《分子生物学研究TCRMH》课件

分子生物学研究TCR/MHC本课程深入探讨细胞受体（）与主要组织相容性复合体（）T TCR MHC的分子生物学研究我们将系统介绍和的结构特点、功能机TCR MHC制以及在免疫系统中的关键作用课程涵盖从基础理论到前沿技术的全方位内容，包括分子克隆、基因测序、蛋白质表达等核心技术通过本课程学习，学生将掌握研究的理论基础和实验技能，TCR/MHC了解其在疾病诊断、治疗和疫苗设计中的重要应用课程将结合最新研究进展和临床实例，培养学生的科研思维和创新能力分子生物学简介结构发现遗传密码破译12DNA年沃森和克里克发现世纪年代科学家成功19532060双螺旋结构，揭示了破译遗传密码，阐明了DNA遗传信息储存的分子基础，信息如何转化为蛋白DNA为分子生物学奠定了坚实质，建立了分子生物学的基础核心理论体系重组技术3DNA年代重组技术的发展使得基因克隆和操作成为可能，1970DNA开启了现代生物技术和基因工程的新纪元中心法则简述复制转录翻译DNA遗传信息在分子中储存，通过复制确信息转录为，形成信使分子信息翻译为蛋白质，执行生物功能DNA DNA RNA RNAmRNA保信息传递在研究中，中心法则指导我们理解免疫分子的生物合成过程和分子都遵循这一基本规律，从基因到蛋白质的表达调TCR/MHC TCR MHC控影响着免疫应答的特异性和效率细胞受体（）简述T TCR定义与功能抗原识别机制TCR细胞受体是淋巴细胞表面的特异性受体分子，负责识别通过其可变区域识别特定的抗原肽片段，这些肽段必T T TCR和结合抗原肽复合物的多样性使得免疫系统须与分子结合才能被识别这种双重识别机制确保了-MHC TCR MHC能够识别几乎无限种类的外来抗原免疫应答的特异性每个细胞表达独特的，通过与抗原呈递细胞表面的的抗原识别具有高度特异性，能够区分自身和非自身T TCR TCR分子结合，启动特异性免疫应答，是适应性免疫的核抗原，这一特性是免疫耐受和免疫监视的分子基础MHC心分子机制主要组织相容性复合体（）概述MHC类分子类分子免疫应答作用MHC-I MHC-II存在于所有有核细胞表面，主要呈主要表达于抗原呈递细胞表面，呈分子是抗原呈递的核心，决MHC递内源性抗原肽给细胞递外源性抗原肽给细胞定了细胞能够识别的抗原谱CD8+T CD4+T T由重链和轻链微球蛋白组成，由链和链组成，抗原结合沟较的多态性为种群提供了广泛αβ2-αβMHC抗原结合沟较封闭开放的免疫保护与的协作关系TCR MHC抗原识别信号传导识别呈递的抗原肽形成三TCR MHC结合后激活下游信号转导通路分子复合物免疫记忆细胞活化形成记忆细胞提供长期保护细胞活化并执行效应功能T T结构详解TCR可变区负责抗原特异性识别连接区连接可变区与恒定区恒定区维持结构稳定性跨膜区锚定在细胞膜上由链和链组成异二聚体结构每条链都包含可变区（）、连接区（）和恒定区（），链还含有多样性区（）可变区的高度TCRαβV JCαD多样性是识别不同抗原的结构基础TCR基因重排机制TCR基因片段切割酶复合物识别重组信号序列并切割RAG DNA随机重组、、基因片段随机重组产生多样性V DJ修复DNA非同源末端连接修复产生额外多样性功能检验检查重排是否产生功能性基因TCR分子结构MHC-I域α1形成抗原结合沟的底部域α2形成抗原结合沟的侧壁域α3提供结构支撑与分子结合CD8微球蛋白β2-稳定分子结构MHC-I分子结构MHC-II链结构链结构肽结合特点αβ包含和域，包含和域，结合沟两端开放，可α1α2α1β1β2β1域参与抗原结合沟形域与域共同形成开结合长度为个α112-25成，域提供结构支放的抗原结合沟，能氨基酸的抗原肽，主α2撑并与分子相互够容纳较长的抗原肽要呈递外源性抗原给CD4作用细胞CD4+T识别抗原肽复合物TCR-MHC初始接触的环区域与肽复合物表面形成初始接触，TCR CDRMHC-CDR1和主要识别分子，识别抗原肽CDR2MHC CDR3特异性结合通过氢键、范德华力和静电相互作用形成稳定的分子识别复合物，确保识别的特异性和亲和力构象变化结合后发生构象变化，激活胞内信号转导通路，启动TCR细胞活化程序和效应功能T信号转导简述TCR复合物TCR-CD3与分子形成功能复合物TCR CD3酪氨酸磷酸化和激酶磷酸化序列Lck FynITAM信号级联募集激活下游通路ZAP-70转录激活转录因子激活基因表达程序的基因多态性MHC种群分布差异病原体抗性不同种族和地理群体的多态性为种群提供广谱MHC MHC等位基因频率存在显著差异，的病原体抗性，不同等位基因反映了进化选择压力和遗传漂能够呈递不同的病原体抗原谱等位基因多样性平衡选择变的影响人类基因座具有极高的多自然选择维持的多态性，HLA MHC态性，、、和、杂合子优势和频率依赖性选择HLA-A BC DR、位点存在数千种等位促进了等位基因的共存DQ DP基因变异1和的遗传调控TCR MHC基因调控基因调控TCR MHC基因的表达受到严格的时空调控在细胞发育过程基因的表达受到细胞类型特异性和炎症信号的调控TCRTMHC中，不同阶段表达不同的转录因子如、、类分子在所有有核细胞中组成性表达，而类Notch GATA3T-MHC-I MHC-II等调控基因重排和表达分子主要在抗原呈递细胞中表达bet TCR表观遗传修饰如甲基化和组蛋白修饰也参与基因干扰素可以上调分子表达，增强抗原呈递能力转DNA TCR-γMHC的调控，确保只有功能性得到表达录因子如、和参与基因的转录调控TCR CIITARFX NFYMHC分子生物学技术概览技术家族PCR包括常规、实时荧光定量（）、数字等，用于基因PCR PCRqPCR PCR扩增、定量分析和突变检测测序技术DNA从测序到新一代高通量测序（），实现了从单基因到全基因Sanger NGS组的序列分析能力分子杂交技术、、技术分别用于、和蛋白质的Southern NorthernWestern blotDNA RNA特异性检测和分析克隆与表达基因克隆、重组蛋白表达、细胞转染等技术为功能研究提供了重要工具基因克隆与表达TCR提取RNA从活化T细胞中提取总RNA反转录合成cDNA用于PCR扩增基因扩增PCR扩增TCRα和β链基因载体构建将基因插入表达载体转化表达转化宿主细胞进行蛋白表达基因测序分析TCR测序法高通量测序Sanger经典的链终止测序方法，精技术能够同时分析数百NGS确度高，适用于单个克万个序列，实现库TCR TCR TCR隆的序列分析通过毛细管的深度分析包括、Illumina电泳分离不同长度的片、等平台，DNA IonTorrent PacBio段，读取序列信息适合小各有优势和应用场景规模、高精度的序列验证数据分析流程包括质量控制、序列比对、区域识别、克隆型分析等步骤CDR3需要专业的生物信息学软件和数据库支持，如、、IMGT MiXCR等VDJtools多样性分析TCR流式细胞术单细胞测序质谱分析网络分析利用荧光标记抗体检和质谱技术可以直接检通过计算生物学方法scRNA-seq scTCR-测表面表达，分技术能够在单细胞测蛋白序列，验分析序列相似性TCR seq TCR TCR析细胞亚群分布和活水平分析序列和证转录后修饰，提供网络，识别共享的抗T TCR化状态多参数流式基因表达谱，揭示细蛋白质水平的多样性原特异性和克隆扩增T细胞术可同时检测多胞的异质性和功能状信息模式种标志物态分型分子技术MHC方法PCR-SSP序列特异性引物技术，通过设计特异性引物扩增特定等PCR HLA位基因方法简便快速，适用于常见等位基因的检测，但分辨率有限技术PCR-SSO序列特异性寡核苷酸探针杂交技术，结合反向点杂交检测等位基因分辨率较高，能够检测更多等位基因变异HLA高分辨分型NGS新一代测序技术实现了基因的高分辨率分型，能够检HLA测到外显子和内含子的所有变异，是目前最精确的分型方法相关蛋白表达与鉴定MHC功能验证生物活性检测确认功能质谱鉴定确认蛋白序列和修饰蛋白纯化亲和层析纯化目标蛋白表达系统选择合适的宿主细胞蛋白的表达通常选择哺乳动物细胞系统以确保正确的蛋白折叠和糖基化修饰纯化后的蛋白需要通过多种方法验证其结构和功能完整MHC性重组技术在研究DNA TCR-MHC中的应用载体构建设计并构建表达载体，包含启动子、多克隆位点、选择标记等元件转基因模型构建表达人源化或的转基因小鼠模型用于功能研究TCRMHC基因编辑利用等技术进行精确的基因敲除或敲入CRISPR/Cas9细胞工程改造细胞表达特定或用于免疫治疗T TCRCAR水平的分子检测RNA检测测序技术RT-PCR RNA反转录技术是检测和基因表达的经典方法技术能够全面分析和基因的表达谱，发PCR TCRMHC RNA-seqTCRMHC通过设计特异性引物，可以定性和定量分析基因转录水平，现新的转录本和剪接变异体单细胞测序进一步揭示RNA监测不同条件下的表达变化了细胞间的表达异质性实时荧光定量提供了更精确的定量结果，可以检转录组分析可以识别与表达相关的调控网络，RT-PCR TCR/MHC测表达的微小变化，适用于研究基因调控机制为理解免疫应答机制提供系统性视角蛋白质层面的研究与分析免疫沉淀Western Blot利用特异性抗体富集目标蛋白复合物，检测特定蛋白的表达水平、分子量和翻研究蛋白质相互作用和信号转导通路译后修饰状态免疫荧光流式细胞术观察蛋白在细胞内的定位和共定位关系分析细胞表面和分子的表达密TCRMHC度和分布模式抗原特异性的筛选TCR1多聚体制备MHC将目标抗原肽与分子结合，形成四聚体复合物并标记MHC荧光素细胞染色用多聚体染色细胞悬液，特异性将结合多聚体MHC T TCR流式分选通过流式细胞仪分选阳性细胞，富集抗原特异性细胞T克隆扩增体外培养扩增获得的特异性细胞克隆进行后续分析T信号转导通路分析TCR关键分子检测功能阻断实验检测信号通路中的关键分子使用特异性抑制剂或基因敲如、、、除技术阻断信号通路中的关Lck ZAP-70LAT的磷酸化状态使用键分子，观察对细胞活化和PLCγ1T磷酸化特异性抗体进行功能的影响，确定分子在通或流式细胞术分路中的作用Western blot析，监测信号激活的动态过程信号网络分析结合蛋白质组学和磷酸化组学技术，系统分析信号转导网络，TCR发现新的调控分子和作用机制抗原肽谱分析MHC分子纯化MHC免疫沉淀分离细胞表面MHC分子肽段洗脱酸性条件下洗脱结合的抗原肽质谱鉴定LC-MS/MS分析鉴定肽段序列数据库比对与蛋白质数据库比对确定来源蛋白MHC抗原肽谱分析揭示了细胞表面呈递的完整抗原谱，为理解免疫监视机制和开发免疫治疗策略提供重要信息这项技术在肿瘤新抗原发现和疫苗设计中具有重要应用价值研究中的动物模型TCR/MHC转基因小鼠基因敲除模型人源化模型表达特定或人源化或基因敲除表达人类分子的小TCR TCRMHC HLA分子的转基因小小鼠用于研究这些分子鼠模型，为研究人类免MHC鼠模型，用于研究抗原在免疫系统发育和功能疫应答和测试免疫治疗特异性免疫应答和免疫中的必需性提供更相关的模型系统耐受机制疾病模型自身免疫疾病、肿瘤和感染模型用于研究在疾病发生TCR/MHC发展中的作用机制临床样本分子检测样本采集与处理规范化采集患者外周血、组织活检或其他体液样本建立标准的样本处理流程，包括抗凝、分离、冷冻保存等步骤，确保样本质量细胞亚群分析T利用多参数流式细胞术分析、细胞比例，检测CD4+CD8+T活化标志物、记忆标志物和功能分子的表达水平分型检测MHC对患者进行高分辨率分型，为器官移植配型、疾病关HLA联性分析和个体化治疗提供分子标记信息信号失调相关疾病TCR免疫缺陷疾病血液系统恶性肿瘤信号转导缺陷导致的原发性免疫缺陷病包括、细胞白血病和淋巴瘤常伴有基因重排异常、染色体TCR SCIDT TCR综合征等患者表现为反复感染、免疫功能低下易位和信号通路激活异常DiGeorge分子诊断依赖基因重排分析、染色体核型检查和免疫TCR分子机制涉及基因重排异常、信号转导分子缺失或功表型分析，为精准分型和个体化治疗提供依据TCR能异常，导致细胞发育障碍或功能缺陷T异常相关病理MHC自身免疫疾病移植排斥反应特定等位基因与类风湿关节炎、1不匹配导致急性和慢性移植排HLA HLA型糖尿病等疾病高度关联斥反应1免疫耐受缺陷药物不良反应4表达异常影响自身抗原的耐受某些型与特定药物的严重不良MHC HLA诱导反应相关重大传染病与MHC病毒感染与抗原呈递病毒感染细胞后，病毒蛋白在胞内被降解为肽段，通过分子呈递MHC-I给细胞，启动细胞毒性免疫应答CD8+T多态性影响易感性MHC不同等位基因对病原体肽段的结合能力差异导致个体间感染易感性HLA和疾病严重程度的差异病原体免疫逃逸某些病毒如能够通过突变逃避限制性的免疫应答，或干扰HIV HLAMHC分子的正常功能种群保护机制的多态性为种群提供了对不同病原体的广谱保护，是进化选择维持MHC的重要免疫机制肿瘤免疫逃逸中的TCR/MHC免疫监视缺陷肿瘤细胞下调表达逃避细胞识别MHC T抗原丢失肿瘤抗原突变或缺失避免免疫识别免疫检查点等分子抑制细胞功能PD-1/PD-L1T免疫抑制环境4肿瘤微环境抑制细胞活化和功能T肿瘤免疫逃逸是一个复杂的多步骤过程，涉及系统的多个环节理解这些机制为开发新的免疫治疗策略提供了重要理论基础TCR/MHC与细胞治疗CAR-T TCR-T细胞分离T从患者外周血中分离纯化淋巴细胞T基因改造转导或基因改造细胞特异性CAR TCRT体外扩增大规模培养扩增改造后的细胞T回输治疗将扩增的细胞回输患者体内执行抗肿瘤功能和代表了细胞免疫治疗的重大突破，通过基因工程技术赋予细胞CAR-TTCR-TT新的抗原识别能力，在血液肿瘤治疗中取得了显著成效疫苗设计中的考虑TCR/MHC表位筛选识别能够结合多种分子的免疫优势表位HLA结合预测2利用算法预测抗原肽与分子的结合亲和力MHC覆盖分析评估疫苗在不同种群中的覆盖率HLA免疫验证体外和体内验证疫苗的免疫原性以新冠疫苗为例，研究人员通过分析蛋白序列，预测能够结合常见等位基因的细胞表位，设计了覆盖多个表位的疫苗策SARS-CoV-2HLA T略，确保在不同种群中都能诱导有效的免疫保护大数据与研究TCR/MHC生物信息学流程公开数据库资源机器学习应用建立标准化的数据分析、、等深度学习算法用于抗原结合TCR/MHC IMGTVDJdb McPAS-TCR TCR-流程，包括质量控制、序列比对、专业数据库提供序列和功能注预测、结合肽预测和免疫原TCRMHC注释分析和统计建模整合多组学释信息数据库收性评估，提高了预测准确性和效率IPD-IMGT/HLA数据实现系统性分析录了全球等位基因信息HLA单细胞测序推动研究TCR/MHC单细胞分离微流控技术分离单个细胞T全转录组扩增扩增单细胞进行测序分析RNA3序列解析TCR同时获得序列和转录组信息TCR多维数据整合整合功能状态和抗原特异性信息单细胞技术革命性地改变了我们对细胞异质性的认识，能够在单细胞水平同时T获得序列、基因表达谱和表面蛋白信息，为精确解析免疫应答机制提供了强TCR大工具人工智能辅助抗原预测深度学习算法结合预测特异性预测MHC TCR卷积神经网络和循环神、基于大规模抗原配NetMHCpan TCR-经网络用于分析肽等算法能够对数据训练的模型能够TCR-MHCflurry复合物的结合模预测肽段与不同等预测的抗原特异性，-MHC HLATCR式，提取序列和结构特位基因的结合亲和力，为免疫治疗设计提供指征进行预测准确率超过导90%新抗原发现算法加速肿瘤新抗原AI的识别和验证，大大提高了个体化癌症疫苗的开发效率真实案例分析测序驱动TCR的免疫治疗患者背景与采样一名转移性黑色素瘤患者接受免疫检查点抑制剂治疗前后，研究团队采集了肿瘤组织和外周血样本进行测序分析TCR库分析结果TCR治疗前患者多样性较低，克隆扩增有限治疗后库TCRTCR显著扩展，出现了多个高频克隆，提示特异性细胞的强烈扩T增预后评估与指导多样性的增加与患者的临床应答高度相关，为后续治TCR疗方案调整和预后评估提供了重要的分子标志物信息真实案例分析分型协助移植MHC配型实例移植结果与随访HLA一名终末期肾病患者需要肾移植，通过高分辨率分型患者移植后恢复良好，肾功能迅速改善，肌酐水平恢复正HLA发现患者为在器官分常长期随访显示无急性排斥反应发生，移植肾功能稳定HLA-A*02:01,B*44:02,DR*07:01配系统中找到了、、位点完全匹配的供体HLA-A BDR配型结果显示个抗原位点完全匹配，交叉配型试验阴性，这个案例证明了精确配型在器官移植成功中的关键作6HLA预示着良好的移植相容性和较低的排斥风险用，为移植医学提供了重要的分子基础常用实验设计流程图实验设计确定研究目标、选择合适的检测方法、设计对照组样本准备采集样本、RNA/DNA提取、质量检测分子检测PCR扩增、测序分析、基因分型数据分析生物信息学分析、统计检验、结果解释结果报告撰写实验报告、数据可视化、结论总结主要实验注意事项样本保存与处理样本应立即冷冻保存于，避免反复冻融样本可在RNA-80°C DNA-20°C长期保存建立完整的样本信息记录系统污染防控严格无菌操作，使用无的试剂和耗材反应设置阴性RNase/DNase PCR对照，防止交叉污染和假阳性结果质量控制定期校准仪器，使用标准品验证检测系统性能建立质控样本监测实验重现性和准确性数据记录详细记录实验条件、试剂批号、操作步骤建立完整的实验档案，确保结果可追溯性数据分析要点结果解释结合生物学背景解释数据意义1统计分析选择合适的统计方法验证结果数据过滤去除低质量序列和异常值质量控制评估测序深度、覆盖度和准确性数据分析是研究的关键环节，需要严格的质控标准和合适的分析方法统计分析应考虑多重比较校正，结果解释需要结合生物TCR/MHC学知识和文献背景研究常用试剂与工具与测序试核酸提取试剂多聚体试PCR MHC剂盒剂高保真聚合提取试剂盒、商业化的四DNARNAHLA酶、混合基因组提取聚体、五聚体试dNTP DNA物、缓冲液系统试剂盒、胶回收剂盒，用于抗原测序试剂包括测试剂盒等，确保特异性细胞的T序引物、测序酶高质量核酸的获检测和分选和荧光标记的终得止子流式抗体针对、、CD3CD

4、等分CD8TCR子的荧光标记抗体，用于细胞T表型分析和功能检测。