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分子生物学专题聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理与操作欢迎参加分子生物学专题课程，本次我们将深入探讨聚丙烯酰胺凝胶电泳（）这一在生物研究中不可或缺的实验技术通过本课程，您将全面了PAGE解的理论基础、操作流程及应用领域PAGE技术凭借其高分辨率和灵活性，成为现代生物学实验室中分离和分析蛋PAGE白质与核酸的标准方法掌握这一技术对于从事分子生物学、生物化学和遗传学研究的科研人员至关重要让我们一起探索这一精妙的分子分离艺术，揭示微观世界的奥秘！课程目标理解的物理化学基础PAGE深入掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的理论基础，包括电场作用下带电分子的迁移原理、凝胶孔径对分子筛分效应的影响以及不同缓冲体系的作用机制掌握实验操作全流程从样品制备、凝胶配制到电泳运行及结果分析，系统掌握实验的每一PAGE个关键步骤，确保能够独立完成高质量的电泳实验解析常见问题与解决方法学习识别电泳过程中可能出现的各种问题，如条带模糊、弯曲或背景杂乱等，并掌握相应的故障排除方法和优化策略结合分子生物学应用案例通过实际案例了解技术在蛋白质组学、基因表达分析和分子克隆等领PAGE域的具体应用，拓展实验技术的应用视野电泳技术概述电泳基本原理电泳技术的应用范围电泳技术是利用分子在电场中因带电性质而产生定向迁移的物理电泳技术是分子生物学中最基础也最强大的分析工具之一，广泛现象，实现不同生物分子的分离与分析当外加电场作用于缓冲应用于核酸和蛋白质的分离与表征在基因组学研究中，电泳用液中的带电分子时，阴离子会向正极（阳极）移动，阳离子则向于片段分离和测序；在蛋白质组学中，则用于蛋白质的分DNA负极（阴极）移动离、纯度检测和分子量测定分子的迁移速率受多种因素影响，包括分子的电荷密度、大小、随着技术的发展，电泳已经从简单的一维分离发展到复杂的二维形状以及电场强度和介质特性这种差异性迁移使得混合物中的分离，大大提高了生物分子分析的分辨率和信息量掌握电泳技不同组分能够被分离开来术对于现代生物学研究至关重要聚丙烯酰胺凝胶电泳简介的定义与特点PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳（，简称Polyacrylamide GelElectrophoresis）是一种利用聚丙烯酰胺形成的凝胶网络作为支持介质的电泳技PAGE术它具有极高的分辨率，可以分离分子量差异小至的生物大分1%子高分辨率机制的高分辨率源于聚丙烯酰胺凝胶形成的均一网状结构，这种结构PAGE能够精确控制孔径大小，从而对不同大小的分子产生筛分效应通过调节丙烯酰胺浓度，可以优化对特定分子量范围的分离效果应用优势与其他电泳技术相比，具有重现性好、分辨率高、操作灵活等优PAGE点特别适用于蛋白质分析和小分子核酸（如、微小等）siRNA RNA的研究在生物医学研究、基因工程和临床诊断等领域有着广泛应用与琼脂糖凝胶电泳对比PAGE特性聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶PAGE适用分子蛋白质和小分子核酸大分子（）DNA
0.1-25kb（）1kb分辨率极高，可分辨分子量差中等，适合区分较大片段差1%异异凝胶性质化学聚合形成，孔径均一物理冷却形成，孔径分布较宽毒性单体有神经毒性，需谨慎操基本无毒，操作安全作制备难度较复杂，需多种试剂精确配简单，仅需加热溶解后冷却比运行时间通常较长，小时相对较短，分钟小时1-330-1选择合适的电泳技术对实验成功至关重要一般而言，当研究蛋白质或需要高分辨率分离小片段核酸时，应选择；而在需要分析大片段或进行快速检测时，琼脂糖凝胶电泳更为适PAGE DNA合两种技术在现代分子生物学实验室中通常都是必备的基础工具凝胶结构基础三维网状结构形成具有特定孔径的分子筛分网络丙烯酰胺单体提供线性聚合基础交联剂BIS连接聚丙烯酰胺链形成网状结构聚丙烯酰胺凝胶的核心是其独特的三维网状结构凝胶可呈柱状或板状，由丙烯酰胺单体聚合形成的线性长链通过交联剂甲叉双丙烯酰胺（亚甲基双丙烯酰胺，简称）连接而成这种特殊结构形成了具有均一孔径的分子筛网，能够基于分子大小进行精确分离N,N-BIS丙烯酰胺是一种水溶性单体，能够在自由基作用下快速聚合而作为交联剂，每个分子含有两个丙烯酰胺基团，可以同时与两条聚丙烯酰胺BIS链结合，从而在三维空间中形成网状结构正是这种精确可控的网状结构使得具有优异的分辨率和重现性PAGE聚合反应反应物准备自由基生成丙烯酰胺单体与按特定比例混合，为聚BIS分解产生自由基，启动整个聚合反应APS合反应做准备网络形成链式反应将聚丙烯酰胺链交联，最终形成三维网催化加速反应，丙烯酰胺单体逐步BIS TEMED状结构聚合成长链聚丙烯酰胺凝胶的形成是一个自由基引发的加成聚合反应过硫酸铵作为引发剂，分解产生自由基；四甲基乙二胺作为催化剂，加APS TEMED速自由基的形成和聚合反应的进行丙烯酰胺与的比例（通常为至）是决定凝胶孔径大小的关键因素BIS29:
137.5:1聚合反应通常在室温下进行，随着反应的进行，溶液黏度逐渐增加，最终形成半透明的凝胶整个过程约需分钟完成，但受温度、试剂纯度20-30和浓度等因素影响掌握聚合反应的调控是成功制备高质量凝胶的关键PAGE凝胶分辨率调控使用梯度凝胶调整交联度C%梯度凝胶从上到下丙烯酰胺浓度逐渐增加，能调节丙烯酰胺总浓度T%代表在总单体中的百分比，控制网络的够在单次电泳中分离广泛分子量范围的蛋白C%BIS表示丙烯酰胺和的总质量百分比，决定交联程度通常保持在之间，过高会质常见的梯度如或，既能分T%BIS C%2-5%4-20%8-16%凝胶的致密程度高浓度适合分离导致凝胶脆性增加，过低则使凝胶机械强度不离大分子又能保留小分子，大大提高了电泳的15-20%小分子蛋白；中等浓度足增加交联度会使网络更加紧密，但过高的应用灵活性梯度凝胶制备需要特殊的梯度混5-20kDa10-适合中等大小蛋白；低浓交联度反而可能形成不均匀结构，降低分辨合器，但商业预制胶也广泛可得12%20-100kDa度适合大分子蛋白提高率4-8%100kDa会减小网孔尺寸，增强对小分子的分辨能T%力分类PAGE连续系统Single-buffer连续系统使用相同的缓冲液和相同值贯穿整个凝胶和电极缓冲液这种PAGE pH系统制备简单，操作方便，但分辨率相对较低主要用于分离小分子量、DNA或某些特定蛋白质，如组蛋白RNA连续系统中，样品直接在单一凝胶中分离，没有样品富集过程，因此对样品体积和浓度要求较高对于常规分析或不需要特别高分辨率的应用，连续系统仍是一个经济高效的选择不连续系统Discontinuous不连续系统包含两个不同浓度和的凝胶层上层为疏松的浓缩胶PAGE pH（），下层为致密的分离胶（）这种系统利用离子stacking gelresolving gel迁移速率差异在样品进入分离胶前将其压缩成极薄的区带这种设计显著提高了分辨率，是目前最广泛使用的系统通常PAGE SDS-PAGE采用不连续系统，能够根据分子量精确分离复杂蛋白混合物虽然制备稍复杂，但分离效果的提升使其成为标准选择不连续凝胶系统详解浓缩胶层低浓度凝胶，大孔径，4-5%pH
6.8胶层交界面离子堆积区，样品被压缩成超薄层分离胶层高浓度凝胶，小孔径，8-20%pH
8.8不连续凝胶系统的核心优势在于其独特的离子堆积效应（）浓缩胶采用低浓度（通常为）的丙烯酰胺形成较大孔径，约为isotachophoresis4-5%pH，在此条件下甘氨酸呈现低迁移率当电场加入后，氯离子（前导离子）迁移最快，甘氨酸（终止离子）迁移最慢，样品蛋白质则处于两者之间，形
6.8成三明治结构当样品到达分离胶（）时，甘氨酸离子化程度提高，迁移速率突然增加，超过蛋白质这一变化使得之前被压缩的蛋白质样品突然释放，形成pH
8.8极薄的起始带，随后在分离胶中根据大小进行高效分离这种精妙的设计使不连续系统能够处理较大体积和浓度差异较大的样品，同时保持极高的分辨率电泳迁移的物理原理影响迁移的关键因素聚丙烯酰胺凝胶的筛分效应在电泳过程中，分子的迁移速率（）受多种因素的复杂影响聚丙烯酰胺凝胶的独特之处在于其均一的网状结构形成了分子筛μ首先是分子的电荷密度（），带电荷越多、分子量越小的网当分子通过这个网络时，大小成为决定迁移能力的关键因q/m分子迁移越快其次是分子形状，紧凑球状分子比舒展的线性分素小分子可以相对自由地穿过网孔，而大分子则受到阻碍，移子通过凝胶网络更容易动速度减慢外部因素如电场强度（）、温度和缓冲液组成也显著影响迁移在典型的中，迁移距离与分子量的对数成反比通过调整E PAGE速率电场强度越高，分子迁移越快，但过高的电压会导致焦耳凝胶浓度，可以优化特定大小范围分子的分离效果这种基于大热增加，影响分离效果理想情况下，迁移速率与电场强度成正小的分离机制，结合电荷因素，使成为生物大分子分离的PAGE比强大工具实际应用中，通常会构建标准曲线，通过已知分子量v=μE的标准品推算未知样品的分子量分离机理蛋白质1原生态蛋白形状各异，带电不均，迁移复杂处理SDS均匀包裹，掩蔽原有电荷热变性结构解折叠，形成线性分子按分子量分离大小成为唯一决定迁移速率的因素原生态蛋白质分子具有复杂的三级结构和不均匀的电荷分布，这使得它们在电泳中的行为难以预测为了实现标准化分离，通常采用技术十二烷基硫酸钠是一种强阴离子去污剂，能够均匀SDS-PAGE SDS地结合蛋白质（约每个氨基酸残基结合个分子），使蛋白质呈现一致的负电荷密度21SDS经处理后，蛋白质的原有结构和电荷被完全掩蔽，迁移速率主要取决于分子量加热变性过程进一步SDS确保蛋白质完全展开成线性结构在这种条件下，大多数蛋白质的迁移距离与其分子量对数呈线性关系，从而可以通过与标准品比较来确定未知蛋白的分子量这种方法使蛋白质分离变得高度可预测和可重复，是蛋白质分析的标准方法基本原理SDS-PAGE
1.4g~1:1结合量电荷质量比SDS/每克蛋白质结合的克数，使蛋白带均一负电处理后蛋白质的电荷与质量比例接近恒定SDS SDS
8.0缓冲液pH标准分离胶的值，确保最佳分离效果SDS-PAGE pH是蛋白质研究中最常用的电泳技术，其核心在于（十二烷基硫酸钠）作为强阴离子去污SDS-PAGE SDS剂的独特作用分子具有亲水的硫酸基头部和疏水的烷基尾部，能够强力结合蛋白质的疏水区域，并SDS使蛋白质表面均匀覆盖负电荷在处理过程中，蛋白质与以约的质量比结合，这使得不同蛋白质获得几乎相同的电荷密SDS SDS1:
1.4度因此，蛋白质的迁移速率主要由其分子大小决定，而不受原有电荷和构象的影响通常SDS-PAGE还需配合还原剂如巯基乙醇使用，以断裂蛋白质内部的二硫键，确保蛋白质完全变性为线性结构这β-种组合使成为测定蛋白质分子量和纯度的强大工具SDS-PAGE样品处理与变性变性热处理还原处理SDS加入含的样品样品在加热加入或巯基乙醇等2-5%SDS95-100°C DTTβ-缓冲液，使蛋白质带上均分钟，加速变性过还原剂，断裂蛋白质内部5-10一负电荷分子通过程高温促进与蛋白和之间的二硫键这一步SDS SDS疏水相互作用与蛋白质结质的结合，并帮助解开复对于含有丰富二硫键的蛋合，破坏非共价相互作杂的蛋白质折叠结构，确白质尤为重要，确保蛋白用，导致蛋白质二级和三保完全变性质完全展开成线性结构级结构解体染料添加加入溴酚蓝等示踪染料，便于观察电泳前沿染料分子较小，通常会在蛋白质之前迁移，可作为判断电泳结束的指标同时添加甘油增加样品密度，确保样品顺利加载到凝胶孔中缓冲体系PAGE体系Tris-Glycine体系Tris-Tricine最经典的缓冲体系，分离胶SDS-PAGE用三嘧啶代替甘氨酸，特别适合分离小分子，浓缩胶电极缓冲液含pH
8.8pH
6.8量蛋白和多肽（）在低分子量1-30kDa、甘氨酸和，适合分离Tris SDS15-区域提供更好的分辨率蛋白质200kDa尿素体系体系-PAGE Bis-Tris添加尿素作为变性剂，特别适用于核酸使用作为缓冲剂，约，提8M Bis-Tris pH
6.5和极难变性的蛋白质分析在研究中供更温和的条件，减少蛋白质水解风险适RNA广泛应用合分析易降解的蛋白质样品选择合适的缓冲体系对实验成功至关重要不同缓冲体系的值、离子强度和组成会显著影响电泳效果传统的PAGE pHTris-Glycine（）体系仍是最广泛使用的，但对于特殊应用，如小分子量蛋白或核酸分析，特殊缓冲体系可以提供更优的分离效果Laemmli缓冲液配制技巧使用高纯度水缓冲液配制必须使用去离子水或超纯水，避免金属离子和其他杂质影响电泳质量普通蒸馏水中可能含有微量金属离子，会干扰电泳过程或引起蛋白质降解精确称量与调整pH使用分析天平精确称量试剂，并用校准过的计调整缓冲液值值的微小变化pH pHpH会显著影响蛋白质的迁移行为和分离效果，尤其是在等电点电泳中更为关键避免微生物污染长期保存的缓冲液容易滋生微生物，影响实验结果可添加叠氮钠作为防腐
0.02%剂，但需注意其毒性最好的做法是现配现用，或分装后短期保存4°C电极缓冲液使用限制电泳过程中电极缓冲液的离子组成会逐渐改变，值可能发生漂移对于精确实pH验，电极缓冲液不应重复使用超过次，高要求实验建议每次使用新配制的缓冲液3电泳仪及凝胶夹垂直板式电泳仪最常见的电泳系统，凝胶垂直放置于两块玻璃板之间适用于常规分析，可同时运行多个样品设计包括上下两个缓冲液槽，确保电流垂直通过凝胶PAGE SDS-PAGE迷你型电泳仪体积小巧的电泳系统，适合快速分析和教学用途耗材用量少，运行时间短，但样品容量和分辨率略低对于日常蛋白质检测和快速筛选非常实用凝胶夹具由两块玻璃板和间隔条组成，形成灌注凝胶的模具玻璃板之间的间距（通常为）决定了凝胶厚度组装时需确保密封良好，防止凝胶溶液泄漏
0.75-
1.5mm实验所需器材电泳基本设备垂直板式电泳仪（含上下缓冲槽）•电泳凝胶夹（玻璃板与间隔条）•电泳梳子（形成样品孔）•电泳槽夹具（固定凝胶夹）•恒压或恒流电源（）•0-300V,0-500mA凝胶制备工具小型真空泵（除气用）•移液器（精确量取溶液）•灌胶架（辅助灌胶）•平口镊子（放置梳子）•注射器或巴斯德吸管（灌注叠层液）•样品处理工具精密微量加样枪（）•
0.5-10μL样品加热块或沸水浴•微量离心机（样品短暂离心）•震荡混合器（样品混合）•微型管或样品管•PCR结果分析设备染色盒与脱色容器•摇床（染色脱色用）•凝胶成像系统•凝胶干燥器（可选）•图像分析软件•实验所需试剂凝胶制备试剂电泳与样品处理试剂丙烯酰胺双丙烯酰胺（储备液）凝胶的主要成分，决定凝胶电极缓冲液通常为甘氨酸缓冲液，提供电泳/30%Tris--SDS pH
8.3孔径大小所需离子环境缓冲液分离胶，浓缩胶，维持凝胶稳样品缓冲液（上样缓冲液）含、甘油、或巯基乙醇、Tris-HCl pH
8.8pH
6.8pH SDSDTTβ-定溴酚蓝和Tris-HClpH
6.8十二烷基硫酸钠水溶液，赋予蛋白质均一负电荷分子量标准品预染或未染的蛋白质分子量标记物，用于确定样品分SDS10%子量过硫酸铵新鲜配制，提供自由基引发聚合反应APS10%蛋白质染色剂考马斯亮蓝或，用于染色蛋白质条R-250G-250四甲基乙二胺催化剂，加速聚合反应TEMED带去离子水配制溶液的基本溶剂脱色液通常为甲醇乙酸水混合物，用于洗去凝胶背景染料//固定液甲醇乙酸水混合物，用于固定凝胶中的蛋白质防止扩//散健康与安全防护丙烯酰胺危害防护眼睛与呼吸防护丙烯酰胺单体是一种神经毒性物质，可通过皮肤吸收操作时必须戴配制凝胶溶液时应佩戴防护眼镜，防止溶液飞溅入眼如不慎接触眼适当的丁腈手套，避免皮肤接触如发生皮肤接触，立即用大量清水睛，应立即用洗眼器冲洗至少分钟，并就医高浓度丙烯酰胺溶液15冲洗凝胶配制应在通风橱中进行，避免吸入丙烯酰胺粉尘或蒸气配制时应考虑使用防护面罩和口罩，特别是处理粉末形式的丙烯酰胺时废弃物处理电气安全含丙烯酰胺的废液和凝胶不得随意倾倒，应收集在专门容器中，按照电泳过程涉及高电压，操作时应确保设备接地良好，双手干燥电泳危险化学废弃物处理已聚合的凝胶毒性大大降低，但仍应妥善处过程中不要触摸电极或缓冲液关闭电源后等待几分钟再操作，确保理染色和脱色过程中产生的含有有机溶剂的废液也应单独收集处电容器放电完全定期检查电源线和设备有无损坏，发现问题立即停理止使用实验全流程总览样品前处理蛋白质提取、定量、与上样缓冲液混合、加热变性凝胶制备配制分离胶和浓缩胶溶液、灌胶、插梳子形成样品孔样品加载将处理好的样品和分子量标准品小心加入凝胶孔中电泳分离接通电源、设定电压和电流、监控电泳进程染色与可视化固定、染色、脱色凝胶，使蛋白质条带可见结果分析拍照记录、计算分子量、分析条带强度步骤制备凝胶1计算配方混合基础组分根据目标蛋白分子量范围选择适当浓度，计算各按顺序混合丙烯酰胺溶液、缓冲液、和水SDS组分用量2溶液除气添加催化剂可选步骤，通过抽真空或超声去除溶液中溶解氧最后加入和启动聚合反应APS TEMED凝胶制备是整个实验的基础，直接影响分离效果首先需要根据待分析蛋白质的分子量范围选择合适的丙烯酰胺浓度随后按照特定顺序混合各组分PAGE先加入去离子水、丙烯酰胺溶液、缓冲液和溶液，轻轻混合避免产生气泡/BIS SDS为确保最佳聚合效果，和必须最后加入，且加入后应立即进行下一步操作溶液混合均匀后应尽快灌注，因为聚合反应会立即开始注意观察室APS TEMED温条件，温度过高会加速聚合，可能导致来不及灌胶；温度过低则聚合缓慢，需要延长等待时间凝胶制备过程中的每一个细节都可能影响最终的分离效果分离胶具体配方示例组分胶胶胶胶8%100kDa10%20-100kDa12%10-70kDa15%3-30kDa水
4.6mL
4.0mL
3.3mL
2.3mL丙烯酰胺30%
2.7mL
3.3mL
4.0mL
5.0mL
1.5M TrispH
8.
82.5mL
2.5mL
2.5mL
2.5mL10%SDS
0.1mL
0.1mL
0.1mL
0.1mL10%APS
0.1mL
0.1mL
0.1mL
0.1mLTEMED
0.006mL
0.004mL
0.004mL
0.004mL总体积10mL10mL10mL10mL上表提供了制备不同浓度分离胶的详细配方，适用于标准迷你凝胶（厚度）的丙烯酰胺凝胶是最常用的通用配方，适合分离范
0.75mm10%20-100kDa围的蛋白质对于更大分子量的蛋白质，应选择较低浓度（如或更低）；而对于小分子量蛋白或多肽，则应选择高浓度凝胶（如或更高）8%15%浓缩胶通常固定使用浓度，配方为丙烯酰胺溶液、、、水、4%
0.68mL30%
0.5mL
1.0M TrispH
6.
80.04mL10%SDS
2.7mL
0.04mL10%和在实际操作中，建议先配制分离胶溶液并灌注，等其凝固后再配制浓缩胶溶液，这样可以避免浓缩胶提前聚合APS
0.004mL TEMED步骤灌制凝胶2组装凝胶夹清洁玻璃板，组装凝胶夹具，确保无泄漏灌注分离胶小心倒入或用移液管转移分离胶溶液，填充至适当高度加入封层轻轻加入水或异丁醇形成平整表面，防止氧气抑制聚合等待聚合室温下等待分钟，确保完全聚合20-30倒出封层倾倒或吸出封层液体，用滤纸吸干残留水分灌注浓缩胶倒入浓缩胶溶液至玻璃板顶部插入梳子小心插入梳子，避免气泡，等待聚合完成步骤样品准备3蛋白质定量使用、或其他蛋白质定量方法确定样品浓度，保证各样品加载量一致精确的蛋白质定量BCA Bradford是比较不同样品表达水平的基础常规电泳每孔加载蛋白，银染色则可低至10-50μg1-5μg样品缓冲液制备标准上样缓冲液通常含有、、甘油、巯基乙醇和2×125mM Tris-HClpH
6.84%SDS20%10%β-溴酚蓝使蛋白质带负电，甘油增加密度便于加样，巯基乙醇断裂二硫键，溴酚蓝用于
0.004%SDSβ-跟踪电泳前沿变性处理将蛋白质样品与样品缓冲液按体积比混合，涡旋震荡均匀后在加热分钟加热过程1:195-100°C5-10促进与蛋白质充分结合，同时使蛋白质完全变性处理后，应立即将样品放入冰上冷却，防止重新折SDS叠样品离心变性后的样品应短暂离心（，秒），沉降可能存在的不溶性物质，防止这些物质堵塞样品10,000×g10孔离心后取上清用于电泳，避免吸取沉淀对于特别重要的样品，可保存少量原始样品作为备份步骤加载样品4电泳装置组装将凝胶夹具安装到电泳槽中，确保密封良好小心取出梳子，显露出样品孔检查样品孔是否完整，无破损或变形向上下缓冲槽中加入新鲜配制的电泳缓冲液，确保电极完全浸没样品孔清洗使用移液器和细长枪头，轻轻冲洗样品孔，清除未聚合的丙烯酰胺和气泡这一步骤能够确保样品均匀加载和清晰的条带形成对于关键实验，冲洗后可用注射器清除残留液Hamilton体加载分子量标准品首先加载分子量标准品（通常为）标准品可提供分子量参考，帮助确定目标蛋白的3-5μL大小预染色的标准品可直观显示电泳进度，非常实用标准品应放在第一或最后一个孔，便于识别精确加载样品使用适当体积的移液器（通常），缓慢、稳定地将样品加入凝胶孔中枪头应插10-20μL入缓冲液中但不要触碰凝胶底部加样时避免产生气泡，每次更换样品需更换枪头，防止交叉污染步骤电泳运行5电压和电流设置电泳过程监控将电源连接到电泳槽，确保正负极连接正确（蛋白质从负极向正电泳开始后，应立即检查是否有气泡产生，尤其是在电极附近极移动）设置适当的电压和电流参数，通常在浓缩胶阶段使用气泡会阻断电流，导致电泳不均匀使用玻璃棒或弯曲的移液器恒压，样品进入分离胶后可提高到过枪头可轻松清除气泡80-100V120-150V高的电压会导致过热和条带弥散，影响分辨率注意观察溴酚蓝染料的迁移，它通常比最小的蛋白质移动更快，在进行常规蛋白质时，一般根据凝胶大小设定电作为电泳前沿的指示剂对于大多数应用，当溴酚蓝接近凝胶底SDS-PAGE流迷你胶约胶，大型胶约胶电泳部处时可停止电泳预染分子量标准品也可作为判断电20-30mA/40-50mA/1-2cm时间取决于蛋白质大小和凝胶浓度，通常在小时内完成泳进度的参考完成电泳后，关闭电源，拆卸装置，小心取出凝1-2胶进行后续处理温度控制温度对电泳的影响外部冷却方法电泳过程中的焦耳热会导致缓冲液和凝对于敏感实验，可将电泳装置放入冰浴胶温度升高，过高的温度可能引起蛋白中或在冷室进行某些电泳仪配有4°C质变性、扩散和条带弥散，降低分辨冷却夹克或循环水冷却系统，可有效控率同时，局部高温可能导致凝胶中部制温度冷却不仅提高分辨率，还能延胀大，形成微笑效应长缓冲液和凝胶的使用寿命缓冲液温度监控电压调控降温定期检查缓冲液温度，尤其是长时间高较低的电压和电流可减少热量产生，是电压电泳时如温度超过，应考最简单的温度控制方法虽然会延长电40°C虑更换预冷缓冲液或暂停电泳让系统冷泳时间，但可显著提高分辨率对于需却某些精密实验可能需要使用温度计要长时间电泳的实验，建议使用低电压实时监控（如）过夜运行50-80V步骤蛋白染色6凝胶取出与记录小心分离玻璃板，标记凝胶方向染色步骤浸入染色液，轻微振荡小时或过夜2脱色过程更换脱色液多次，直至背景清晰结果记录使用成像系统拍照存档分析染色是使蛋白质条带可视化的关键步骤考马斯亮蓝染色是最常用的方法，具有操作简便、成CBB本低的优点标准染色液组成为、甲醇和冰醋酸染色过程中，蛋白质
0.1%CBB R-25040%10%通过静电和疏水相互作用与染料结合脱色过程使用甲醇和冰醋酸溶液，目的是去除凝胶基质中的背景染料，同时保留结合在蛋白40%10%质上的染料脱色时间因凝胶厚度和染色深度而异，通常需要数小时至过夜为加速脱色，可多次更换脱色液，或在脱色液中放入纸巾或脱脂棉球吸附游离染料完成后的凝胶可保存在醋酸溶液1-5%中数周，或使用凝胶干燥设备长期保存银染与染色对比Coomassie特性考马斯亮蓝染色银染CBB SilverStaining灵敏度蛋白条带蛋白条带10-100ng/
0.1-1ng/线性范围较宽，适合定量分析较窄，主要用于检测操作复杂度简单，步骤少复杂，步骤多，时间敏感重现性高，结果稳定中等，受多种因素影响成本低中等到高与质谱兼容性良好部分兼容，取决于具体方案适用场景常规蛋白分析，定量比较微量蛋白检测，高灵敏度要求选择合适的染色方法对于实验成功至关重要考马斯亮蓝染色操作简单，成本低廉，且与下游质谱分析高度兼容，是大多数常规蛋白分析的首选方法它有和两种变体，后者为胶体染料，背景更R-250G-250低银染的灵敏度比高约倍，能检测到纳克级别的蛋白质，适合微量样品分析然而，银染过程复CBB100杂，包括固定、敏化、银浸染和显影等多个精确控制的步骤，对时间和试剂纯度要求高此外，银染的线性范围较窄，不适合精确定量现代实验室还有荧光染料等其他选择，兼具高灵敏度和良好线性范围，但成本较高核酸简介PAGE核酸的特点尿素变性PAGE PAGE虽然聚丙烯酰胺凝胶电泳最常用于蛋白质分析，但它同样是分离尿素是研究中的重要工具，特别适用于分析-PAGE RNA小分子核酸的强大工具核酸主要用于分析小于碱、和其他小标准配方通常含尿素，PAGE1000miRNA siRNA RNA6-8M基对的片段或分子，提供琼脂糖凝胶无法企及的高分足以破坏的二级结构（硼酸）是最常DNA RNARNA TBETris--EDTA辨率用的缓冲系统，提供良好的缓冲能力和分辨率核酸可分为非变性和变性两种类型非变性条件保留核酸与蛋白质不同，核酸通常采用垂直板式但不使用浓PAGE PAGE PAGE的二级结构，迁移率受分子形状影响；变性条件则使核酸完全单缩胶，而是单一浓度的分离胶凝胶浓度根据目标分子大小选链化，迁移率主要由长度决定变性剂通常为尿素（用于择适合，适合，6-8%100-1000nt10-12%60-300nt）或甲酰胺（用于测序）适合电泳前样品通常在加热RNA DNA15-20%10-100nt95°C2-5分钟后快速冷却，确保完全变性样品处理DNA/RNA样品准备DNA样品处理相对简单，通常只需与上样缓冲液混合即可标准上样缓冲液含有DNA DNA溴酚蓝和甘油，前者用于跟踪电泳前沿，后者增加样品密度便于加载对于需要单链分析的样品，可添加甲酰胺或进行变性处理，然后立即放入冰中防止重新退DNA NaOH火双链分子量标准应与样品一同电泳，便于确定片段大小DNA样品变性处理RNA分子容易形成复杂的二级结构，必须彻底变性才能基于长度分离标准处理方RNA法是将样品与含甲酰胺的变性缓冲液混合（通常为甲酰胺、溴酚RNA95%
0.025%蓝、二甲苯青、和），在加热
0.025%FF
0.5mM EDTA
0.025%SDS65-95°C分钟，随后立即转移至冰上冷却变性处理破坏分子内的氢键，防止二级3-5RNA结构形成防污染措施RNase极易被无处不在的降解，因此样品处理需特别注意防污RNA RNaseRNA RNase染所有溶液应使用处理的水配制，并尽可能使用经处理的一次性DEPC RNase塑料制品操作前彻底清洁工作台，戴无粉手套，避免直接接触样品和容器内壁样品应保存在含抑制剂的溶液中，并尽量保持低温对于宝贵的RNA RNase样品，可加入抑制剂直接保护RNA RNase实验注意事项分子污染酶污染防控蛋白酶和核酸酶是实验中最常见的分子污染源蛋白酶可降解样品蛋白质，导致条带减弱或PAGE消失；核酸酶则会降解样品应使用无酶级别试剂，并在干净的环境中操作对于DNA/RNA实验，所有玻璃器皿应在烘烤至少小时灭活，塑料用品则需处理RNA180°C4RNase DEPC微生物污染长期保存的缓冲液和溶液容易滋生微生物，导致变化和酶污染溶液应在高压灭菌条件下制pH备，并添加适当防腐剂如叠氮钠（注意叠氮钠有毒）室温保存的溶液应定期检查浑浊度，发现异常立即更换最佳做法是定期新鲜配制关键试剂，尤其是凝胶缓冲液和电极缓冲液物理杂质灰尘、纤维和其他微粒可能导致凝胶气泡形成或样品孔不规则，影响电泳效果制胶前应彻底清洁玻璃板，使用过滤器过滤凝胶溶液加样前可用电泳缓冲液冲洗样品孔，清除可能的碎片保持实验室整洁，穿着适当的实验服，可减少污染风险化学交叉污染、有机溶剂和染料等化学物质的交叉污染可能干扰电泳结果使用专用容器储存不同试剂，SDS避免混用移液器染色和脱色用具应与凝胶制备工具分开定期清洁工作台和设备表面，尤其是在处理不同类型样品时对于高灵敏度实验，考虑使用一次性用品减少交叉污染风险结果观察凝胶成像系统条带评估图像分析软件现代实验室通常使用数字凝胶成像系统记录和分析电泳结果时，首先评估整体质量背景是专业凝胶分析软件能够对电泳图像进行定量和分析电泳结果这些系统包括高分辨率否清晰，条带是否锐利无拖尾，泳道是否均匀定性分析这些软件可自动或手动检测条带，CCD相机、可调光源和滤光片组，能捕捉不同染色平直理想的电泳结果应有清晰的背景和分辨计算分子量，分析条带强度和纯度通过与分方法的图像对于考马斯染色，使用白光透射率高的条带条带形态也提供重要信息锐利子量标准品比较，可以确定目标蛋白的大小；成像；对于荧光染色，则需要特定波长的激发的条带表明样品完整性好；弥散或拖尾则可能通过密度分析，可以评估蛋白质相对丰度高光和发射滤光片成像系统不仅能保存高质量暗示样品降解或过载；双重条带可能表明蛋白级软件还支持不同凝胶间的标准化比较，以及图像记录，还可通过软件进行定量分析质修饰或不完全变性一维和二维电泳的复杂分析典型蛋白分离效果图例上图展示了不同条件下的蛋白质分离效果左上图显示标准中不同分子量蛋白的迁移模式，分子量越大，迁移距离PAGE SDS-PAGE越短右上图展示梯度凝胶的宽范围分离能力，能在单次电泳中清晰分离从到的蛋白4-20%5kDa250kDa左下图对比了相同样品的考马斯染色和银染结果，后者显示出明显更高的灵敏度，能够检测到更多低丰度蛋白条带右下图展示了二维电泳的强大分离能力，蛋白质首先按等电点水平分离，然后按分子量垂直分离，形成独特的蛋白质地图理解这些典型图例有助于正确解读自己的实验结果并进行故障排除迁移率与分子量标准曲线电泳常见问题及解析条带扭曲或微笑效应凝胶中央温度高于边缘，导致中央迁移加速•电压过高，产生过多热量•缓冲液导电性不均，浓度或不一致•pH解决方案降低电压，控制温度，确保缓冲液均匀•条带弥散或拖尾样品过载，超出凝胶分离能力•蛋白质未完全变性或聚集•样品中存在污染物如盐、脂质•解决方案减少上样量，延长变性时间，优化样品纯化•泳道偏斜或条带倾斜电极连接不平行或电场不均匀•样品孔变形或加样不当•凝胶聚合不均匀•解决方案检查电极、改进加样技术、确保凝胶均匀聚合•背景染色过深染色时间过长或染料浓度过高•脱色不充分或脱色液更换不及时•凝胶老化或储存不当•解决方案优化染色方案，延长脱色时间，及时更换脱色液•问题分析例条带模糊1现象识别条带边缘不清晰，呈现弥散状态，难以区分相邻条带，可能伴随背景染色加深模糊程度可能随分子量变化，通常大分子区域更为明显潜在原因分析样品降解蛋白质部分水解导致多个片段；缓冲液过期或偏移；凝胶聚合不完pH全；电泳温度过高；样品变性不充分；样品中盐浓度过高干扰电场；凝胶浓度不适合目标蛋白大小针对性解决方案使用新鲜配制的缓冲液和试剂；加强样品变性处理，延长煮沸时间至分钟；减10少上样量，避免过载；降低电压并控制温度；考虑样品透析去除高盐；选择更适合目标蛋白分子量的凝胶浓度；添加蛋白酶抑制剂防止降解预防措施建立标准操作流程，记录每批试剂配制日期；定期校准计和天平；样品制备后pH立即使用或保存；实验前进行小规模预实验确定最佳条件；保持良好的实-80°C验习惯和环境整洁问题分析例跑偏或条带弯曲2电极缓冲液问题电场不均匀过热效应凝胶制备缺陷缓冲液未完全覆盖凝胶顶部电极连接不良或放置不平高电压导致凝胶中部温度显凝胶聚合不均匀，或凝胶夹或底部，导致部分区域电场行，导致电场分布不均匀著高于边缘，形成典型的装配不当导致凝胶厚度不一不均匀两侧缓冲槽的液位电泳槽损坏或变形也可能导微笑效应（条带中间向下致灌胶时气泡滞留也会导不平衡也会导致电场偏斜致类似问题应检查电极连弯曲）应降低电压致局部畸变应确保凝胶夹解决方法是确保凝胶完全浸接是否牢固，电泳槽是否平（为宜），必组装平整牢固，灌胶时避免100-120V没在缓冲液中，两侧缓冲槽放，必要时更换损坏的电泳要时使用冷却系统控制温气泡产生，必要时可轻轻震液位一致，并定期检查电泳设备电泳开始后，观察气度对于厚凝胶或高浓度凝动或使用针头排除气泡聚过程中的液位变化泡产生是否均匀可初步判断胶，热效应更为明显，应特合反应应在恒定温度下进电场分布别注意温度控制行，避免局部过热或过冷实例在蛋白表达检测中的应用:PAGE重组蛋白表达监测蛋白纯化分析聚丙烯酰胺凝胶电泳是监测重组蛋白表达的黄金标准方法在基在蛋白质纯化过程中，是评估各纯化步骤效果的关键工PAGE因工程中，研究人员需要确认目标蛋白是否成功表达，以及表达具通常会收集纯化流程中的不同组分（如上样液、洗脱液、流水平是否达到预期通过比较诱导前后的细胞裂解物样品，可以穿液等），通过电泳分析各组分中目标蛋白的含量和纯度这种直观观察到目标蛋白带的出现或增强分析有助于优化纯化条件，减少目标蛋白损失不仅可以确认蛋白表达，还能初步判断蛋白大小是通过对比纯化前后的样品，可以计算纯化倍数和回收率密度扫SDS-PAGE否符合预期，以及表达水平的高低对于融合标签蛋白，电泳还描分析可以定量评估最终产物的纯度，通常高纯度重组蛋白的纯可以评估融合蛋白的完整性通过与已知浓度的标准蛋白比较，度应达到以上对于需要高纯度的应用（如结晶学研90%还可以半定量估计目标蛋白的产量究），分析可以检测微量杂质蛋白的存在PAGE实例在蛋白修饰和突变检测的应用:PAGE翻译后修饰分析检测磷酸化、糖基化等修饰导致的微小分子量变化突变蛋白检测2鉴别点突变或小片段缺失引起的迁移差异构象变化研究3通过非变性分析蛋白质构象状态PAGE翻译后修饰是蛋白质功能调控的重要机制，在这一领域有广泛应用磷酸化通常导致蛋白质迁移率轻微降低，在高分辨率凝胶中表现PTM PAGE为条带上移通过比较处理前后样品或使用特异性抗体，可以检测特定修饰的存在更复杂的修饰如糖基化会导致更显著的分子量变化和条带模糊，此时可结合特异性糖苷酶处理进行确认对于突变蛋白研究，即使是单个氨基酸的改变也可能在高分辨率中被检测到，特别是当突变影响蛋白质的电荷时非变性（不含PAGE PAGE）则保留了蛋白质的原生构象和电荷特性，能够区分相同分子量但构象不同的蛋白质变体通过调整和电泳条件，非变性还可用于研SDS pHPAGE究蛋白质的寡聚状态、配体结合和蛋白质蛋白质相互作用-与转膜（）结合PAGE Western Blot电泳分离分离蛋白质混合物SDS-PAGE转膜电转或湿转将蛋白转移至膜上封闭或脱脂奶粉封闭非特异结合位点BSA抗体杂交一抗识别目标蛋白，二抗提供信号信号检测化学发光、荧光或显色反应显示结果是分子生物学中极为重要的技术，将的高分辨率分离能力与免疫检测的高特异性结合起来这一技术始于分离，但随后通过电转或湿转将分离的蛋白质转移到Western BlotPAGE PAGE固相支持膜上（通常为或硝酸纤维素膜）转膜过程保留了分离的蛋白质位置信息，同时使蛋白质暴露，便于抗体识别PVDF PAGE转膜后，使用特异性抗体检测目标蛋白与直接染色相比，具有显著更高的灵敏度和特异性，能够在复杂混合物中检测极低丰度的特定蛋白质此外，通过选择针对特定Western Blot修饰（如磷酸化位点）的抗体，可以选择性地检测蛋白质的特定修饰形式在基因表达、蛋白质翻译后修饰和信号转导研究中，与的组合是不可或缺WesternBlotPAGE WesternBlot的分析工具凝胶电泳简介PAGE-2D第一维等电聚焦蛋白质按等电点（）分离，使用梯度胶条pI pH平衡处理胶条用缓冲液处理，准备第二维分离SDS第二维SDS-PAGE垂直于第一维方向，按分子量进一步分离蛋白点分析染色后分析蛋白质表达图谱，鉴定差异点二维凝胶电泳是蛋白质组学研究的经典技术，能同时分离数千种蛋白质第一维分离基于蛋白质2D-PAGE的等电点，使用浸润式梯度胶条在电场中进行等电聚焦在各自的等电点处，蛋白质的净电pI pHIPG IEF荷为零，停止迁移第一维分离完成后，胶条经平衡处理，然后转移到第二维上IPG SDSSDS-PAGE第二维垂直于第一维方向进行，按分子量进一步分离蛋白质分离后的凝胶通常使用银染或荧光SDS-PAGE染料染色，显示出被称为蛋白质图谱的复杂点阵通过图像分析软件，可以比较不同样品间的蛋白质表达差异，鉴定出差异表达的蛋白点结合质谱技术，可以进一步鉴定这些差异蛋白的身份，为疾病标志物发现、药物作用机制研究等提供重要信息与核酸技术结合PAGE（电泳迁移率变动分析）结构与剪接分析EMSA RNA电泳迁移率变动分析是研究蛋白质核酸相互作用的强大工具该技术基变性尿素是研究的关键工具，特别适用于分析剪接事件和结构EMSA-PAGE RNARNA于蛋白质与核酸结合后形成的复合物比自由核酸的电泳迁移率降低的原理通常使在剪接研究中，可以区分前体和成熟，甚至检测到微小的外显子跳RNARNARNA用非变性，保留生物分子的原生状态和相互作用通过比较有无蛋白质存在跃或内含子保留事件对于结构研究，通过酶切或化学探针处理后的片PAGE RNARNA时核酸的迁移位置，可以确定结合的发生，并通过竞争实验评估结合特异性段分析，可以揭示的二级和三级结构特征RNA序列与突变检测微与小分析DNA RNARNA高分辨率能够区分单核苷酸差异的片段，是某些序列和突变分析高浓度变性是分析微小如、的理想选择，PAGE DNADNA PAGE15-20%RNA miRNAsiRNA的基础经典的测序就依赖于高分辨率变性分离终止片段此外，能够精确区分长度差异仅为个核苷酸的小分子结合杂交技Sanger PAGE1-2RNA Northern单链构象多态性分析利用非变性检测单链构象的微小差异，能术，可以特异性检测特定的小表达模式对于非编码研究，提供SSCP PAGEDNA RNARNA PAGE够筛查点突变而无需测序了分析小加工过程和表达调控的重要工具RNA数据标准化与定量分析实验的定量精度与限度PAGE
0.1μg10-15%银染检测限常规定量变异系数银染最低可检测的蛋白量，灵敏度远高于考马斯染色相同样品重复测定的典型变异范围倍2-310-100μg可靠定量差异考马斯线性范围能够可靠检测到的表达变化倍数阈值染色的最佳定量工作范围，超出此范围失去线性CBB定量分析具有特定的精度限制和适用范围不同染色方法有不同的检测限和线性范围考马斯亮蓝染色检测限约为条带，线性范围为；银染更灵敏，检测限可达PAGE
0.1-
0.5μg/10-100μg1-条带，但线性范围较窄，不适合精确定量；荧光染料如兼具高灵敏度和宽线性范围，是定量分析的最佳选择10ng/1-10μg SYPRORuby1-10ng1-1000ng定量受多种因素影响，包括样品制备、加样量控制、染色均匀性和图像采集条件等即使在最优条件下，常规定量的变异系数也在左右，因此表达差异小于倍的变化难以可靠PAGE CV10-15%
1.5-2检测为提高定量精度，建议使用内参蛋白校正，进行多次重复实验，并采用标准曲线法确定最佳工作浓度范围对于需要高精度定量的应用，应考虑结合或质谱等互补技术Western blot未来发展趋势微型化与自动化高灵敏多色检测微流控电泳技术正逐步取代传统，将整个电泳过程集成在芯片上，新型荧光染料和标记技术使多色检测成为现实，可在同一凝胶上同时分析PAGE大大减少样品用量和分析时间最新的微型电泳系统可在几分钟内完成分多个蛋白量子点标记和超灵敏生物发光检测将检测限降低到飞克级别，离，仅需纳升级样品，非常适合珍贵样品分析和高通量筛选全自动样品有望实现单分子水平的可视化这些技术尤其适用于稀有蛋白、翻译后修处理和数据分析系统正在成为标准配置，减少人为误差饰和动态蛋白相互作用的研究数据整合与人工智能与其他组学技术融合现代分析正与大数据和人工智能技术深度融合云计算平台可自动未来的技术将更紧密地与其他组学方法整合，形成多维分析平台PAGE PAGE分析凝胶图像，识别差异蛋白，并与蛋白质组数据库关联机器学习算法例如，电泳分离后直接进行质谱分析的在线系统，或与单细胞技术结合的能识别复杂的蛋白质表达模式，挖掘传统方法难以发现的关联这些技术高通量分析平台这种整合将为系统生物学和精准医学提供更全面的分子大大提高了数据分析效率和深度图景，促进生物医学研究的突破安全与规范化实验建议标准操作规程建立SOP建立详细的实验是保证实验质量和安全的基础应包含试剂准备、设备操作、安全防护和废弃SOP SOP物处理等各个环节的具体指导每位实验人员都应熟悉并严格执行，新人应在有经验人员指导下进SOP行操作培训定期更新以反映最新的技术进展和安全要求，并保存实验记录以便追溯问题SOP个人防护与安全意识处理丙烯酰胺等有毒试剂时，必须使用适当的个人防护装备，包括实验服、防护眼镜和丁腈手PPE套有毒试剂操作应在通风橱中进行，避免吸入蒸气或粉尘电泳设备使用前应检查绝缘情况，确保正确接地，操作时手部保持干燥建立安全意识培训制度，定期对实验人员进行安全教育，确保所有人了解紧急情况处理程序设备维护与校准定期维护和校准是保证实验设备正常运行和数据可靠的关键电泳设备应定期检查电源、电极和密封情况，确保无漏电和腐蚀移液器至少每半年校准一次，确保加样精确度电子天平和计pH等关键设备也需按规定周期校准建立设备使用和维护日志，记录使用情况和故障处理，延长设备使用寿命并减少实验故障实验室质量管理实施全面的实验室质量管理体系，确保实验结果的可靠性和可重复性包括试剂质量控制（使用高纯度试剂，标注配制日期和有效期），样品管理（合理标记和保存样品，防止混淆和降解），以及结果验证（使用阳性和阴性对照，进行统计分析评估数据质量）对于重要实验，应由不同人员独立重复以验证结果考虑参加实验室间比对或能力验证计划，持续提升实验室技术水平总结回顾关键试剂理论基础丙烯酰胺双丙烯酰胺、、是凝胶形成/TEMED APS聚丙烯酰胺凝胶电泳基于分子在电场中迁移的物理2的核心组分，使蛋白质按分子量分离SDS原理，丙烯酰胺形成的均一网状结构提供优异的分辨率实验步骤凝胶制备、样品处理、电泳分离和结果分析构成完整的实验流程应用拓展5从基础蛋白分析到蛋白质组学和核酸研究，结果分析PAGE技术应用广泛染色显示分离效果，通过与标准品比较确定分子4量，定量分析评估表达水平本课程系统介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的理论基础、技术细节和实践应用我们从电泳的基本原理出发，详细讲解了的物理化学机制、凝胶形成过程、不同类型的PAGE系统及其应用场景在实验操作部分，我们提供了从样品制备到结果分析的全流程指导，强调了每一步的关键点和常见问题的解决方法PAGE通过本课程，您应已掌握独立进行实验的能力，了解如何选择合适的实验条件，如何解读电泳结果，以及如何应对可能遇到的各种技术挑战随着生物技术的不断发PAGE展，作为一项基础技术将继续在生物医学研究中发挥重要作用希望本课程为您的研究工作提供有力支持，也期待您在实践中不断完善和创新这一经典技术PAGE交流与提问常见问题讨论实验操作演示分组实践与指导欢迎同学们提出关于实验的疑问和课程结束后将安排实验的现场演后续将组织小组实践活动，每组学生在指PAGEPAGE挑战从理论理解到实际操作，从结果解示，包括凝胶制备、样品加载、电泳运行导教师的帮助下完成完整的实验PAGE释到故障排除，任何问题都可以在此环节和染色等关键步骤通过实际操作展示，这种亲身体验是掌握实验技能的最佳方提出我们将结合实际案例和经验，提供帮助同学们将理论知识转化为实践技能式在实践过程中，指导教师将随时提供针对性的解答和建议对于复杂问题，可演示过程中会特别强调一些细节和技巧，帮助和反馈，确保每位同学都能顺利完成以安排额外的讨论时间深入探讨这些往往是实验成功的关键因素实验并正确解读结果。
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