《分子生物学大实验》课件

分子生物学大实验欢迎参加分子生物学大实验课程！本课程将全面覆盖分子生物学实验的核心内容，从基础理论到实际操作，帮助您掌握这一关键领域的实验技能我们将结合实际例子，深入探讨实验原理，并严格遵循实验规范通过系统学习，您将能够独立开展分子生物学实验，为今后的科研工作奠定坚实基础让我们一起踏上这段探索生命奥秘的分子之旅！绪论分子生物学实验的诞生与发展1双螺旋结构发现DNA1953年，James Watson和Francis Crick发表了DNA双螺旋结构的开创性论文，揭开了分子生物学时代的序幕这一发现为理解基因如何存储和传递信息提供了关键基础2中心法则确立Francis Crick提出了分子生物学中心法则，描述了DNA、RNA和蛋白质之间的信息流动关系，为后续研究奠定了理论框架3重组技术DNA20世纪70年代，DNA重组技术的发展使科学家能够在实验室操作基因，开创了现代分子生物学实验的新纪元分子生物学实验的意义推动生命科学发展促进医学、农业等领域进步解析生命本质揭示分子水平的生命奥秘应用价值基因工程与转基因技术发展分子生物学实验的开展使我们能够深入理解生命现象的分子本质，从DNA复制、转录到蛋白质合成的每一个环节这些知识不仅满足了人类对生命本质的探索欲望，更为现代医学诊断与治疗提供了新思路同时，分子生物学实验也推动了基因工程和转基因技术的发展，在农业生产、药物研发等领域创造了巨大的经济和社会价值，开启了生物技术革命的新时代分子生物学实验发展历程重组技术创立DNA20世纪70年代，科学家成功将外源DNA片段整合到质粒中，实现了基因重组，为基因工程奠定了基础这一技术革命性地改变了遗传物质的研究方式，使人类首次能够在分子水平上操控基因技术的发明与普及PCR1983年，Kary Mullis发明了聚合酶链式反应PCR技术，实现了特定DNA片段的体外快速扩增PCR技术彻底改变了分子生物学研究方法，显著提高了工作效率，被广泛应用于基础研究和临床诊断高通量测序技术革命21世纪初，新一代测序技术出现，使DNA测序速度提高了数千倍，成本下降了数百倍高通量测序的发展推动了基因组学和其他组学研究的蓬勃发展，开创了精准医疗时代分子生物学实验的典型成果人类基因组计划完成作物转基因品系商业化2003年，历时13年的人类基因组通过分子生物学技术，科学家成计划宣布完成，揭示了人类约30功将抗虫、抗除草剂等有益基因亿个碱基对的序列信息这一里导入作物基因组，培育出多种转程碑式的成就为理解人类遗传疾基因作物品种并实现商业化种病、研发新药和个体化医疗提供植这些成果显著提高了农作物了基础，开启了生物医学研究的产量，减少了农药使用，为全球新纪元粮食安全做出了重要贡献基因编辑技术突破CRISPR-Cas9等基因编辑技术的发展使基因组精确修改变得简单高效这项革命性技术正在改变生物医学研究和治疗方法，为遗传疾病治疗、癌症研究和农业育种带来新希望分子生物学实验的基础知识简介分子特点分子特点蛋白质分子特点DNA RNA脱氧核糖核酸DNA是由两条互补的多核糖核酸RNA通常为单链结构，含有四蛋白质由氨基酸链折叠成特定三维结核苷酸链构成的双螺旋结构，包含四种种碱基A、U、G、CRNA种类多样，构，是执行生命功能的主要分子不同碱基A、T、G、CDNA作为遗传信息包括信使RNA、转运RNA和核糖体RNA蛋白质具有催化、转运、支持、防御等的携带者，具有自我复制和稳定传递信等，在基因表达过程中扮演着信息传多种功能，是基因表达的最终产物和生息的能力，是生命信息的长期存储分递、转译和调控等多种角色命活动的主要执行者子基因表达调控是分子生物学的核心内容，包括转录调控、翻译调控等多层次机制，确保基因在正确的时间、正确的细胞中表达适量的蛋白质，是生命活动精确运行的基础实验室常用仪器设备分子生物学实验室配备多种专业设备，离心机用于分离生物样品，电泳仪用于分析核酸和蛋白质，PCR仪用于扩增特定DNA片段，分光光度计用于测定生物分子浓度，超净工作台提供无菌环境，微量移液器用于精确量取微量液体熟练掌握这些仪器的使用方法是开展实验的基础，每位实验者都需经过严格训练，确保实验操作准确无误仪器正确使用与维护电泳仪操作注意事项反应体系制备要求设备定期校准与清洁PCR使用前检查仪器完整性，确保电极在无菌环境下准备反应体系，避免移液器每3-6个月校准一次；离心连接正确；通电时避免触碰电极和DNA污染；使用专用PCR管和无菌机转子定期检查平衡和磨损情况；缓冲液；实验结束后及时切断电吸头；按照从水到酶的顺序添加组PCR仪热块温度每年校准；所有仪源，清洁电泳槽，防止缓冲液腐蚀分；确保反应体系充分混匀但不产器使用后及时清洁，避免试剂残留电极和槽体生气泡和污染实验规范与安全训练个人防护毒害试剂处理实验服必须完全扣好，不得在实验区外穿溴化乙锭等致癌物质需在专用区域操作；酚着；手套使用后不得触摸公共物品；接触有氯仿等有机溶剂在通风橱中使用；所有有毒害物质后立即更换手套；离开实验室前必须试剂必须按规定分类收集，不得随意倾倒入洗手下水道废弃物处置生物安全生物废弃物与普通垃圾分开收集；含菌培养3所有生物样品视为潜在感染源；细菌培养物物需高压灭菌；锐器废弃物放入专用容器；需经高压灭菌处理；转基因生物材料需专门化学废液集中处理，不得混合不相容物质容器密封保存；实验台面定期消毒实验准备与分组实验预习详细阅读实验指导书，理解实验原理和步骤，准备实验笔记本记录要点和注意事项器材清单根据实验内容准备所需仪器、耗材和试剂，检查设备状态和试剂有效期分组安排按照实验难度和内容合理分配实验任务，确保每位成员都能参与关键步骤操作预实验对复杂或关键步骤进行小规模预实验，熟悉操作流程，排除潜在问题充分的实验准备是成功的关键实验前，每个小组应明确成员分工，确保每位同学都能掌握基本操作技能，同时指定专人负责记录实验过程和结果实验中遇到问题时，应及时与指导教师沟通，寻求解决方案大肠杆菌感受态细胞的制备菌种活化从保存菌种接种至新鲜LB培养基菌液培养37°C振荡培养至对数生长期₂处理CaCl冰浴条件下缓慢添加氯化钙溶液感受态保存分装并速冻保存于-80°C制备高效感受态细胞的关键在于严格控制培养条件和温度变化细胞必须处于对数生长期（OD₆₀₀约

0.4-

0.6），CaCl₂处理过程中温度不得高于4℃，以确保细胞膜通透性适当增加影响转化效率的因素包括菌株特性、细胞生长状态、CaCl₂浓度和处理时间、冷热刺激参数设置等电击法可获得更高的转化效率，但对设备和操作要求更高质粒的转化实验原理DNA质粒准备细胞吸附1含有外源基因和选择标记的环状DNA DNA与感受态细胞膜结合表达筛选热激处理转化细胞在选择性培养基上生长短暂高温促进DNA进入细胞质粒转化是分子克隆的关键步骤，通过人工诱导细菌细胞暂时增加膜通透性，使外源DNA进入细胞并在细胞内复制表达质粒DNA作为载体，可携带外源基因和筛选标记（如抗生素抗性基因），使转化成功的细胞能在选择性培养基上生长形成菌落感受态细胞吸收外源DNA的机制包括钙离子促进DNA与细胞表面的结合；热激导致细胞膜暂时形成微孔；部分DNA分子通过这些微孔进入细胞质；存活的转化细胞表达质粒上的基因，包括抗性标记，从而能够在选择性培养基上形成可见菌落质粒转化实验操作流程DNA与感受态细胞混合DNA在冰上将1-10ng质粒DNA与50-100μl感受态细胞轻轻混合，避免剧烈震荡破坏细胞混合物在冰浴中静置30分钟，使DNA充分吸附在细胞表面热激转化将混合物迅速转移至42°C水浴中，精确热激45秒（时间控制非常关键）热激后立即放回冰上冷却2分钟，使细胞膜恢复完整性细胞复苏加入900μl无抗生素的SOC培养基，37°C摇床孵育60分钟，使细胞恢复活力并开始表达抗性基因，为后续筛选做准备平板涂布与培养取不同体积（50-200μl）的转化菌液涂布于含适当抗生素的LB固体培养基上37°C倒置培养16-18小时，观察菌落形成情况实验结果观察与分析⁶99%101:5阴性对照成功率理想转化效率蓝白斑比例未加DNA的感受态细胞应在选择培养基上无菌落每微克质粒DNA产生的转化子数量典型插入克隆与自连接质粒的比例生长蓝白斑筛选是基于lacZ基因α肽互补原理的简便筛选方法含X-gal和IPTG的培养基上，成功插入外源DNA的重组质粒会破坏lacZ基因，使菌落呈白色；而自连接的空载体仍能表达完整的β-半乳糖苷酶，水解X-gal产生蓝色产物，使菌落呈蓝色转化效率计算公式转化效率=菌落数÷DNA量×稀释倍数，单位为cfu/μg影响转化效率的因素包括感受态细胞质量、DNA纯度、热激条件、复苏时间等当效率低于10³cfu/μg时，需检查实验过程中的各个环节质粒的提取及质量分析DNA菌液培养含抗生素LB培养基中37°C过夜培养转化菌碱裂解SDS-NaOH溶液裂解细胞，释放质粒DNA中和沉淀醋酸钾溶液中和并沉淀蛋白质-染色体DNA复合物纯化DNA异丙醇/乙醇沉淀回收质粒DNA碱裂解法是最常用的质粒提取方法，基于染色体DNA与质粒DNA在碱性环境中变性和复性行为的差异提取得到的质粒DNA通常需要进行浓度和纯度检测，最常用的方法是紫外分光光度计测定DNA纯度通过A260/A280比值评估，理想范围为

1.8-

2.0比值低于

1.8表示蛋白质污染，高于

2.0则可能有RNA污染A260/A230比值反映多糖或酚类污染，应大于

1.5高质量的质粒DNA应在凝胶电泳上呈现清晰的条带，没有拖尾或降解现象凝胶电泳原理Agarose分子筛分原理影响因素与参数选择琼脂糖凝胶形成三维网络结构，孔径大小由凝胶浓度决定凝胶浓度是关键参数，直接决定分离范围

0.8%适合分离1-DNA分子在电场作用下，带负电的磷酸骨架向正极移动，同时10kb片段；

1.5-

2.0%适合分离

0.2-3kb片段；3%以上可分离小受到凝胶网络的阻力，形成分子筛分效应至100bp的片段小分子DNA通过凝胶孔隙较为容易，移动速度快；大分子DNA电压选择也很重要低电压（1-5V/cm）分离效果好但耗时长；受阻力大，移动缓慢因此，不同大小的DNA片段在电泳过程高电压分离快但分辨率降低，且易产生凝胶热效应导致条带弥中被分离，形成独立的条带散缓冲液浓度、电泳时间和样品加载量也会影响分离效果琼脂糖电泳是分析DNA大小和纯度的基本方法，其分辨率受多种因素影响，选择适当参数是获得清晰分离结果的关键实际操作电泳步骤与注意事项制胶准备根据目标DNA大小选择合适浓度（

0.8%-

2.0%）的琼脂糖，用1×TAE或TBE缓冲液溶解，微波加热至完全透明，冷却至约60℃后加入核酸染料（如溴化乙锭或安全染料GelRed），倒入封好一端的电泳槽，插入梳子，室温凝固样品处理与加样DNA样品与6×上样缓冲液按5:1混合，混合均匀后小心加入凝胶孔穴，避免气泡和溢出同时加入适当的DNA分子量标记物（Marker）作为参照每个孔的加样量应保持一致，通常为5-20μl电泳参数设置将装有凝胶的电泳槽放入电泳仪，加入与制胶相同的电泳缓冲液至没过凝胶表面约2-3mm连接电极（DNA向正极迁移），设置适当电压（通常80-120V），运行时间根据片段大小和分离要求调整，一般30-60分钟成像与分析电泳结束后，将凝胶置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照（注意使用紫外光时必须佩戴防护面罩）根据标准分子量Marker比较样品DNA片段大小，并进行半定量分析良好的电泳结果应显示清晰锐利的条带，无拖尾或弥散现象核酸定量分析方法紫外分光光度法荧光染料法基于核酸在260nm处有最大吸收的原使用特异性结合DNA或RNA的荧光染理，利用分光光度计测定样品在料（如PicoGreen、RiboGreen），260nm处的吸光度（A260）纯DNA测定荧光强度计算核酸浓度溶液在A260=1时浓度约为50μg/ml，优点特异性高，可区分双链DNA、纯RNA为40μg/ml单链DNA和RNA，灵敏度高（可检测优点快速简便，无需消耗样品；缺ng/ml级浓度）；缺点需要标准曲点不能区分DNA和RNA，受蛋白线，操作相对繁琐，荧光染料光敏性质、酚等杂质影响大强分子量标准品应用在凝胶电泳中使用已知浓度和大小的DNA分子量标准品（Marker），通过比较样品与标准品条带亮度进行半定量分析优点可同时获得大小和浓度信息，直观；缺点准确度较低，仅适用于粗略估计，需要成像设备和分析软件辅助哺乳动物基因组的提取DNA样品处理组织样品切碎或细胞样品收集，加入裂解缓冲液和蛋白酶K，37-55℃消化数小时至过夜完全裂解的样品应变得透明或半透明，无明显颗粒物有机溶剂抽提加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合液，充分振荡混匀后离心分层小心吸取上层水相（含DNA）转入新管，避免接触中间蛋白质层此步骤可重复1-2次，以增加纯度3沉淀DNA水相中加入1/10体积3M醋酸钠（pH

5.2）和2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻混匀，可见白色DNA纤维出现-20℃沉淀30分钟后离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤1-2次4酶处理RNA将DNA溶解于TE缓冲液，加入RNase A（终浓度10-20μg/ml），37℃孵育30分钟降解RNA处理后可再次进行有机抽提和乙醇沉淀，获得高纯度基因组DNA重组原理与方法DNA限制酶切割片段纯化特异性识别并切割特定DNA序列分离并回收目标DNA片段重组体鉴定连接DNA验证目的基因正确插入连接酶催化片段末端连接限制性内切酶是DNA重组的关键工具，这些酶能识别DNA上特定的核苷酸序列（通常为4-8bp的回文序列），并在特定位点切割双链DNA根据切割方式，限制酶可产生粘性末端（错开的单链突出）或平末端（平齐的双链）DNA连接酶（如T4DNA连接酶）能催化DNA片段之间的连接反应，形成完整的磷酸二酯键连接酶利用ATP水解释放的能量，将一个DNA片段3端的羟基与另一个片段5端的磷酸基连接粘性末端连接效率远高于平末端连接，是构建重组DNA分子的首选方法酶切反应流程要点反应体系组分反应条件优化单酶切与双酶切比较标准酶切反应体系（20μl）通常包含反应温度大多数限制酶的最适温度为单酶切操作简单，但在构建重组体时可37°C，但部分酶需要特定温度（如25°C能增加自连接概率•DNA样品（

0.2-1μg）或65°C）双酶切可产生不同的粘性末端，降低自•10×反应缓冲液（2μl）反应时间通常1-4小时，过夜反应可提连接可能性，提高定向克隆效率•限制酶（1-10U，不超过总体积的高切割完全性，但需注意某些酶存在星1/10）双酶切挑战需寻找在同一缓冲液中活状活性（非特异性切割）性良好的酶对；如不兼容，需先后进行•无核酸酶水（补足至20μl）缓冲液选择不同酶可能需要特定的离两次单酶切，中间进行DNA纯化某些情况下还需加入BSA（牛血清白蛋子强度和pH条件，必须使用配套缓冲白，终浓度

0.1mg/ml）以稳定酶活性液，双酶切时需选择兼容性最佳的缓冲液片段连接与连接产物分析DNA1连接酶使用要点T4T4DNA连接酶需要ATP作为能源，对温度敏感，应保存在-20℃，使用时置于冰上长时间存放的ATP可能降解，影响连接效率，建议定期更换新鲜的10×连接缓冲液连接酶浓度过高可能导致非特异性连接，每20μl反应使用1-5个单位通常足够2连接反应体系设定载体与插入片段的摩尔比是关键参数，通常维持在1:3至1:5之间可根据公式摩尔比=（插入片段ng数/插入片段bp数）÷（载体ng数/载体bp数）进行计算总DNA量建议在50-200ng之间，反应体积保持在10-20μl，以确保DNA片段充分接触连接反应条件优化粘性末端连接通常在室温（22-25℃）反应1小时或16℃过夜；平末端连接效率低，需16℃反应4-16小时某些难连接的片段可尝试添加PEG（聚乙二醇）提高局部DNA浓度，或进行热循环连接（30秒65℃，5分钟4℃，循环12-15次）以增加连接效率连接效率评估方法转化是检验连接效率最直接的方法，同时设置不加插入片段的自连接对照和未切载体对照另外，可取少量连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现大于原始片段的连接产物条带对于较大片段，可设计PCR引物跨越连接位点进行连接成功的快速验证实验原理PCR变性（）Denaturation95℃加热使双链DNA分离为单链退火（）Annealing50-65℃下引物与模板特异性结合延伸（）Extension372℃下DNA聚合酶合成新链聚合酶链式反应（PCR）是体外扩增特定DNA片段的强大技术，通过模拟DNA复制过程，在短时间内产生大量目标序列拷贝PCR反应需要几个关键组分模板DNA（含有目标序列）、一对特异性引物（界定扩增区域的边界）、耐热DNA聚合酶（如Taq酶）、dNTPs（四种脱氧核苷酸，提供构建新DNA链的原料）以及适当的缓冲液和二价镁离子PCR过程是通过温度循环控制的变性阶段打开DNA双螺旋；退火阶段允许引物结合到互补序列；延伸阶段由DNA聚合酶从3端向5端合成新链每完成一个循环，目标序列数量理论上翻倍，通常进行25-35个循环可获得足量产物扩增关键参数PCR引物设计原则⁺浓度影响故障分析Mg²PCR引物设计是PCR成功的关键因素理想镁离子是Taq聚合酶活性的必需辅因子，无产物可能原因包括模板DNA质量的引物长度为18-25个核苷酸，GC含量同时影响引物与模板的结合特异性通差、引物设计不当、程序设置错误或关40-60%引物的Tm值（理论熔点温常PCR反应中Mg²⁺浓度为

1.5-

3.0mM，键组分遗漏解决方法检查所有组度）应该在55-65℃之间，一对引物的浓度过低会导致产量不足，过高则可能分，降低退火温度，延长延伸时间，增Tm值差异不应超过5℃产生非特异性扩增产物加循环数，或使用巢式PCR策略引物应避免自身互补或引物间互补结dNTPs和EDTA等成分会螯合Mg²⁺，实非特异性产物原因可能是退火温度过构，特别是3端互补可导致引物二聚体形际可用浓度可能低于添加量当PCR效低、Mg²⁺浓度过高或引物特异性不足成引物3端最好以G或C结尾，增强与果不佳时，可尝试优化Mg²⁺浓度，建议解决方法提高退火温度，使用热启动模板结合的稳定性在进行克隆时，可以

0.5mM为梯度进行摸索，找出最佳浓聚合酶，优化引物设计，或采用梯度在引物5端添加限制酶识别位点或其他功度PCR找到最佳条件能序列产物纯化与产物鉴定PCR柱纯化法凝胶回收法产物鉴定方法利用硅胶膜对DNA的选择先通过琼脂糖凝胶电泳分琼脂糖凝胶电泳是最基本性吸附原理，在高浓度盐离PCR产物，切取目标条的鉴定方法，可确认产物溶液中DNA结合到硅胶带，然后溶解凝胶并提取大小和纯度对于克隆用膜，洗涤去除引物和杂质DNA优点可选择性回途，可进行酶切分析验证后，用低盐或无盐缓冲液收特定大小的DNA片段，特定位点测序是最直接洗脱DNA优点操作简去除非特异性产物，但回的鉴定方法，可确认序列便快速，回收率高（70-收率相对较低（30-完整性和准确性，尤其重90%），适合直接纯化单70%），且操作更为繁要的是检测是否有突变一PCR产物琐纯化PCR产物是后续实验（如克隆、测序、酶切分析）的必要步骤，可去除残留的引物、dNTPs、盐和酶等杂质，提高下游实验的成功率选择何种纯化方法取决于PCR产物的特性和后续应用的要求纯化后的PCR产物应立即使用或-20℃保存，避免反复冻融导致DNA降解核酸的回收方法琼脂糖凝胶电泳回收柱法快速富集适用于混合样品中分离特定大小的DNA片基于DNA在不同条件下与硅胶的结合特性，段首先进行电泳分离，在紫外灯下快速切在高浓度盐和适当pH条件下，DNA分子可选取含目标条带的凝胶块（注意长时间紫外择性地结合到硅胶基质杂质通过洗涤缓冲照射会损伤DNA）将凝胶块溶解于含有碘液去除，然后用低盐或无盐缓冲液（如TE或化钠或高浓度盐的缓冲液中，然后利用硅胶水）洗脱纯化的DNA膜吸附DNA，洗涤后洗脱纯化的DNA该方法操作简便，回收率高（70-90%），特关键步骤包括精确切割目标条带，完全溶别适合纯化PCR产物、酶切DNA和质粒制解凝胶，控制洗脱体积以获得适当浓度回备一些改进的柱包含特殊材料可选择性回收率通常在30-70%之间，大片段（10kb）收不同大小的DNA片段，如去除100bp的回收效率较低引物和dNTPs，保留大片段DNA纯化产物应用领域纯化的核酸可用于多种下游应用，包括分子克隆（构建重组质粒）、DNA测序（需要高质量纯化产物）、体外转录（生产RNA探针）、转化和转染（需要高纯度的DNA）、酶促反应（如连接、末端修复）等不同应用对纯度和浓度要求不同，例如测序需要高纯度且无盐残留；克隆需要完整的DNA末端；转染需要内毒素含量极低的制剂根据具体应用选择合适的纯化方法至关重要外源基因在大肠杆菌中的诱导表达表达系统组成诱导因子作用机制诱导系统使用要点IPTG典型的原核表达系统包含几个关键元在lac操作子控制的表达系统中，转录受IPTG诱导典型步骤菌液培养至对数生件强启动子（如T

7、tac或lac启动抑制蛋白LacI的调控LacI结合到操作长期（OD600约

0.6-

0.8），加入IPTG至子），有效的核糖体结合位点，目的基子区域，阻止RNA聚合酶启动转录终浓度

0.1-1mM，继续培养3-6小时诱因的正确编码序列，以及终止子信号IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）作为导温度是关键参数，通常37℃有利于高此外，表达载体通常还携带抗生素抗性乳糖类似物，能与LacI结合，导致其构水平表达，但容易形成包涵体；降低至标记、复制起点和标签序列（如His标象改变而无法与操作子结合，从而解除16-30℃可减少包涵体形成，获得更多可签、GST标签）用于蛋白纯化抑制，启动目的基因转录溶性蛋白，但表达量可能降低不同表达载体和宿主菌株组合有特定优势pET系统在T7RNA聚合酶控制下表达量极高；pGEX系统产生GST融合蛋白便于亲和纯化；BL21DE3菌株缺乏主要蛋白酶，提高目的蛋白稳定性；Rosetta菌株含有稀有密码子tRNA，有利于表达含有稀有密码子的异源基因表达蛋白产物分析菌体收集样品制备诱导后离心收获细胞裂解细胞释放蛋白质结果分析电泳分离考马斯亮蓝染色或免疫检测SDS-PAGE分离蛋白质SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是分析重组蛋白表达的基本方法SDS使蛋白质变性并赋予均一负电荷，使蛋白质主要按分子量分离通过比较诱导前后样品，可观察目的蛋白表达带的出现考马斯亮蓝染色可显示总蛋白谱，检测限约为

0.1-

0.5μg蛋白Western blot免疫印迹技术结合了电泳分离和抗体特异性识别，灵敏度高（可检测ng级蛋白）实验流程包括SDS-PAGE分离、转膜（将蛋白转移至PVDF或硝酸纤维素膜）、封闭（减少非特异性结合）、抗体孵育（一抗识别目的蛋白，二抗结合酶或荧光团）、显色检测（根据二抗标记物类型选择适当的显色方法）免疫印迹（）原理及流程Western blot电泳分离SDS-PAGE将蛋白质按分子量分离转膜电转移将蛋白质从凝胶转至膜上封闭用BSA或脱脂奶粉封闭非特异性位点抗体杂交特异性一抗和标记二抗顺序孵育信号检测根据标记物类型进行显影或发光检测Western blot是检测特定蛋白质表达的高灵敏度技术，其核心原理是利用抗体特异性识别目标蛋白转膜是关键步骤，常用的半干转法适用于大多数蛋白质，湿转法则更适合大分子量蛋白转膜效率受多种因素影响，包括凝胶浓度、转膜时间、电流大小和缓冲液组成化学发光检测是目前最常用的信号检测方法，通常使用辣根过氧化物酶HRP标记的二抗，在发光底物存在下产生光信号该方法灵敏度高，可检测pg级别的蛋白质，且可进行多次曝光以获得最佳信号荧光标记二抗则提供更好的定量能力和多重检测可能性，但需要特殊的荧光成像设备的提取及定量RNA法基本原理污染防控TRIzol RNaseTRIzol是一种含有异硫氰酸胍和酚RNA实验最大挑战是防止RNase的单相溶液，能有效裂解细胞并同污染RNase极其稳定且普遍存时抑制RNase活性加入氯仿在，必须采取严格措施使用后，样品分离为水相（含DEPC处理的水和无RNase试剂；RNA）、中间相（含蛋白质）和所有器材用

0.1%DEPC水浸泡或有机相（含DNA和脂质）RNA180℃烘烤处理；全程戴手套，避从水相中用异丙醇沉淀并纯化，整免触摸可能接触样品的表面；使用个过程能高效分离RNA、DNA和专用于RNA工作的试剂和器材，蛋白质避免交叉污染定量方法RNA分光光度法是常用的RNA定量方法，基于RNA在260nm处的最大吸收纯RNA溶液A260=1对应约40μg/ml的浓度A260/A280比值评估纯度，理想值为

1.8-

2.0；A260/A230比值反映多糖或酚污染，应大于

2.0荧光染料法（如RiboGreen）提供更高灵敏度和特异性，适合低浓度样品的准确定量样品质量检测RNA紫外分光比值分析凝胶电泳完整性检测紫外分光光度计测定RNA样品在不同波长的吸光度是评估RNA琼脂糖凝胶电泳是评估RNA完整性的金标准哺乳动物总RNA纯度的基本方法A260/A280比值是判断RNA是否被蛋白质污在变性条件下电泳应显示清晰的28S和18S核糖体RNA条带，且染的重要指标，理想值应在

1.8-

2.0之间低于

1.8表明有蛋白质28S:18S条带亮度比约为2:1条带弥散或缺失表明RNA已降污染，高于

2.1可能含有过量游离核苷酸解A260/A230比值反映样品是否含有多糖、酚类或盐类污染物，更先进的方法如毛细管电泳系统（如Agilent Bioanalyzer）能纯净RNA的A260/A230比值应大于

2.0此外，在220-350nm提供RNA完整性数值（RIN值），范围1-10，值越高表示RNA范围内的吸收曲线应呈现典型形状，无异常峰值完整性越好高质量RNA的RIN值应≥7，用于敏感实验如测序或微阵列分析应≥8RNA的质量直接影响下游实验结果的可靠性降解的RNA会导致RT-PCR、测序或芯片分析等实验失败或产生误导性结果在进行重要实验前，必须使用上述多种方法全面评估RNA样品质量，确保实验成功与差异显示RT-PCR mRNA逆转录RNA逆转录过程将RNA转换为cDNA，是RT-PCR的第一步通常使用逆转录酶如MMLV-RT或AMV-RT在适当缓冲液中进行反应引物选择包括oligodT引物（结合mRNApoly-A尾，适合全长cDNA合成）；随机引物（6-9个随机核苷酸，可转录任何RNA区域，包括无poly-A尾的RNA）；或基因特异性引物（提高特异性，但仅转录目标序列）扩增cDNA使用常规PCR方法扩增特定cDNA片段引物设计应跨越内含子，以区分基因组DNA污染和真正的cDNA产物根据目标基因表达量和下游应用需求，通常进行25-35个循环PCR产物可通过凝胶电泳、实时PCR或测序等方法进行分析差异表达分析mRNA差异显示技术用于比较不同样品间的基因表达差异差异显示PCRDD-PCR使用多种引物组合扩增cDNA池中的片段子集，在高分辨率凝胶上分离后，可视化比较不同样品间的条带模式差异条带可切胶回收、克隆和测序鉴定现代方法如RNA-Seq和芯片分析提供了更全面的差异表达谱差异表达实验思路mRNA实验设计与材料选择分析方法与数据处理差异表达实验通常比较两种或多种生物条件下的基因表达变化传统差异显示PCR使用多组引物扩增并在变性PAGE胶上分离产以正常与荷瘤小鼠比较为例，需要匹配背景的正常小鼠和植入特物，然后银染或放射性标记显示现代方法包括实时定量PCR定肿瘤的小鼠实验设计需要考虑样本数量（通常每组≥3）、（针对已知基因的表达定量）、基因芯片（检测数千基因同时表样本匹配度（年龄、性别、遗传背景）和组织选择（目标器官、达）和RNA测序（全面无偏检测转录组）肿瘤组织及周边区域）数据分析关键步骤原始数据质控，去除低质量读数；数据标准样本收集需在相同条件下进行，立即冷冻或RNA保护液处理，化，校正技术和生物变异；差异表达分析，使用统计方法（如t最大限度减少RNA降解组织细胞异质性问题可通过激光捕获检验、ANOVA或更复杂的DEseq

2、EdgeR）识别显著变化基显微切割技术获取特定细胞群因；功能富集分析，确定变化基因的生物学功能或通路实验和对照组的对比分析是差异表达研究的核心成功的实验需要严格控制所有变量，只让研究因素（如肿瘤存在）变化，同时进行合适的生物学重复以确保结果可靠性差异表达的验证通常需要使用多种方法，如RT-qPCR、Western blot或原位杂交等印迹原理与流程Southern制备与酶切1DNA提取高分子量基因组DNA，用限制酶完全酶切，产生不同大小的DNA片段酶切完全性对结果解读至关重要，通常需要过夜消化以确保完全酶切凝胶电泳分离在

0.7-

1.0%琼脂糖凝胶上分离酶切产物，电压通常控制在1-5V/cm分离时间根据目标片段大小调整，通常需要3-6小时甚转膜与固定至过夜，以获得良好分离凝胶用碱性变性液处理（使DNA变为单链），然后通过毛细作用或真空转移系统将DNA转移到尼龙膜上转移通常需要12-24小时转移后，DNA通过UV交联或烘烤（80℃，2小时）固定在膜预杂交与杂交上膜在预杂交液中封闭非特异性结合位点，然后加入标记的探针（与目标序列互补的DNA片段）进行杂交杂交温度和时间取决洗膜与信号检测于探针特性，通常为42-65℃，12-24小时杂交后用不同严苛度的洗涤液去除非特异性结合的探针根据探针标记方式（放射性、化学发光或荧光）选择相应的检测方法信号强度与目标序列数量成正比测序技术基础DNA测序法原理高通量测序技术Sanger基于链终止法，使用含有四种dNTPs和少量第二代测序（NGS）基于边合成边测序原不同荧光标记的ddNTPs（双脱氧核苷酸）理，包括Illumina（桥式PCR扩增，可逆终的PCR反应当ddNTP掺入DNA链时，因缺止子测序）、Ion Torrent（检测氢离子释少3-OH基团，链延伸终止产生一系列不放）等平台能同时测序数百万至数十亿同长度的DNA片段，每个片段末端标记特定DNA片段，但读长较短（75-300bp）碱基的荧光通过毛细管电泳分离片段，根第三代测序技术如PacBio（单分子实时测据荧光信号顺序读取碱基序列序）和Oxford Nanopore（纳米孔测序）优点读长较长（700-1000bp），准确率高能产生超长读长（10-100kb），有助于组装（

99.9%）；缺点通量低，成本高，不适复杂区域和检测结构变异，但准确率相对较合大规模测序低，需要高覆盖度或与短读长数据结合使用实验室常见测序流程样品制备PCR产物或质粒DNA纯化，确保无引物、dNTPs等杂质；浓度测定，调整至测序要求（通常10-50ng/μl）；加入相应引物测序反应商业测序服务通常只需提供纯化的模板和引物；自行测序则需要进行测序反应、产物纯化和电泳分析数据分析包括质量评估、序列拼接、比对和注释等步骤，可使用各种生物信息学工具完成分子生物学实验设计原则科学问题明确实验目标清晰可验证严格对照设置排除非特异性影响因素统计分析可靠保证实验结果可重复成功的分子生物学实验设计始于明确的科学假说好的假说应具有可验证性，能够通过实验产生的数据明确接受或拒绝实验设计时应遵循简单原则，每次实验只改变一个变量，保持其他条件一致，以确保能够正确解释结果对照组设计是实验成功的关键阴性对照用于排除背景干扰和非特异反应；阳性对照确认实验系统正常运行；处理组和对照组之间应只有一个变量不同，以确保观察到的差异确实来源于研究因素生物学重复（使用不同样本）和技术重复（同一样本多次测量）都是必要的，前者评估生物变异，后者评估方法可靠性荷瘤小鼠差异显示设计案例mRNA样本准备选择同源背景小鼠，随机分为对照组和荷瘤组，荷瘤组皮下接种特定肿瘤细胞肿瘤生长至预定大小（通常约1cm³）后，安乐死小鼠，迅速分离肿瘤组织、瘤旁组织和对照组相应组织，立即液氮速冻并-80℃保存提取与质控RNA使用TRIzol试剂从冷冻组织中提取总RNA，进行DNase I处理去除基因组DNA污染通过紫外分光光度计测定浓度和纯度（A260/A280比值），琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性（28S:18S比值约2:1）合成与分析cDNA PCR使用oligodT引物和逆转录酶将mRNA转换为cDNA针对感兴趣的基因设计特异性引物，进行RT-PCR或RT-qPCR分析选择合适的内参基因（如GAPDH、β-actin）进行表达标准化对于全局分析，可采用RNA-Seq或芯片技术数据分析与验证对差异表达基因进行生物信息学分析，包括功能富集、通路分析和蛋白互作网络构建选择关键差异基因通过独立样本集使用不同方法（如Western blot、原位杂交）进行验证，确认表达变化的可靠性数据分析与实验结果解读数据定量化方法统计分析方法选择凝胶图像定量使用ImageJ等软件测量条带灰度值，扣除背景t检验比较两组数据均值差异，要求数据服从正态分布且方差后进行相对定量对于条带饱和情况，需进行梯度稀释样品重新齐性双样本t检验用于独立组间比较，配对t检验用于处理前后测定比较实时荧光定量PCR通过阈值循环数Ct计算相对表达量，常用方差分析ANOVA比较三组或以上数据，确定组间是否存在2^-ΔΔCt法进行分析确保扩增效率接近100%，使用合适内参显著差异单因素ANOVA分析单一变量影响，双因素或多因素基因，并包含无模板对照和阴性对照ANOVA考察多个变量及其交互作用蛋白质点图分析Western blot条带或蛋白质组学点图通过专非参数检验当数据不符合正态分布时使用，如Mann-业软件定量，需设置适当的归一化标准和一致的定量区域Whitney U检验（t检验的非参数替代）或Kruskal-Wallis检验（ANOVA的非参数替代）实验结果解读需要客观全面，避免选择性报告有利结果而忽略不利数据显著性水平通常设定为p

0.05，但应注意统计显著性不等同于生物学意义结果中的异常值处理需谨慎，剔除前应有充分理由，且必须明确报告重复性是可靠结果的基础，独立实验重复3次以上才有足够说服力实验报告撰写与展示规范PPT实验报告结构数据图表规范展示技巧PPT标准实验报告包含以下图表应独立成篇，包含PPT应采用简洁风格，部分标题（简洁反映完整图例说明；坐标轴每页不超过7行文字；研究内容）；摘要必须标明单位；误差线标题字号24-36pt，正（200字以内概括主要应注明代表标准差SD文不小于18pt；图片分发现）；引言（研究背还是标准误SEM；对辨率高，大小适中；配景和目的）；材料与方比组使用不同颜色或图色方案专业协调（避免法（详细描述实验步案区分，保持一致性；过于鲜艳）；演示逻辑骤，确保可重复性）；显微图像需标注比例清晰，先介绍问题和方结果（客观呈现数据，尺；Western blot应包法，再展示结果，最后不包含解释）；讨论括分子量标记；组学数总结结论和意义；演讲（分析结果含义，与已据宜使用热图展示；统时间控制合理，留出讨有研究比较）；参考文计显著性用*表示并注论时间；准备额外幻灯献（引用格式统一）明p值标准片应对可能的问题实验室主要常见问题解析样品降解处理策略假阳性原因与消除RNA降解是最常见问题，预防措施包PCR假阳性常见原因包括实验室环境括样品快速处理，避免反复冻融；使或试剂污染、引物二聚体形成、非特异用RNA保护剂（如RNAlater）；所有性扩增防范措施设立独立的PCR准溶液和器材确保无RNase；加入RNase备区域；使用UV照射处理试剂和器抑制剂DNA降解较少见，但应避免剧材；设置无模板对照；优化引物设计和烈震荡（如涡旋）导致的机械剪切，避PCR条件Western blot假阳性可能免反复冻融，防止核酸酶污染蛋白质来自抗体非特异性结合，解决方法包降解可通过低温操作、添加蛋白酶抑制括严格封闭，优化抗体稀释比例，使剂混合物和避免过度加热来预防用更特异的抗体，加入竞争性肽阻断，以及包含阴性对照样品假阴性问题排查PCR假阴性常见原因模板质量差、引物设计不当、PCR组分问题或抑制剂存在排查步骤使用已知阳性对照确认系统工作正常；梯度PCR优化条件；检查所有组分新鲜度；稀释模板减少抑制剂影响Western blot假阴性原因蛋白质表达量低、转膜效率差、抗体失效或显色不足解决方法增加上样量，优化转膜条件，使用新鲜抗体，延长显色时间，或转用更灵敏的检测系统分子克隆过程中的失败案例分析电泳条带异常分析转化效率低下分析DNA电泳出现弥散条带可能是由于样品降解、过度加载或电压感受态细胞质量是影响转化效率的首要因素细胞制备过程中应过高导致样品降解原因包括核酸酶污染、不当储存或过度机械确保细胞处于对数生长期，避免过度培养；CaCl₂浓度和冰浴时力破坏；解决方法是确保无酶环境，添加EDTA螯合金属离子，间需精确控制；感受态细胞应避免反复冻融避免反复冻融连接反应问题也是常见原因低效连接可能由于载体插入片段条带缺失可能是PCR失败、DNA浓度过低或染色不足PCR失败比例不适、DNA末端质量差或连接酶活性低导致优化策略包常见原因包括模板质量差、引物特异性低、退火温度不适或关键括调整摩尔比至1:3-1:5，确保DNA末端完整，使用新鲜ATP组分遗漏；排查步骤是分别检查每个组分，使用阳性对照确认反和连接酶，延长连接时间，或尝试不同连接温度（16℃过夜或应系统，优化PCR条件室温1小时）转化过程中，热激时间和温度至关重要，通常42℃精确处理45-90秒；转化后应提供足够复苏时间（通常1小时）让细胞表达抗性基因；筛选培养基抗生素浓度过高也会导致表观转化效率降低杂带与不可预期产物处理PCR问题识别凝胶电泳鉴定非特异性扩增条件优化调整退火温度和Mg²⁺浓度体系改进使用梯度PCR或触摸板PCR技术结果验证目标条带测序确认特异性引物特异性是PCR成功的关键因素非特异性扩增通常表现为多条带或条带大小与预期不符优化引物设计的策略包括确保引物与目标区域特异性结合，避免与基因组其他区域高度同源；引物长度保持在18-25个核苷酸，GC含量40-60%；使用引物设计软件（如Primer3）检查二级结构和二聚体形成可能；对于复杂模板，考虑使用巢式PCR或添加增强剂如DMSO、甜菜碱等模板污染是另一常见问题，特别是高灵敏度PCR检测防止污染的关键措施包括物理隔离（设立独立的PCR准备区，与产物分析区严格分开）；使用UV辐射或次氯酸钠处理工作台面和设备；使用滤芯吸头和专用试剂；避免开盖后在PCR产物上方操作；定期监测环境污染；设置多重阴性对照过多PCR循环（35次）会增加非特异性产物和引物二聚体，建议优化条件后使用最少必要循环数数据重复与实验误差控制生物学重复技术重复使用独立来源的样本进行完全独立的实验，2同一样本的多次测量，评估方法可靠性和操评估生物变异一般要求至少3-5个生物学重作误差通常进行2-3次技术重复，取平均值复，某些高变异性实验可能需要更多用于后续分析盲法测试随机化处理数据收集者不知道样本分组信息，减少主观随机分配样本到实验组和对照组，最小化选偏见特别适用于需要人工判读或评分的实择偏差样本处理顺序也应随机化，避免系验统性误差批量操作/流水线管理是控制实验误差的有效策略将样本分批处理时，每批应包含所有实验组的代表性样本，避免批次效应影响结果解释标准化操作流程SOP确保实验一致性，应详细记录每一步骤，包括试剂配方、仪器设置和时间控制关键节点设置平行样品是识别异常值的重要手段对于复杂多步骤实验，在重要步骤后检查中间产物质量，及时发现问题实验数据分析应使用合适的统计方法，如离群值检验识别异常数据点，方差分析评估组间差异显著性精确报告实验误差，使用标准差SD表示样本分散程度，标准误SEM表示均值估计精确度与创新研究结合的实验模块示例基因编辑实验单细胞转录组分析CRISPR将前沿CRISPR-Cas9技术引入教学实验，结合单细胞分离技术和高通量测序，学生学生设计sgRNA靶向特定基因，构建表达学习从细胞悬液中分离单个细胞，制备单载体，转染细胞并检测编辑效率通过荧细胞文库，并使用生物信息学工具分析细光报告系统可视化编辑结果，同时学习基胞异质性因功能和生物伦理该模块强调微量样品处理技能，数据分析该模块整合了分子克隆、细胞培养和功能能力和结果可视化，让学生理解细胞群体分析技术，同时引入生物信息学工具进行中的功能多样性，培养跨学科思维和解决靶点设计和脱靶效应预测，体现多学科交复杂生物学问题的能力叉特点学生自主选题研究在掌握基本技能后，学生组成小组提出原创性研究问题，设计实验方案，在教师指导下开展短期研究项目例如探究特定环境因素对基因表达的影响，或筛选具有潜在应用价值的基因该模块培养学生的科研创新能力、团队协作和科学交流能力成果可通过小型学术研讨会展示，模拟真实科研环境，激发研究兴趣经典实验与科研成果回顾1重组技术DNA1972年，Paul Berg团队首次创建重组DNA分子，将SV40病毒DNA与λ噬菌体DNA连接这一突破奠定了基因工程基础，Berg因此获得1980年诺贝尔化学奖2限制酶发现Werner Arber、Hamilton Smith和Daniel Nathans发现并应用限制性内切酶，为DNA操作提供了分子剪刀，三人共享1978年诺贝尔生理学或医学奖3技术发明PCR1983年，Kary Mullis发明聚合酶链反应技术，实现了DNA的体外扩增，彻底改变了分子生物学研究方法这一发明使Mullis获得1993年诺贝尔化学奖4测序革命DNAFrederick Sanger开发的双脱氧链终止法和Walter Gilbert发展的化学裂解法奠定了DNA测序基础，两人因此分享1980年诺贝尔化学奖新一代测序技术推动了基因组学蓬勃发展分子生物学实验室开放与管理实验室分区管理进出管理制度样品台账与试剂标签分子生物学实验室通常划建立严格的实验室准入制建立完善的样品管理系分为多个功能区核酸提度，新成员必须完成安全统，所有样品必须标记清取区、PCR准备区、扩增培训后方可独立操作所晰，包含名称、浓度、制产物分析区、细胞培养区有人员进入实验室须穿实备者和日期重要样品保和仪器设备区各区域应验服、戴手套，离开时须存位置记录在实验室共享物理隔离，防止交叉污脱下防护装备设置访客数据库中试剂标签必须染特别是PCR前准备和登记制度，非实验室人员包含完整信息，特别是有产物分析必须严格分开，必须在专人陪同下参观毒有害试剂需标明危险等单向工作流程从干净区每日最后离开者负责检查级和处理方法共用试剂到污染区，禁止反向流设备关闭、水电气安全和设立使用记录本，及时补动门窗锁闭情况充和更新冰箱内样品定期清理，过期样品妥善处置教学实验安全文化建设示范与培训同步安全设施与检查事故案例分析安全文化建设首先体现在教师的示范作实验室必须配备完善的安全设施，包括将真实实验室事故案例纳入安全教育内用上指导教师必须严格遵守实验室安洗眼器、紧急喷淋、灭火器、急救箱和容，深入分析事故原因、后果和防范措全规范，以身作则，在实验示范中强调化学品泄漏处理套件等建立定期安全施例如误用试剂引起的化学反应、安全操作要点培训内容应包括基本安检查制度，每月检查安全设施功能和化生物样品污染事件、实验室火灾等通全知识、特定危险源识别、紧急情况处学品存储情况，每周检查废弃物处理情过案例讨论，提高学生风险意识，培养理流程和废弃物分类处理等采用多种况制作安全检查清单，明确责任人，安全第一的实验习惯每次事故案例学培训方式如讲座、视频、实操演练相结检查结果记录存档，发现问题及时整习后，学生需提交安全反思报告，强化合，确保学生充分理解并掌握安全操作改安全意识内化技能综合性实验考核与能力提升模拟科研课题设计全流程实验操作考核综合性实验考核可设计为小型科研项目模式，要求学生根据给定操作考核覆盖多个核心技术，如从基因组DNA提取到目标基研究方向，自主设计实验方案，包括文献调研、假设提出、实验因PCR扩增，再到克隆、表达和功能验证的完整流程考核过程设计、材料准备、时间规划和预期结果分析等内容中设置关键检查点，如电泳结果质量、转化效率计算、表达产物检测等评分标准包括方案可行性（实验设计逻辑性、控制组设置合理性）、创新性（是否有独特思路或改进）、文献支持（文献引用评分维度包括实验记录完整性（记录是否详细准确）、操作规充分性和相关性）、预算合理性和安全考虑等方面范性（是否严格遵循标准流程）、问题解决能力（遇到困难时的应对策略）、结果可靠性（实验结果是否可重复）和时间管理能力（能否在规定时间内完成任务）能力提升策略强调做中学，通过增加实验难度梯度和减少指导干预，培养学生独立思考和解决问题的能力鼓励学生记录实验过程中的每一个细节，分析失败原因并改进方法此外，引入同伴评议环节，学生互相评价实验报告，培养批判性思维和学术交流能力未来发展与学科前沿细胞1单细胞组学分析个体细胞的基因表达和表观遗传特征3D空间组学保留空间位置信息的基因表达分析纳米纳米孔测序直接读取单分子核酸序列的长读长技术AI人工智能辅助实验设计优化与海量数据智能分析分子生物学技术正经历前所未有的变革，单细胞组学技术突破了传统组织平均水平分析的局限，揭示细胞异质性；空间组学保留了基因表达的空间位置信息，为理解复杂组织中的基因调控提供新视角纳米孔测序等长读长技术极大提高了基因组组装质量，特别是对复杂重复区域的解析能力人工智能在分子生物学中的应用日益广泛，从实验设计优化、自动化实验操作到海量数据分析，都展现出强大潜力基因编辑技术不断精进，靶向性和安全性显著提高，为基因治疗开辟新途径这些前沿技术将极大拓展分子生物学的研究深度和广度，推动精准医疗、合成生物学等领域快速发展总结与展望技术掌握科研思维1核心实验技能熟练应用批判性思考与问题解决持续学习创新能力跟踪前沿技术与知识更新实验设计与方法改进通过本课程的学习，您已经掌握了分子生物学实验的基本原理和核心技术，包括核酸提取、PCR扩增、分子克隆、蛋白表达与检测等这些技能为您今后的科研工作奠定了坚实基础然而，技能掌握只是起点，科研素养的培养同样重要，包括严谨的实验态度、批判性思维和创新精神分子生物学作为现代生命科学的核心学科，正在经历快速发展，新技术不断涌现我们鼓励大家保持对新知识的渴求，积极关注学科前沿，将所学技能应用于解决实际科学问题希望本课程不仅传授了实验技能，更点燃了大家对生命科学的热情，未来能为生物医药研发、农业改良、环境保护等领域做出贡献，共同推动生命科学创新发展！。