色，颜中性粒细胞胞质呈浅紫色，核呈深紫血小板胞质呈淡蓝色，颗粒呈紫红色色均匀一致中央淡染区清晰可见，约色，颗粒清晰可见嗜酸性粒细胞的颗大小不一但形态规则聚集的血小板应占细胞直径的1/3过深或过浅的染色都粒应呈桔红色，嗜碱性粒细胞颗粒呈深能清晰区分个体染色良好的血小板便提示染色过程存在问题蓝色淋巴细胞胞质呈蓝色，核呈深紫于准确计数和形态评估色染色常见问题与解决方案染色过深主要表现为细胞颜色过浓，细节模糊不清解决方法包括缩短染色时间、适当稀释染色液、检查缓冲液pH值染色过深会掩盖细胞的精细结构，影响形态学观察和诊断准确性染色过浅细胞着色不足，对比度差，难以区分细胞类型需要延长染色时间、检查染色液浓度和有效期、确保涂片完全干燥染色过浅会降低诊断的敏感性和准确性沉淀和背景染色染色液沉淀会形成颗粒状沉积物，背景染色会影响观察清晰度解决方法包括过滤染色液、确保涂片充分干燥、控制水洗力度、检查染色液pH值细胞变形不当的固定和染色过程会导致细胞变形需要控制干燥时间、避免加热干燥、选择合适的染色温度细胞变形会严重影响形态学诊断的可靠性显微镜检查流程低倍镜初步检查（10x）首先在低倍镜下观察涂片整体质量，评估厚薄分布、染色均匀性和有无明显缺陷选择合适的观察区域，通常是厚薄过渡区域检查是否有明显的细胞聚集或分布异常中倍镜区域选择（40x）在40倍物镜下进一步确认观察区域的质量，寻找红细胞呈单层分布、细胞间有适当间隙的理想区域避开涂片边缘和过厚过薄的区域，确保选择的区域具有代表性油镜详细观察（100x）使用100倍油镜进行细胞形态的详细观察和分类计数采用系统的扫查方法，确保观察范围的随机性和代表性记录各种细胞的数量和形态特征涂片最佳观察区域选择正确选择观察区域是准确诊断的前提读片区应该位于涂片的中部偏后，红细胞排列成单层，细胞间有适当间隙避开边缘效应区域，因为边缘区域细胞分布不均匀，大细胞如单核细胞和血小板容易聚集系统的Z字形扫查路径确保观察的随机性和代表性，避免选择性偏倚白细胞分类计数淋巴细胞中性粒细胞正常范围20-40%，核圆形或椭圆形，胞质正常范围50-70%，核呈多叶状，胞质含细少呈蓝色小的中性颗粒单核细胞正常范围3-8%，核呈肾形或马蹄形，胞质丰富呈灰蓝色嗜碱性粒细胞嗜酸性粒细胞正常范围0-1%，胞质含深蓝紫色的粗大颗粒正常范围1-4%，胞质含大而均匀的橘红色颗粒红细胞形态学评估大小异常形态异常大红细胞症（直径

8.5μm）常靶形红细胞呈现靶状外观，见于见于维生素B12或叶酸缺乏小地中海贫血和血红蛋白病泪滴红细胞症（直径

6.5μm）多见形红细胞提示骨髓纤维化或髓外于缺铁性贫血或地中海贫血大造血镰刀形红细胞是镰状细胞小不均（红细胞大小不等症）提病的特征性表现示造血异常色素和包涵体异常低色素红细胞中央淡染区增大，见于缺铁性贫血多色性红细胞呈蓝灰色，提示幼稚红细胞增多霍威尔-约利小体、疟原虫等包涵体具有特殊的诊断意义血小板评估方法数量估算形态观察分布评估异常识别每个油镜视野正常应见到15-正常血小板直径2-4μm，呈观察血小板是否有聚集、附识别巨大血小板、血小板碎25个血小板，据此可估算血圆形或椭圆形，胞质淡蓝色着现象，排除假性血小板减片等异常形态，评估功能状小板数量是否正常含紫红色颗粒少的可能态正常血细胞图谱中性粒细胞包括杆状核和分叶核两种形态杆状核中性粒细胞核呈马蹄形或S形，分叶核中性粒细胞核有2-5个叶片胞质呈淡紫色，含有细小的中性颗粒，是机体抗感染的主要细胞淋巴细胞分为大淋巴细胞和小淋巴细胞小淋巴细胞核圆形，染色质致密，胞质少呈蓝色大淋巴细胞胞质相对丰富，可见少量颗粒是机体免疫应答的重要细胞单核细胞是外周血中最大的血细胞，核呈肾形、马蹄形或分叶状，染色质疏松胞质丰富呈灰蓝色，可含有空泡和细颗粒具有强大的吞噬功能，是单核-巨噬细胞系统的重要组成正常红细胞形态特征1大小标准正常红细胞直径为7-8μm，与小淋巴细胞核直径相近这个大小标准是评估红细胞是否正常的重要指标，也是识别大红细胞症和小红细胞症的依据2形态特征呈双凹圆盘状，这种形态增加了表面积与体积的比值，有利于气体交换在血涂片中观察到的是侧面投影，呈现圆形轮廓3染色特点中央淡染区约占直径的1/3，周边染色较深呈粉红色这种染色模式反映了红细胞的双凹形态和血红蛋白的分布4结构特性成熟红细胞无细胞核和细胞器，细胞边缘光滑规则染色均匀一致，无颗粒和包涵体这些特征是正常红细胞的重要识别标志红细胞异常形态红细胞形态异常是许多疾病的重要线索大小异常包括大红细胞症和小红细胞症，分别提示不同的病因形态异常如靶形红细胞、泪滴形红细胞、镰刀形红细胞等都有特定的临床意义这些异常形态的识别对于疾病诊断和治疗监测具有重要价值白细胞异常形态有核红细胞正常情况下外周血中不应出现有核红细胞其出现提示骨髓造血亢进、骨髓纤维化或髓外造血根据核的成熟程度可分为早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞，成熟程度越低病理意义越大幼稚粒细胞包括早幼粒、中幼粒、晚幼粒和杆状核细胞正常情况下外周血中幼稚粒细胞比例很低左移现象（幼稚粒细胞增多）常见于感染、白血病或骨髓受刺激状态异常颗粒Auer小体是急性髓系白血病的特征性标志，呈杆状或针状的嗜苯胺蓝颗粒毒性颗粒见于严重感染时的中性粒细胞，颗粒增大增多这些异常颗粒具有重要的诊断价值中毒性变化严重感染时白细胞可出现中毒性变化，包括胞质空泡形成、毒性颗粒、核左移等核分叶过多或核浓缩也是异常表现，提示细胞老化或病理状态血小板异常形态巨大血小板血小板聚集血小板减少直径超过4μm的血小板称为血小板聚集是指血小板相互每个油镜视野血小板少于10巨大血小板，常见于血小板粘附形成团块可能由于采个提示血小板减少需要结破坏增多、巨核细胞异常或血技术不当、抗凝不充分或合临床表现和其他检查结果遗传性血小板疾病巨大血血小板功能异常引起需要判断是否为病理性减少注小板的出现提示血小板生成与血小板减少相鉴别，避免意排除假性血小板减少的干异常或功能缺陷误诊扰因素血小板卫星现象血小板围绕中性粒细胞排列的现象，通常由EDTA依赖性抗体引起这是体外现象，不反映体内真实情况，但会影响血小板计数的准确性常见贫血的血涂片特征贫血类型红细胞大色素特征特殊形态其他特征小缺铁性贫小红细胞低色素靶形红细中央淡染血胞区增大巨幼细胞大红细胞高色素卵圆形红多分叶中性贫血细胞性粒细胞溶血性贫大小不等多色性球形红细网织红细血胞胞增多地中海贫小红细胞低色素靶形红细红细胞形血胞多态多样再生障碍正常大小正常色素形态正常全血细胞性贫血减少缺铁性贫血血涂片特征低色素小细胞靶形红细胞增多红细胞直径小于

6.5μm，中央淡染区明部分红细胞呈现靶状外观，中央有一个显增大，占细胞直径的1/2以上这是缺染色较深的区域这种形态变化是血红铁性贫血最典型的形态学特征，反映血蛋白含量减少、细胞膜相对过多的结红蛋白合成不足果血小板数量正常大小不均显著与其他类型贫血不同，缺铁性贫血时血红细胞大小差异明显，小红细胞与正常小板计数通常正常或轻度增多血小板大小红细胞混合存在这种红细胞大小形态一般无明显异常，这有助于与其他不等症反映了造血过程中铁供应的不稳贫血类型鉴别定巨幼细胞性贫血血涂片特征大卵圆形红细胞典型的巨幼红细胞呈卵圆形，直径超过

8.5μm高色素红细胞红细胞血红蛋白含量增加，染色较深多分叶中性粒细胞中性粒细胞核分叶数超过5个叶片巨型血小板血小板体积明显增大，形态异常红细胞大小严重不均红细胞大小差异极为显著溶血性贫血血涂片特征网织红细胞增多骨髓代偿性造血亢进，释放大量幼稚红细胞入血球形红细胞出现红细胞膜受损失去双凹形态，呈球形红细胞碎片增多3机械性溶血导致红细胞破碎成不规则碎片白血病血涂片特征原始细胞出现Auer小体（急性髓系白血病）外周血中出现大量原始细胞，通常超过20%这些细胞核大、核Auer小体是急性髓系白血病的特质比高、核仁明显原始细胞的征性标志，呈杆状、针状或束出现是白血病诊断的重要依据，状，嗜苯胺蓝染色主要见于需要结合特殊染色和免疫表型进M

1、M2型急性髓系白血病，是一步确认细胞系列髓系来源的确定性证据，具有重要的诊断和分型价值异常淋巴细胞急性淋巴细胞白血病时可见原始淋巴细胞，细胞较小，核染色质细腻均匀，核仁不明显慢性淋巴细胞白血病则以成熟的小淋巴细胞增多为特征，常伴有涂抹细胞（smudge cells）急性髓系白血病血涂片特征原始粒细胞≥20%WHO标准要求外周血或骨髓中原始细胞比例达到20%以上这些原始细胞体积大，核占细胞的大部分，核质比高，是急性白血病诊断的基本标准核染色质细腻原始细胞的核染色质呈细网状或颗粒状，分布均匀，反映DNA处于活跃的转录状态这种特征有助于区分原始细胞和成熟细胞核仁清晰可见原始细胞通常有1-3个清晰的核仁，核仁大而明显，反映蛋白质合成活跃核仁的数目和大小是判断细胞幼稚程度的重要指标Auer小体的诊断意义Auer小体是髓系原始细胞特有的细胞器，由异常的一级颗粒融合形成其出现确定了髓系来源，对急性髓系白血病的诊断具有决定性意义。