《分子生物学探针》课件

分子生物学探针分子生物学探针是现代生物医学研究中不可或缺的核心技术工具作为高校生物专业的重要课程内容，探针技术在基因检测、疾病诊断、科学研究等领域发挥着关键作用本课程将全面系统地介绍探针的基本原理、技术方法和实际应用，为学生构建坚实的分子生物学技术基础探针技术的发展历程见证了分子生物学的重大突破，从最初的放射性标记到现代的荧光检测，从单一目标检测到高通量平行分析，探针技术不断演进和完善掌握这一技术对于理解现代生物医学研究方法具有重要意义探针的基本概念核心定义识别功能分子生物学探针是一段已知探针具有高度的序列特异性，序列的核酸分子，能够通过可精确识别和定位特定的碱基配对原理与目标核酸序或序列片段DNA RNA列特异性结合检测原理通过杂交反应实现对目标序列的检测，为分子诊断和基因分析提供技术支撑探针技术的核心在于碱基配对规则，即腺嘌呤与胸腺嘧啶配Watson-Crick对，胞嘧啶与鸟嘌呤配对这种特异性配对机制确保了探针能够准确识别目标序列，同时避免与非特异性序列结合探针的长度通常在个核苷酸15-30之间，既保证了足够的特异性，又具备良好的杂交效率探针的历史与发展1年代1970探针技术首次问世，标志着分子生物学检测技术的重大突破DNA2年代1980放射性同位素标记技术成熟，提高了探针检测的灵敏度和准确性3年代1990荧光标记探针的发展，使得非放射性检测成为可能，提高了实验安全性4年代至今2000高通量探针技术和智能响应型探针的出现，推动了精准医学的发展探针技术的发展历程反映了分子生物学技术的不断进步从最初依赖放射性同位素的危险性标记方法，到现在安全高效的荧光标记技术，探针技术的每一次革新都为生物医学研究带来了新的可能性探针的分类综述按核酸类型分类按标记方式分类探针由脱氧核糖核酸构成，稳定性高放射性标记使用、等同位素•DNA•32P35S探针由核糖核酸构成，适合检测目标荧光标记使用荧光染料如、•RNA RNA•FAM Cy5寡核苷酸探针短链合成探针，设计灵活酶标记使用辣根过氧化物酶等••生物素标记利用生物素亲和素体系•-不同类型的探针各有特点和适用范围探针具有良好的稳定性，适合长期保存和重复使用；探针能够更好地模拟天然DNA RNA杂交条件；寡核苷酸探针则因其合成简便、成本低廉而广泛应用于大规模筛查标记方式的选择主要取决于实验要求的灵RNA-RNA敏度、安全性和成本考虑探针DNA结构特点主要优点探针由双链或单链化学稳定性高，不易降解，可长期DNA DNADNA构成，具有稳定的双螺旋结构，能保存；制备相对简单，成本较低；够在多种条件下保持结构完整性适合大多数杂交实验条件应用场景广泛应用于印迹、印迹、原位杂交等经典分子生物学技Southern Northern术中探针是最早开发和应用的探针类型，其稳定的化学性质使其成为分子生物学DNA实验的首选工具探针可以通过克隆、扩增或化学合成等方法制备，长DNA PCR度从几十个碱基对到几千个碱基对不等在实际应用中，探针的选择需要考DNA虑目标序列的特异性、杂交条件的严格性以及检测的灵敏度要求探针RNA体外转录合成利用、等聚合酶进行体外转录合成，获得高纯度探针T7SP6RNA RNA病毒基因组检测特别适用于病毒如流感病毒、冠状病毒等的分子诊断RNA表达分析mRNA用于检测特定基因的转录水平，研究基因表达调控机制原位杂交应用在组织切片上定位的表达部位，揭示基因的时空表达模式mRNA探针在检测目标时具有独特优势，因为杂交比杂交RNA RNA RNA-RNA DNA-RNA更加稳定和特异探针的合成虽然相对复杂，但其在病毒检测、基因表达分析等RNA领域的应用价值使其成为不可替代的工具寡核苷酸探针最优长度通常个核苷酸，平衡特异性与效率15-30熔解温度设计时需考虑值匹配Tm计算机辅助利用生物信息学工具优化序列高通量应用适合芯片技术和大规模筛查寡核苷酸探针代表了探针技术的精密化发展方向其短小的分子结构使得合成成本低廉、质量控制容易，同时也便于进行化学修饰和功能化改造在现代分子诊断中，寡核苷酸探针已成为主流选择，特别是在实时荧光定量和基因芯片技术中发挥着核心作用PCR探针的标记方法概述标记目的信号放大为探针分子添加可检测的信号分子，实通过标记物的信号放大效应，提高检测现目标序列的可视化检测的灵敏度和准确性效率影响可视化标记效率直接影响最终检测结果的可靠将分子水平的杂交事件转化为可观察的性和重现性物理信号探针标记是分子生物学检测技术的关键环节，标记方法的选择直接影响实验的成功率和结果的可靠性理想的标记方法应该具备高效率、高稳定性、低背景和易操作等特点随着检测技术的发展，标记方法也在不断改进和完善放射性同位素标记常用同位素超高灵敏度安全隐患用于标记，半衰期放射性检测可达到飞摩尔级需要专门的放射性实验室和32P DNA天，高能射线；别的检测限，是所有标记方防护设备，操作人员需接受

14.3β35S用于蛋白质标记，半衰期法中灵敏度最高的技术专业培训，废料处理严格天，低能射线，安全

87.4β性相对较高半衰期限制同位素的放射性衰减限制了标记探针的使用期限，需要定期更新尽管放射性同位素标记存在安全风险，但其无与伦比的检测灵敏度使其在某些特殊应用中仍然不可替代在需要检测极低丰度目标序列的研究中，放射性标记仍然是首选方法荧光标记安全便捷多重检测优势无放射性危险，操作简便安全；荧光信号稳定荧光染料种类不同荧光染料的激发和发射波长差异，使得在持久，便于长期保存和重复观察；检测设备相（荧光素）发射绿光，适合单重检测；同一反应体系中同时检测多个目标成为可能，对简单经济FAM发射红光，用于多重分析；用作内参大大提高了检测效率Cy5ROX标准；提供橙红色荧光信号TAMRA荧光标记技术的发展彻底改变了分子生物学检测的面貌，使得实时监测和高通量分析成为现实现代荧光染料具有更高的量子产率、更好的光稳定性和更窄的发射光谱，为精确的定量分析提供了技术保障荧光标记已成为当前分子诊断领域的主流技术酶标记法辣根过氧化物酶（）碱性磷酸酶（）HRP AP分子量小，稳定性好，催化过氧化氢氧化多种底物产生有色产催化磷酸酯水解反应，常用底物为体系，产生蓝紫BCIP/NBT物常用底物包括、等，反应产物颜色深浅与酶活性色沉淀活性不受内源性过氧化物酶干扰，特别适合组织标TMB DABAP成正比本检测标记探针广泛应用于免疫组化和原位杂交检测中，具有信碱性磷酸酶标记系统在和免疫印迹中应用广泛，HRP Westernblot号放大效应强、背景低的优点检测灵敏度高，结果稳定可靠酶标记法结合了酶催化反应的信号放大效应和比色检测的直观性，是一种经济实用的探针标记方法通过选择合适的酶底物体系，-可以实现不同灵敏度和特异性要求的检测酶标记探针在临床诊断和科研应用中都有重要地位生物素亲和素体系-超强亲和力信号放大生物素与亲和素的结合常数达一个亲和素分子可结合四个生物素分子，10^15，是已知最强的非共价结合实现信号的有效放大M^-1非放射性稳定性高避免了放射性同位素的安全隐患，操作结合复合物在极端和温度条件下仍保pH简便安全持稳定生物素亲和素体系是非放射性探针标记的经典方法，其优异的性能使其在各种杂交技术中得到广泛应用该体系不仅提供了高灵敏-度的检测能力，还具有良好的通用性，可以与多种检测方法结合使用链霉亲和素作为亲和素的改良版本，进一步提高了系统的性能探针杂交技术引言碱基配对原理基于碱基配对规则的分子识别机制Watson-Crick温度依赖性杂交条件的严格性决定了检测的特异性水平序列特异性探针与目标序列的完全互补确保检测准确性动力学过程杂交反应的速度和效率影响检测结果探针杂交技术是分子生物学的核心技术之一，其基本原理简单而精确杂交反应的成功需要考虑多个因素，包括盐离子浓度、温度、值、去垢剂浓度等严格的杂交条件可以pH提高检测的特异性，但可能降低灵敏度；而宽松的条件则相反因此，优化杂交条件是获得理想检测结果的关键印迹杂交Southern提取与酶切1DNA从样本中提取基因组，使用限制性内切酶进行特异性切割，产生不同大小的DNA片段DNA2凝胶电泳分离利用琼脂糖凝胶电泳按分子量大小分离片段，大分子迁移慢，小分子迁移快DNA转膜与固定3将分离的片段从凝胶转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，并通过烘烤或交联固定DNA UV4探针杂交检测使用标记的探针与膜上的目标序列杂交，洗脱后检测杂交信号的位置和强度DNA印迹杂交是基因分析的经典方法，能够确定特定基因在基因组中的存在、拷贝数和结构变化该技术在基因克隆、转基因检测、遗传疾病诊断等领域具有重要应用价值虽然现代技术Southern如和测序技术在某些应用中已经取代了印迹，但其在需要了解基因组结构信息的研究中仍然不可替代PCR Southern印迹杂交Northern检测特点基因表达分析技术优劣势RNA专门用于检测分子，可以确定特定定量分析特定基因在不同组织、发育阶段优势可检测大小和完整性，结果RNARNA的大小、丰度和完整性需要在或处理条件下的表达水平变化，是研究基可靠；劣势操作复杂，耗时长，灵敏度mRNA无环境中操作，防止降解因调控的重要工具相对较低，已被等技术部分替RNase RNAqRT-PCR代印迹杂交在基因表达研究中曾经是金标准方法，能够提供分子大小和表达水平的准确信息虽然现在更多使用等Northern mRNAqRT-PCR快速方法，但印迹在需要确认完整性和精确分子量的研究中仍有其独特价值该技术对于研究的剪接变体、稳定Northern RNAmRNA RNA性等具有不可替代的作用印迹简介Western蛋白质检测抗体作为探针信号检测系统虽然主要用于蛋白质检测，一抗特异性识别目标蛋白，常用化学发光、HRP-AP-但原理与核酸探针类似，都二抗结合一抗并携带检测标荧光或放射性同位素标记等基于特异性分子识别记，形成探针检测体系检测方法定量分析通过信号强度分析可以实现蛋白质的半定量或定量检测印迹虽然是蛋白质检测技术，但其探针化检测原理与核酸探针技术有很多相似之处Western抗体作为蛋白质探针，通过特异性结合实现目标蛋白的检测和定量这种技术在蛋白质研究、疾病诊断和药物开发中应用广泛，是现代生物医学研究的重要工具斑点杂交Dot blot快速检测省略电泳步骤，直接点样杂交高通量筛查可同时检测多个样本半定量分析通过信号强度比较实现经济实用成本低，操作简便斑点杂交是一种简化的杂交技术，特别适合大规模样本的初步筛查虽然无法提供分子量信息，但其快速、经济的特点使其在临床诊断、Dot blot食品检测、环境监测等领域得到广泛应用该技术常用于转基因作物检测、病原体快速诊断等需要大批量样本处理的场合通过标准品的系列稀释，还可以实现一定程度的定量分析原位杂交（）ISH组织水平定位医学病理应用在完整的组织切片中直接检测特定核酸序列的表达位置，保持在肿瘤病理诊断中用于检测癌基因和抑癌基因的表达，帮助确细胞的形态结构和空间关系可以观察基因在不同组织区域的定肿瘤类型和恶性程度在感染性疾病诊断中检测病原体核酸表达差异该技术特别适用于研究基因在器官发育过程中的时空表达模式，发育生物学研究中用于追踪特定基因在胚胎发育各阶段的表达以及病理状态下基因表达的变化变化，揭示基因功能和调控机制原位杂交技术将分子生物学检测与组织形态学观察完美结合，为理解基因功能和疾病机制提供了重要手段该技术不仅能够检测基因的表达水平，更重要的是能够确定基因表达的精确位置，这对于理解基因的生物学功能具有重要意义荧光原位杂交FISH技术原理革新结合荧光标记和原位杂交技术，使用荧光探针直接在染色体或细胞核中检测特定序列，实现了分子水平检测的可视化DNA染色体结构分析能够检测染色体数目异常、结构重排、基因扩增或缺失等遗传变异，为遗传学研究提供重要工具肿瘤诊断应用在肿瘤诊断中检测特异性基因重排，如融合基因检测用于BCR-ABL慢性粒细胞白血病诊断，基因扩增检测用于乳腺癌治疗方案选HER2择技术代表了原位杂交技术的重大突破，其高分辨率和多色检测能力使得复杂FISH的遗传分析成为可能在临床医学中，已成为染色体病诊断、肿瘤分子分型FISH的标准技术该技术还在进化生物学、比较基因组学等基础研究领域发挥着重要作用芯片技术DNA Array/探针固定化将数千个不同序列的寡核苷酸探针按规律排列固定在芯片表面，每个点位代表一个特定基因大规模平行检测同时检测数万个基因的表达水平，实现全基因组水平的表达谱分析荧光信号定量使用不同荧光染料标记样本，通过信号强度比较实现基因表达的相对定量高通量数据处理结合生物信息学分析，识别差异表达基因和生物学通路芯片技术彻底改变了基因表达研究的格局，使得全基因组水平的分析成为现实该技术DNA在疾病机制研究、药物开发、个体化医疗等领域发挥着重要作用虽然高通量测序技术在某些应用中已经超越了芯片技术，但芯片仍在特定检测项目的标准化检测中保持优势探针的设计原则熔解温度匹配序列特异性探针的值应与实验条件匹配，通常设计Tm在°范围内探针序列必须与目标序列完全互补，同时55-65C避免与非目标序列的交叉杂交避免二级结构防止探针形成发夹结构、二聚体等影响杂交效率的二级结构长度优化含量平衡根据应用需求选择合适长度，探针通GCqPCR常，原位杂交探针可达数百15-30nt bp含量应控制在之间，过高或过GC40-60%低都会影响杂交效果探针设计是确保检测成功的关键环节，需要综合考虑多个因素现代生物信息学工具如、等为探针设计提供Primer3OligoAnalyzer了强大支持，能够自动优化多个参数并预测潜在问题优秀的探针设计不仅要满足基本的物理化学要求，还要考虑实际应用中的特殊需求探针合成与修饰1化学合成流程采用固相合成法，从端向端逐个添加核苷酸，每个循环包括去保护、偶联、35封闭和氧化四个步骤2端修饰策略5可添加荧光基团、生物素、氨基等功能性基团，用于后续的检测和纯化3端修饰策略3常添加淬灭基团、磷酸基团或其他功能性分子，实现特殊的检测功能4质量控制合成后需要进行纯化和质量检测，确保探针的纯度和活性符合要求现代寡核苷酸合成技术已经高度自动化和标准化，能够高效制备各种修饰的探针分子不同的修饰策略赋予探针不同的功能特性，如荧光检测、信号放大、靶向递送等合成技术的进步使得复杂的多功能探针设计成为可能，为分子诊断技术的发展提供了基础探针质量控制与储存纯度检测方法活性评估（高效液相色谱）用于分析探通过杂交实验验证探针的生物活性；HPLC针的化学纯度和检测杂质；熔解曲线分析评估探针的杂交特异性；PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）用于评估探荧光强度测试检查标记效率针的完整性和长度均一性；质谱分析确认分子量准确性储存条件优化冷冻保存（°或°）防止降解；避光保存防止荧光淬灭；干燥环境防-20C-80C止水解；适当浓度的缓冲液维持稳定pH严格的质量控制是确保探针性能稳定和实验结果可靠的基础不同类型的探针需要采用相应的质量控制方法，建立完善的质量控制体系对于商业化探针产品尤为重要合理的储存条件可以显著延长探针的使用寿命，降低实验成本实时荧光定量探针法（探针）PCR qPCR原理TaqMan探针结合在扩增区域内部1PCR酶切释放荧光聚合酶的外切酶活性切断探针DNA5荧光信号产生报告基团与淬灭基团分离，产生荧光实时定量检测荧光强度与产物量成正比PCR探针技术代表了检测的重大突破，通过在反应中加入特异性探针，不仅提高了检测的特异性，还实现了真正的实时定量检测该TaqMan PCRPCR技术已成为分子诊断的金标准方法，在病毒载量检测、基因分型、转基因检测等领域应用广泛探针法相比等非特异性染料具有更高SYBR Green的特异性和更低的假阳性率探针的典型结构qPCR端荧光基团5报告分子，常用、、等，受激发后发射特定波长荧光FAM VICNED中间序列区域个核苷酸的特异性序列，与目标完全互补配对15-30DNA端淬灭基团3吸收荧光能量，常用、等，抑制荧光信号TAMRA BHQ端阻断3防止探针作为引物延伸，确保只作为检测探针发挥作用探针的精巧设计使其能够在反应过程中提供实时的、特异性的信号检测当探qPCR PCR针完整时，淬灭基团抑制荧光发射；当聚合酶的外切酶活性切断探针时，荧光基DNA5团和淬灭基团分离，产生可检测的荧光信号这种设计确保了只有在发生特异性扩增时才产生信号，大大提高了检测的准确性绝对定量与相对定量qPCR绝对定量方法相对定量方法使用已知浓度的标准品建立标准曲线，通过值与标准曲线比使用内参基因作为标准化对照，计算目标基因相对于内参基因Ct较计算目标序列的绝对拷贝数适用于病毒载量检测、转基因的表达变化倍数常用方法计算相对表达量2^-ΔΔCt含量测定等需要精确数值的应用适用于基因表达差异分析、药物作用效果评估等比较性研究标准曲线的质量直接影响定量准确性，要求，扩增效选择稳定的内参基因（如、）是获得可靠结果R²≥

0.99GAPDHβ-actin率在之间该方法能够检测低至几个拷贝的目标序的关键90-110%列技术的定量能力使其成为现代分子生物学研究不可或缺的工具绝对定量提供精确的分子数量信息，而相对定量则适合比较分qPCR析两种方法各有优势，研究者需要根据实验目的选择合适的定量策略高质量的探针设计和严格的实验操作是获得准确定量结果的基础探针在基因检测中的应用遗传疾患筛查无创产前检测药物代谢基因检测检测单基因遗传病如地中海贫通过检测孕妇血液中的胎儿游检测、等CYP2D6CYP2C19血、血友病等的致病突变；多离，筛查胎儿染色体异药物代谢酶基因变异，指导个DNA基因疾病易感性评估；载体筛常如三体综合征；避免羊体化用药方案制定；预测药物21查防止遗传病传递给后代水穿刺等有创检查的风险不良反应风险肿瘤基因检测检测突变评估乳腺BRCA1/2癌卵巢癌风险；检测驱动基因突变指导靶向治疗药物选择探针技术在精准医学时代发挥着越来越重要的作用通过精确检测特定基因变异，为疾病预防、早期诊断和个体化治疗提供分子依据随着基因组学研究的深入，更多疾病相关基因被发现，探针检测的应用范围将继续扩大病原体检测病毒分子诊断设计针对病毒特异性基因序列的探针，快速检测流感病毒、新冠病毒、肝炎病毒等相比传统培养方法，分子诊断速度快、特异性高、可检测难培养的病原体细菌耐药基因检测检测细菌携带的抗生素耐药基因，如的基因、结核菌的MRSA mecA耐药突变等，为合理用药提供依据rifampicin多重检测技术在单个反应中同时检测多种病原体，提高检测效率与原位杂交qPCR结合可实现病原体的定位和定量检测病原体分子诊断已成为现代临床微生物学的核心技术，特别是在新发传染病爆发时能够快速建立检测方法探针技术的高特异性和灵敏度使得早期诊断成为可能，对控制疫情传播具有重要意义多重检测技术进一步提高了诊断效率，降低了检测成本转基因分析外源基因检测含量定量分析检测转基因作物中导入的外源基因如精确测定转基因成分在食品中的含量百Bt基因、除草剂抗性基因等分比法规符合性食品安全监管满足各国转基因产品进出口检验检疫要确保转基因食品符合标识要求和安全标求准转基因检测技术对于保障食品安全和维护消费者知情权具有重要意义通过检测特异性的转基因构建序列，能够准确识别和定量各种转基因成分随着转基因技术的发展，检测方法也在不断更新，以应对新的转基因品种和技术挑战单核苷酸多态性（）分型SNP等位基因判别疾病关联研究设计针对不同等位基因的特异性检测与疾病易感性相关的位SNP探针，通过杂交信号强度差异区点，如基因与阿尔茨海默APOE分基因型探针法是最病的关联、基因与酒精TaqMan ALDH2常用的检测方法代谢的关系SNP药物基因组学检测影响药物反应的，指导个体化用药如华法林用药剂量与SNP和基因型的关系CYP2C9VKORC1是人类基因组中最常见的遗传变异形式，约每个碱基对中就有一个SNP300位点分型技术为个体化医学提供了重要的遗传信息，是精准医学SNP SNP的基础高通量检测技术使得大规模人群遗传学研究成为可能，推动了SNP复杂疾病遗传机制的研究探针用于核酸定点修饰系统辅助CRISPR作为探针指导蛋白识别特定序列，实现精确的基因编辑guide RNACas DNA靶点特异性识别确保基因编辑工具在基因组中的准确定位，避免脱靶效应精确序列修饰实现基因敲除、敲入、点突变等多种编辑模式治疗应用前景为遗传病基因治疗和肿瘤免疫治疗提供精确工具基因编辑技术的发展为探针应用开辟了新的领域在系统中，CRISPR-Cas guideRNA实际上就是一种高度特异性的探针，其序列设计的准确性直接决定了基因编辑的成功率和安全性这种应用展示了探针技术在基因治疗等前沿领域的巨大潜力高通量测序中的探针1靶向捕获探针设计设计覆盖目标基因区域的探针库，富集感兴趣的片段进行深度测序DNA2外显子测序应用使用探针捕获全部外显子区域，大幅降低测序成本同时保持检测精度3肿瘤检测panel针对肿瘤相关基因设计探针，用于肿瘤分子分型和药物选择panel4临床基因组学在临床诊断中实现高效、准确的遗传变异检测靶向测序技术结合了探针富集和高通量测序的优势，既保持了全基因组测序的准确性，又显著降低了成本这种技术在临床基因组学中应用广泛，特别是在肿瘤精准医学和遗传病诊断领域探针设计的质量直接影响靶向测序的效果和数据质量探针结合甲基化分析DNA甲基化特异性探针肿瘤早期诊断设计能够区分甲基化和非甲基化胞嘧啶的特异性探针，通过亚甲基化异常是肿瘤发生的早期事件，通过检测肿瘤抑制基DNA硫酸氢盐处理后的序列差异实现检测甲基化胞嘧啶不被转化，因启动子区域的甲基化状态可以实现肿瘤的早期诊断而非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶循环肿瘤中的甲基化标记物检测为液体活检提供了新的技DNA甲基化特异性（）是最常用的方法，通过设计针对处术手段，有望实现肿瘤的无创早期筛查PCR MSP理后序列的特异性引物和探针实现检测甲基化分析代表了表观遗传学研究的重要方向，探针技术在其中发挥着关键作用甲基化标记物的检测不仅用于基础研究，还DNA在临床诊断中显示出巨大潜力随着表观遗传学研究的深入，基于甲基化的分子诊断将成为精准医学的重要组成部分。