《微生物保存技术》课件

微生物保存技术微生物保存技术是现代生物技术和科学研究的重要基础，涉及维持微生物活力、遗传稳定性和功能特性的各种方法本课程将系统介绍微生物保存的基本原理、传统与现代保存方法、不同类型微生物的特定保存要求，以及实验室与工业应用的案例分析通过深入学习，学员将全面掌握微生物资源保存的核心技术课程目标1掌握基本原理和方法深入理解微生物保存的科学原理，熟练掌握各种保存技术的操作流程和技术要点，能够根据实际需求选择最适合的保存方案2了解不同类型微生物特点学习细菌、真菌、酵母、藻类等不同微生物类型的生物学特性，掌握针对性的保存策略和技术参数设置3学习实验室和工业技术熟悉从小规模实验室保存到大规模工业化微生物资源库建设的完整技术体系和管理规范4掌握质量控制方法学习微生物保存过程中的质量监测、活力评价、纯度检测和遗传稳定性分析的标准化方法第一部分微生物保存的基本概念保存的定义与目的历史发展脉络应用领域广泛微生物保存是指通过物理或化学方法，从早期的传代培养到现代的超低温保存涵盖科学研究、医药开发、食品工业、在特定条件下维持微生物细胞活力和生技术，微生物保存经历了从经验到科环境治理、农业生产等多个重要领域，物学特性的技术过程，目的是确保微生学、从简单到复杂的发展历程是现代生物技术发展的重要支撑物资源的长期稳定保存微生物保存的意义保持菌种稳定性确保实验重复性保护资源多样性促进科技发展确保微生物在长期保存为科学研究和工业生产建立微生物资源保护体为生物技术研究、新药过程中维持原有的生物提供标准化的微生物材系，维护微生物遗传资开发、工业生物技术应学特性，包括形态、生料，保证实验结果的可源的多样性，为未来的用提供可靠的微生物资理、生化和遗传特征的重复性和生产过程的稳科学研究和技术开发保源平台，推动相关领域稳定性，避免因环境变定性，提高研究和生产留宝贵的生物资源的技术进步和产业发化导致的菌种退化的质量控制水平展微生物保存的基本原理抑制代谢活动防止细胞损伤通过降低温度或调节环境条件，显著减缓或使用适当的保护剂和保存条件，保护细胞膜停止微生物的新陈代谢过程，使细胞进入休结构完整性，防止冰晶形成、脱水损伤和氧眠状态，减少能量消耗和生理活动化应激对细胞造成的不可逆伤害避免污染维持遗传稳定建立无菌操作环境和标准化流程，防止外来确保和等遗传物质在保存过程中DNA RNA微生物污染和交叉感染，确保保存微生物的不发生突变或降解，保持微生物的遗传特性纯度和质量和生物功能的稳定性影响微生物保存的因素温度控制水分活度管理温度是最关键的影响因素，过高会加速代谢和死亡，过低可能造成水分含量直接影响微生物的生存状态脱水过程中需要平衡水分去冷害不同微生物对温度敏感性差异很大，需要精确控制保存温度除和细胞损伤，避免因快速脱水导致的细胞膜破裂和蛋白质变性和降温速率氧化压力控制化学环境稳定氧气可能导致脂质过氧化和蛋白质氧化损伤厌氧微生物对氧气特值变化和渗透压力波动会影响细胞膜完整性和酶活性保护剂的pH别敏感，需要在无氧或低氧环境中进行保存操作种类、浓度和添加方式都需要根据具体微生物类型进行优化微生物保存前的准备工作菌种纯度检验通过显微镜观察、选择性培养基分离和分子生物学检测等方法，确认微生物纯度，排除污染菌的存在，确保保存材料的质量菌种特性分析详细分析微生物的形态学特征、生理生化特性、最适生长条件和代谢产物，建立完整的菌种档案和特性数据库生长条件优化确定最适培养基配方、培养温度、值和通气条件，使微生物达到pH最佳生长状态，为保存提供高活力的菌体材料最佳时机选择选择微生物生长的最适阶段进行保存，通常在对数生长期末期或稳定期初期，此时细胞活力高且抗逆性强第二部分传统保存方法普通传代培养最基础的保存方法，定期转接至新鲜培养基矿物油覆盖保存通过油层阻隔氧气和减缓水分蒸发干燥保存技术去除水分达到长期保存目的低温冷冻保存利用低温抑制生物活动传代培养法定期转接每隔特定时间将微生物转接到新鲜培养基上继续培养操作简单技术要求低，设备投入少，适合常规实验室使用局限明显容易发生遗传变异，保存时间短，需要大量人工维护周期控制根据微生物特性确定最适传代间隔和培养条件矿物油覆盖保存法覆盖层制备在斜面培养基表面覆盖厘米厚的无菌矿物油，形成密封层阻隔氧气1-2进入，减缓微生物代谢活动和水分蒸发适用于真菌、酵母和某些细菌的中期保存保存条件控制保存温度控制在℃，避免温度波动定期检查油层完整性和微4-10生物生长状态，确保保存环境稳定保存期限通常为年1-3复苏操作流程使用时用无菌吸管小心移除表面矿物油，避免污染培养基挑取少量菌体接种到新鲜培养基上活化培养，观察恢复生长情况干燥保存法普通干燥法真空干燥法保存与复苏使用硅胶、氯化钙等干燥剂或土壤载体在真空条件下进行干燥，可以降低干燥干燥后的样品密封保存在干燥环境中，进行自然干燥将微生物悬液滴加到载温度，减少热损伤设备包括真空泵、可保存数年复苏时将干燥样品加入适体上，在室温或低温条件下缓慢脱水干燥器和温度控制系统干燥过程需要量培养基中，轻轻混匀后培养观察恢复适用于芽孢形成菌和抗性较强的微生严格控制温度和真空度情况成功率因微生物种类而异物冷冻干燥法一快速冷冻在℃至℃下快速冷冻样品-30-60一级干燥在真空条件下升华冰晶20-100Pa二级干燥升温去除结合水分完成干燥过程压力控制精确控制真空度确保升华效果过程监控实时监测温度压力变化调节参数冷冻干燥法二1保护剂配制选择脱脂乳、甘油或蔗糖作为保护剂，根10-15%5-10%6-12%据微生物特性调整配方浓度，确保最佳保护效果2适用范围广适用于大多数细菌、真菌和酵母的长期保存，包括对环境敏感的微生物种类，保存成功率高达以上90%3优势明显保存期长达年，遗传稳定性高，产品便于储存和运输，是目前5-20最可靠的商业化保存方法之一4成本考虑设备投资较大，工艺操作复杂，需要专业技术人员操作，但长期保存效果优异，适合规模化应用干燥法L-室温真空干燥技术特点应用效果在室温条件下进行真空干燥，避免与冷冻干燥相比，干燥法省去了对某些乳酸菌、双歧杆菌等益生菌L-了冷冻过程，特别适合对低温敏感冷冻步骤，干燥时间较短，设备要保存效果良好，复苏率可达到60-的微生物种类，减少冷冻损伤的发求相对简单，但对微生物的适用性，是冷冻干燥的有效补充方80%生有一定限制法第三部分现代低温保存技术普通冷藏℃4深度冷冻℃至℃-20-80短期保存的基础方法，适合日常实验使中长期保存的可靠选择，设备普及率高用液氮保存℃超低温保存℃至℃-196-130-150最佳长期保存技术，停止所有生物反应重要菌种的长期保存方案普通冷藏保存℃4适用微生物保存容器保存期限一般细菌、酵母菌选择密封性好的培根据微生物特性不和某些真菌在℃养皿、试管或安瓿同，保存期限从43条件下可以维持活瓶，培养基应含有个月到年不等，1力个月到年，适量的营养成分和需要定期检查活力31是实验室最常用的保护性物质，避免状况，及时进行传短期保存方法微生物营养缺乏代或转入长期保存复苏应用直接从冷藏条件取出，在室温平衡后接种到新鲜培养基中，通常可以快速恢复正常生长状态深度冷冻保存温度控制℃至℃范围内精确控制温度，冷冻速率保持在℃分-20-

800.5-1/钟，避免快速冷冻造成的冰晶损伤保护剂添加使用甘油或作为冷冻保护剂，在冷冻前充分混15-20%10%DMSO合，确保保护剂均匀分布并渗透到细胞内部适用范围耐冷细菌、大多数真菌和酵母都能在此条件下良好保存，特别适合需要中期保存的实验室菌株和工业菌种保存周期保存期限通常为年，期间需要定期监测设备运行状态和温度稳定1-5性，确保保存环境的可靠性超低温保存℃-130最低温度机械制冷系统可达到的稳定保存温度℃-150理想范围最适合重要菌种长期保存的温度区间年10-15保存期限在超低温条件下的预期保存年限95%+复苏成功率经过优化处理的微生物复苏成功率液氮保存一保存温度液相℃气相℃-196-150生物反应完全停止极度缓慢设备类型液氮罐气相液氮罐安全风险冻伤、缺氧相对较低成本考虑液氮消耗大消耗较少保存效果最佳优良液氮保存二液氮保存是目前最可靠的长期保存技术操作流程包括样品预冷、程序降温和转入液氮三个关键步骤降温速率严格控制在℃1-10/分钟，保护剂浓度根据微生物类型优化调整适用于几乎所有类型的微生物，保存期限可达年甚至更长质量控制包括定期活10-30力检测和遗传稳定性评价，确保长期保存的可靠性程序降温技术玻璃化保存技术避免冰晶形成形成无定形玻璃态结构，完全避免有害冰晶高浓度保护剂使用超高浓度保护剂系统40-60%超快冷却冷却速率超过℃分钟100/敏感微生物特别适合对冰晶极度敏感的种类第四部分不同类型微生物的特殊保存技术细菌保存技术包括芽孢形成菌和非芽孢形成菌的不同保存策略，考虑细胞壁结构和抗逆性差异，选择最适合的保护剂和保存条件酵母菌保存技术针对单细胞真菌的特殊生理特点，重点关注细胞壁组成和渗透压敏感性，优化保存方法和复苏流程丝状真菌保存考虑菌丝体和孢子的不同保存特性，选择合适的形态进行保存，确保复苏后的正常形态和功能藻类与病毒保存针对光合微生物和病毒的特殊结构特点，采用专门的保存方法和质量控制措施，维持生物活性非孢子形成细菌的保存保存难点缺乏芽孢保护结构，对环境变化敏感，容易发生细胞膜损伤和代谢紊乱最佳方法推荐液氮保存或超低温冷冻，配合优化的保护剂配方保护剂优化甘油蔗糖蛋白质保护剂的复合配方效果最佳10-15%+5%+成功率提升通过预适应处理和程序降温可将复苏率提高到以上85%芽孢形成细菌的保存芽孢优势诱导条件芽孢具有极强的抗逆性，能够抵抗高温、干通过营养限制、温度调节或化学诱导剂处燥、化学物质和辐射等极端环境条件，是天理，促进细菌形成芽孢，提高保存效果和稳然的保存形态定性活力维持保存方法芽孢可以保持数十年甚至更长时间的活力，可采用多种保存方法，包括常温干燥、冷冻复苏时通过适当的温度和营养条件激活萌干燥、低温保存等，芽孢形式下成功率都很3发高乳酸菌保存技术1特性分析乳酸菌对氧气敏感，需要厌氧或微厌氧环境，对变化和温度波动pH较为敏感，细胞壁相对脆弱2冷冻干燥优化采用专门设计的保护剂配方，包括脱脂乳、海藻糖和抗氧化20%5%剂，预冷温度控制在℃-403保存温度影响保存温度对乳酸菌活力保持至关重要，℃比℃保存效果显著-80-20更好，活力保持率可提高30%4工业应用案例某乳制品企业建立的乳酸菌种库，采用多重保存策略，确保发酵生产的稳定性和产品质量的一致性酵母菌保存技术液氮保存最佳长期保存方案，适合所有酵母类型冷冻干燥商业化应用的首选方法，便于运输储存超低温冷冻实验室常用方法，成本效益良好矿物油覆盖短期保存的经济选择，操作简便定期传代日常维护方法，需要频繁操作丝状真菌保存孢子菌丝体孢子收集技术保存方法选择vs孢子保存成功率更高，抗逆性强，复苏在最适条件下培养至充分产孢，使用无冷冻干燥、液氮保存和琼脂块保存是三后能保持原有特性菌丝体保存虽然可菌水或保护剂溶液收集孢子，通过过滤种主要方法琼脂块保存适合短期使行，但容易发生形态变异和活力下降，或离心纯化，确保孢子悬液的质量和浓用，冷冻干燥适合商业化，液氮保存适一般不推荐长期保存度合长期研究保存藻类保存技术光合特性培养标准化特殊保护剂藻类含有叶绿体和建立标准的培养基使用含有抗氧化剂光合色素，对光照配方和培养条件，的保护剂系统，如和营养条件要求特包括光照强度、光维生素、维生素C E殊，保存过程中需周期、浓度和和的组合，CO2DMSO要考虑色素稳定性营养盐浓度的精确保护光合系统免受和细胞壁特殊结控制氧化损伤构基因稳定性定期进行分子标记检测，监测叶绿体基因和核基因的稳定性，确保藻类保存后的遗传完整性病毒保存技术病毒特性挑战病毒缺乏完整的细胞结构，只含有遗传物质和蛋白质外壳，对环境条件极为敏感保存过程中容易发生衣壳蛋白变性和基因组损伤，需要特殊的保护措施宿主依赖性使得保存更加复杂宿主细胞协同保存某些病毒需要与宿主细胞一起保存，建立稳定的细胞株感染系统采用共培养保存方法，同时保护病毒和宿主细胞的活力，确保病毒的复制能力和感染性纯化病毒保存对于纯化的病毒制品，使用含有蛋白质稳定剂的保护剂，如血清白蛋白、明胶和抗氧化剂液氮保存是首选方法，避免反复冻融导致的病毒力价下降生物安全防护严格遵循生物安全规范，建立分级管理制度高致病性病毒需要在或BSL-3实验室进行保存操作，配备专门的安全防护设备和应急处理预案BSL-4第五部分微生物保护剂技术作用机制研究分类与特性深入理解保护剂在分子水平上的保护机系统分析不同类型保护剂的化学特性、理，为合理选择和使用提供科学依据生物相容性和保护效果新型保护剂配方设计原则探索和开发新一代生物保护剂，提高保基于微生物特性和保存条件，科学设计存效果和应用范围保护剂配方组合保护剂作用机制细胞膜稳定作用保护剂通过与细胞膜磷脂分子结合，维持膜结构的完整性和流动性，防止在冷冻和干燥过程中发生相变和破裂，保护细胞内部结构免受损伤冰晶形成抑制渗透性保护剂能够降低细胞内外的冰点，减缓冰晶形成速度，同时改变冰晶形态，形成较小的冰晶颗粒，减少对细胞结构的机械损伤玻璃化转变促进高浓度保护剂在极低温度下形成玻璃态结构，完全避免冰晶形成，为细胞提供稳定的保存环境，适用于对冰晶极度敏感的微生物多重保护效应保护剂还具有清除自由基、调节渗透压和保护蛋白质结构的作用，通过多种机制协同发挥保护效果，提高微生物的保存成功率渗透性保护剂保护剂种最佳浓度渗透特性毒性水平适用范围类甘油缓慢渗透低毒性大多数细10-20%菌快速渗透中等毒性真菌、酵DMSO5-15%母乙二醇中等渗透较高毒性特殊应用10-15%丙二醇缓慢渗透低毒性敏感微生15-25%物非渗透性保护剂大分子特性非渗透性保护剂分子量较大，不能穿过细胞膜，主要在细胞外发挥保护作用，通过调节渗透压和稳定细胞膜外表面结构保护细胞常用糖类保护剂蔗糖、海藻糖、甘露醇等糖类物质具有良好5-15%5-12%10-20%的保护效果，特别是海藻糖具有独特的玻璃化特性协同作用机制与渗透性保护剂配合使用时，形成内外双重保护体系，内部保护剂防止胞内冰晶形成，外部保护剂维持细胞膜稳定和渗透压平衡应用优势分析毒性极低，生物相容性好，特别适合食品微生物和益生菌的保存，在商业化生产中应用广泛，安全性高蛋白质类保护剂脱脂乳血清蛋白明胶保护剂含有酪蛋白、乳清蛋白等多牛血清白蛋白等血清明胶分子具有良好的成膜性BSA种保护性蛋白质，浓度蛋白具有良好的稳定性和保和保护性，浓度，5-2-10%，具有优异的保护效护性能，浓度，主要能够在细胞表面形成保护20%1-5%果，特别适合乳酸菌和益生用于敏感微生物和病毒的保膜，防止脱水损伤，适合干菌的保存，成本低廉应用广存，价格较高但效果显著燥保存方法泛保护机制通过表面吸附、渗透压调节和缓冲作用保护细胞，pH蛋白质分子还能清除自由基，提供额外的抗氧化保护效果抗氧化保护剂复合保护剂配方设计设计理论基础定制化配方基于协同保护理论，结合渗透性和非渗透性保护剂的优势，针对特定微生物种类开发专用配方，如乳酸菌专用配方考虑微生物的生理特性和保存条件要求，设计多组分保护剂脱脂乳海藻糖维生素，真菌专用配方甘20%+5%+C15%配方油蔗糖等+10%+BSA1234经典配方分析优化与标准化配方蔗糖明胶、配采用正交试验设计、响应面分析等统计学方法优化配方参LYO-A10%+5%MSG+

2.5%10/10方甘油和配方培养基数，建立标准化生产工艺，确保配方的重现性和稳定性10%DMSO+10%MRS+MRS甘油等经典配方的组成原理和应用效果+15%。