《微生物保藏》课件

微生物保藏技术微生物保藏是微生物学中的重要分支，涉及微生物菌株的长期保存、管理和利用本课程将系统介绍微生物保藏的基本原理、技术方法、实际应用和发展趋势通过学习，学生将掌握各种保藏技术的原理和操作方法，了解不同微生物类型的保藏需求，培养实际操作能力和问题解决能力课程内容涵盖从基础理论到前沿技术的完整知识体系微生物保藏的定义与意义基本概念保藏目的微生物保藏是指采用特定的技确保重要菌株资源的长期保术手段，在人工控制的条件存，满足科研、生产和教学需下，长期保持微生物菌株的生要，防止珍贵微生物资源的流命活性和遗传稳定性的过程失重要意义为生物技术产业提供稳定的菌种来源，促进微生物学研究发展，保护生物多样性资源微生物保藏技术发展历程1世纪初期19巴斯德等科学家开创了微生物培养技术，为保藏奠定基础最初采用简单的培养基保存方法2世纪中期20冻干技术的发明和应用，液氮保藏技术兴起，保藏期限大幅延长，标志着现代保藏技术的开端3现代发展超低温冰箱、自动化设备普及，分子生物学技术结合，保藏技术向标准化、信息化方向发展微生物分类与保藏需求差异细菌真菌病毒单细胞原核微生物，细胞壁结构相对简包括酵母菌和丝状真菌，细胞壁含几丁专性细胞内寄生，结构简单但保藏要求单多数细菌对冷冻保藏敏感性较低，质酵母菌保藏相对简单，丝状真菌需严格需要宿主细胞或特殊培养基，保适合冻干和液氮保藏考虑孢子和菌丝体特点藏技术最为复杂•革兰氏阳性菌抗逆性强•酵母菌适合甘油冷冻法•需要活细胞培养系统•革兰氏阴性菌需特殊保护•霉菌孢子抗逆性强•对温度变化极敏感•孢子形成菌保藏相对容易•菌丝体结构复杂需特殊处理•要求超低温保存条件常见保藏微生物类型酿酒酵母假丝酵母根瘤菌广泛用于酒精发酵和面包医学上重要的条件致病能与豆科植物共生固氮的制作，是工业微生物学中菌，也是重要的工业用重要农业微生物为可持最重要的菌种之一具有菌在抗生素生产和生物续农业发展提供生物肥良好的发酵能力和遗传稳转化过程中发挥重要作料，减少化学氮肥使用定性用乳酸菌食品发酵和益生菌制品的核心菌种具有重要的保健功能，广泛应用于乳制品和功能食品生产微生物资源的价值与应用工业应用农业领域发酵工业、生物制药、食品加工生物肥料、病害防控、土壤改良•抗生素生产菌株•固氮菌和菌根菌•酶制剂生产菌种•生物防治菌剂•有机酸发酵菌•土壤修复微生物环境保护医学应用污染治理、生态修复、废物处理药物生产、疫苗研发、诊断试剂4•石油降解菌•抗生素产生菌•重金属富集菌•疫苗生产用菌株•有机污染物分解菌•诊断用标准菌株微生物保藏基本原则遗传稳定性原则保藏过程中必须确保微生物的遗传物质不发生变异，维持原有的生物学特性和功能特征•避免基因突变和重组•防止质粒丢失•维持染色体完整性生命活性维持在保藏期间保持微生物的基本生命活动能力，确保复苏后能正常生长繁殖•细胞膜完整性保护•酶活性维持•代谢功能保存长期保存能力选择合适的保藏方法和条件，实现微生物的长期稳定保存，满足不同应用需求•保藏期限延长•复苏率保证•储存成本控制保藏实验室环境要求温度控制系统实验室需配备精确的温度控制设备，包括恒温培养箱、超低温冰箱和液氮储存设备温度波动应控制在±1°C范围内，确保保藏条件的稳定性湿度管理要求相对湿度应维持在45-65%之间，避免过高湿度导致污染或过低湿度造成样品干燥配备除湿设备和湿度监控系统，定期校准测量仪器无菌环境保障实验室应具备高效空气过滤系统，配置生物安全柜和超净工作台严格执行无菌操作规程，定期进行环境微生物监测和设备消毒设备配置标准需配备离心机、显微镜、天平、pH计等基础设备保藏专用设备包括冻干机、液氮罐、程控降温仪等建立设备维护和校准制度微生物保藏方法分类体系超长期保藏液氮保藏、冻干保藏，保存期5-50年长期保藏超低温冰箱、甘油冷冻，保存期1-5年中期保藏液体石蜡覆盖、真空干燥，保存期3-12个月短期保藏斜面培养、液体培养，保存期1-6个月临时保藏平板培养、传代培养，保存期数天至数周斜面保藏法操作技术培养基制备选择适宜的固体培养基，调节pH值至最适范围高温高压灭菌后制成斜面，确保培养基表面光滑无气泡冷却至室温后即可使用接种与培养在无菌条件下，用接种环挑取菌落接种到斜面上采用划线法或点接法，确保接种量适中置于适宜温度下培养至菌体充分生长密封保存生长良好后，用石蜡或胶带密封管口，防止培养基干燥和外界污染标记菌株信息和保藏日期，置于4°C冰箱保存液体石蜡覆盖保藏技术操作原理适用范围与注意事项在斜面培养物表面覆盖一层无菌液体石蜡，形成厌氧环境，降低主要适用于细菌和酵母菌，保存期可达6-12个月使用前需确保微生物代谢活动石蜡的隔离作用可防止培养基水分蒸发，延长液体石蜡完全无菌，覆盖厚度应在1-2厘米保存期限•石蜡质量要求医用级别该方法特别适用于厌氧菌和兼性厌氧菌的保藏，也可用于某些需•覆盖前确保培养物完全干燥氧菌的中期保存操作简单，成本低廉，是传统保藏方法中较为•储存温度控制在4-15°C实用的技术•定期检查石蜡层完整性甘油冷冻保藏方法甘油浓度配制冷冻温度控制配制15-20%的甘油溶液作为将菌悬液与甘油溶液等体积混冷冻保护剂甘油能降低冰合，装入冷冻管中先在-点，减少冰晶形成对细胞的机20°C预冷2小时，然后转移至械损伤，提高冷冻保藏的成功-80°C超低温冰箱长期保存率保存期限管理在-80°C条件下可保存2-3年，定期检查样品状态复苏时快速融化，避免反复冻融造成细胞损伤真空干燥保藏技术设备要求需要配备真空泵、干燥箱和真空计等设备真空度应达到

0.1Pa以下，确保充分脱水干燥过程中温度控制在35-45°C，避免高温对微生物造成损害样品预处理选择对数生长期的菌体，用保护剂溶液悬浮常用保护剂包括脱脂奶粉、明胶、蔗糖等将菌悬液分装到小瓶中，进行预冷冻处理干燥与保存在真空条件下缓慢升温脱水，整个过程需12-24小时干燥完成后立即密封包装，充入惰性气体储存在干燥阴凉处，可保存1-2年冻干法保藏技术原理冷冻阶段升华干燥将含有保护剂的菌悬液快速冷冻至-40°C在真空条件下加热，使冰晶直接升华为以下，形成固态冰晶保护剂能减少冰水蒸气温度严格控制在共融点以下，晶对细胞的损伤，常用的有蔗糖、甘露确保样品始终保持固态，避免细胞结构醇、明胶等破坏密封包装解析干燥在无菌条件下将干燥产品密封包装，充进一步升温除去残留水分，使含水量降入惰性气体正确包装的冻干菌粉可在至2-5%以下这一阶段需要精确控制温室温下保存10-20年度和真空度，确保产品质量冻干菌粉制备工艺流程菌体培养选择最适培养条件培养至对数生长期收集浓缩离心收集菌体，用保护剂悬浮至适当浓度预冻处理分装后快速冷冻至-40°C以下真空冻干在冻干机中进行升华和解析干燥质量检测检测含水量、活菌数和纯度液氮超低温保藏技术°-196C保存温度液氮沸点温度，微生物代谢完全停止

99.9%存活率正确操作下的微生物复苏存活率年50保存期限理论上可无限期保存的时间10mL标准用量每份样品的标准保存体积冻干法与液氮保藏技术对比比较项目冻干保藏液氮保藏初期投资设备成本较高储存设备投资大运行成本一次性成本低液氮消耗成本高保存期限10-20年理论上无限期操作复杂度制备工艺复杂日常操作简单存活率70-90%95-99%运输便利性常温运输需要特殊运输超低温冰箱保藏管理温度监控样品管理设备维护-80°C±2°C的严格温度控建立完善的样品分类存放系定期除霜和清洁，检查密封制，配备温度记录仪和报警统，使用专用冷冻盒和标条件和制冷系统建立预防系统建立24小时监控制签制定取用规程，尽量减性维护计划，及时更换易损度，确保温度异常时及时处少开门时间和频次建立样件配备备用电源，确保停理定期校准温度传感器，品位置记录，便于快速查电时的安全保障维护设备正常运行找安全操作使用防冻手套和护目镜等防护用品避免长时间接触超低温物品，防止冻伤建立紧急处理预案，培训操作人员安全意识菌种保藏常见问题与解决方案遗传变异问题长期保藏过程中菌株性状发生改变，失去原有特征微生物污染保藏样品受到外源微生物污染，影响菌株纯度复苏失败保藏菌株无法正常复苏生长，存活率显著下降针对这些问题，需要建立完善的质量控制体系定期进行菌株特性检测，确保遗传稳定性严格执行无菌操作规程，避免污染发生优化保藏条件和复苏程序，提高成功率菌种标签与档案管理系统标签规范要求电子档案建立标签内容应包括菌株编号、菌种建立完整的电子档案系统，记录名称、保藏日期、保藏方法和操菌株来源、分离鉴定、生物学特作人员信息使用防水防冻材料性和应用信息包括培养条件、制作，确保长期保存不褪色采代谢特征、抗性谱等详细数据用统一的编码规则，便于计算机定期备份数据，确保信息安全管理追踪管理制度建立菌株生命周期追踪系统，记录每次传代、检测和分发信息制定菌株使用登记制度，追踪去向和用途定期进行库存盘点，确保账实相符菌种传代与复苏操作流程复苏准备检查保藏样品状态，准备适宜的培养基和无菌器具确认菌株信息和保藏条件，选择合适的复苏方法样品处理冻干样品用无菌水或培养基复溶，冷冻样品快速融化避免剧烈振荡，防止细胞破裂接种培养将复苏的菌液接种到新鲜培养基上，置于适宜条件下培养观察生长情况，记录复苏效果质量检测进行纯度检查、形态观察和生化鉴定，确认菌株特性是否正常必要时进行分子鉴定验证保藏菌种质量检测方法纯度检测活性检测遗传稳定性通过平板划线分离、显微镜观察和选择测定菌株的生长能力、代谢活性和特征通过分子生物学方法检测DNA指纹图性培养基检测菌种纯度确保没有杂菌酶活性评估保藏对菌株生理功能的影谱、质粒稳定性和关键基因序列，确保污染，菌落形态一致响程度遗传特性未发生改变•平板菌落形态观察•生长曲线测定•RAPD指纹图谱分析•革兰氏染色检查•酶活性测试•质粒电泳检测•选择性培养基验证•代谢产物分析•16S rRNA测序生物安全等级与保藏管理级级BSL-1BSL-2低风险微生物，如大肠杆菌K12中等风险微生物，如金黄色葡萄球菌•基本实验室设施•生物安全柜操作•标准操作规程•限制人员进入•常规防护用品•特殊废物处理级级BSL-4BSL-3极高风险微生物，如埃博拉病毒高风险微生物，如结核分枝杆菌•完全隔离设施•密封实验室设计•正压防护服•负压通风系统•特殊销毁程序•严格准入控制微生物保藏保护剂的选择甘油类保护剂最常用的冷冻保护剂，浓度通常为10-20%能够降低冰点，减少冰晶形成对细胞膜的损伤适用于大多数细菌和酵母菌的冷冻保藏脱脂奶粉天然蛋白质保护剂，浓度为10-15%提供营养支持和保护作用，特别适合营养要求较高的微生物成本低廉，使用方便蔗糖和海藻糖糖类保护剂，能够稳定细胞膜结构和蛋白质构象海藻糖的保护效果优于蔗糖，但成本较高常用浓度为5-10%二甲基亚砜渗透性保护剂，能够穿透细胞膜保护细胞内结构主要用于真核微生物和细胞系的保藏使用浓度为5-10%，需注意毒性不同微生物类型的保藏策略细菌保藏革兰氏阳性菌耐受性强，适合多种保藏方法革兰氏阴性菌相对脆弱，推荐冻干或液氮保藏•斜面保藏3-6个月•甘油冷冻2-3年•冻干保藏10-20年酵母菌保藏细胞壁较厚，抗逆性强甘油冷冻法效果良好，冻干保藏成功率高注意防止细胞自溶•甘油冷冻最常用方法•冻干保藏长期保存首选•液氮保藏高价值菌株丝状真菌保藏孢子形式抗逆性强，菌丝体结构复杂需特殊处理硅胶干燥法适合孢子保藏•孢子悬液冷冻•硅胶干燥保藏•液体石蜡覆盖病毒保藏结构简单但极不稳定，需要宿主细胞或特殊培养系统必须采用超低温保藏方法•液氮保藏标准方法•超低温冰箱-80°C•冻干保藏特殊处理国际知名菌种资源库介绍中国微生物菌种保藏中心CGMCC成立于1979年，是中国最大的综合性微生物菌种保藏机构收藏菌株超过4万株，涵盖细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等各类微生物为科研院所和企业提供菌种资源服务美国典型培养物保藏中心ATCC是全球最具影响力的生物资源中心，成立于1925年收藏超过18,000株微生物，建立了严格的质量控制体系和国际标准其菌株广泛用于科研、教学和工业应用世界菌种保藏联盟WFCC协调全球菌种保藏工作，制定国际标准和最佳实践指南促进菌种资源共享和技术交流，推动微生物保藏技术的标准化发展目前有来自70多个国家的700多个成员机构中国菌种保藏事业发展现状120+保藏机构全国各类微生物保藏机构总数万15菌株总量各保藏机构收藏菌株累计数量85%覆盖率重要工业微生物的保藏覆盖程度年50发展历程中国微生物保藏事业发展年限国际微生物保藏标准体系标准ISO11133微生物学培养基的制备和质量控制国际标准规定了培养基成分、制备程序、质量检测和储存要求确保全球范围内培养基质量的一致性和可比性指导原则OECD经济合作与发展组织制定的生物资源中心管理指导原则涵盖质量管理、技术标准、数据管理和国际合作等方面为各国菌种保藏机构提供参考框架生物多样性公约CBD联合国生物多样性公约对微生物资源保护和利用的规定强调资源共享、惠益分享和可持续利用原则指导各国制定微生物资源管理政策微生物信息化管理系统建设数据采集录入信息查询检索建立标准化的菌株信息采集模板，包括提供多条件组合查询功能，支持按菌种分类学信息、生物学特性、保藏条件等名称、编号、特性等检索建立关键词基础数据实现条码扫描和自动识别功索引和智能搜索引擎能统计分析报告数据备份同步自动生成各类统计报表，分析菌株分建立多重备份机制，确保数据安全实布、使用频率和保藏效果为管理决策现与国际数据库的信息交换和共享提供数据支持菌种资源分发与共享机制申请审核用户提交菌种申请表，说明使用目的和研究计划合同签署签订材料转移协议，明确权利义务关系质量检测对分发菌株进行纯度和活性检测确认包装运输采用专业生物样品运输方式安全送达跟踪服务提供技术支持和使用情况跟踪发酵工业中的菌种保藏应用生产菌株管理菌种改良备份建立生产用菌株的分级保藏体系，包括种子库、工作库和生产库保存菌种改良过程中的关键中间株和亲本株为进一步改良提供遗确保生产连续性和产品质量稳定性定期检测菌株性能，及时更新传资源，防止优良性状丢失建立完整的育种谱系记录换代应急替代方案知识产权保护建立菌株应急保藏和快速复苏预案在生产菌株出现问题时，能够对具有商业价值的菌株进行专门保藏和管理建立严格的保密制度迅速启用备用菌株维持生产降低生产风险和经济损失和访问控制为专利申请和技术转让提供有力支撑药用微生物保藏典型案例1年发现1928弗莱明发现青霉菌的抗菌作用，开启抗生素时代原始菌株的保藏成为医学史上的重要里程碑2年代工业化1940青霉素进入大规模生产，产生菌株经过多轮选育和改良建立了完整的菌种保藏和管理体系3现代保藏技术采用冻干、液氮等先进保藏技术，确保青霉素产生菌的长期稳定保存为新药开发提供重要资源4持续改良发展通过基因工程和代谢工程技术，不断提高菌株产量和质量保藏技术也随之发展完善农业微生物菌剂保藏技术根瘤菌保藏生防菌保藏菌根菌保藏豆科植物共生的固氮根瘤菌对保藏条件生物防治菌株具有重要的农业应用价丛枝菌根真菌无法在无宿主条件下培要求严格推荐使用冻干法或液氮保值需要特别关注抗菌活性的维持，选养，保藏技术特殊需要与宿主植物共藏，保护剂选用脱脂奶粉或蔗糖溶液择合适的保藏方法和条件同保藏或采用孢子保藏法•培养温度28-30°C•孢子形式保藏优于营养体•孢子干燥保藏法•pH值

6.8-

7.2•硅胶干燥法效果良好•宿主根系共保藏•避光低温保存•冷冻保藏需加保护剂•低温冷藏条件•定期检测固氮活性•定期检测抗菌谱•萌发活性检测生物工程菌株的特殊保藏基因稳定性重组基因表达载体的稳定维持1质粒保持2外源质粒DNA的长期稳定性保证表达活性目标蛋白表达能力的维持检测抗性标记抗生素抗性等选择标记的保持生物安全严格的生物安全等级管理要求生物工程菌株的保藏需要特别关注遗传稳定性问题建议采用多重备份策略，同时保存菌株和重组载体定期进行分子生物学检测，确保目标基因和质粒的稳定性食品微生物的保藏管理乳酸菌保藏面包酵母发酵菌剂酸奶和发酵乳制品的面包和烘焙食品用酵奶酪、泡菜等发酵食核心菌种，包括嗜酸母菌株发酵能力是品的复合菌剂需要乳杆菌、双歧杆菌关键指标，保藏过程保持菌群平衡和相互等对氧气敏感，需中需要定期检测发酵作用关系采用混合厌氧或微氧环境保活性甘油冷冻法简保藏或分别保藏后重藏冻干法是首选的单有效新组合长期保藏方法酿酒微生物葡萄酒、黄酒等酒类发酵用菌耐酒精能力和风味产生能力是重要特性需要在保藏后验证发酵性能长期保藏中的遗传稳定性监控功能验证测试关键基因序列检测菌株的特异性功能，如酶活分子标记分析对重要功能基因进行测序分析，监性、代谢产物、抗性等确保菌株表型特征检测采用RAPD、AFLP等分子标记技控基因序列的稳定性特别关注与在长期保藏后仍保持预期的应用性定期观察菌株的形态学特征、生理术检测基因组DNA的变化建立应用功能相关的关键基因区域能生化特性和培养特征记录任何可菌株的分子指纹图谱，作为遗传稳见的变化，建立变化趋势档案这定性的判断标准是最直观的稳定性评估方法新兴保藏技术发展前沿微胶囊包埋技术将微生物包埋在生物相容性材料中，提供额外保护层微胶囊能够控制营养物质和代谢产物的交换，延长保存期限并提高存活率智能温控系统采用物联网技术实现温度的精确控制和实时监控配备自动报警和应急处理功能，确保保藏条件的稳定性和可靠性自动化保藏设备机器人自动化样品处理、存储和检索系统减少人工操作误差，提高工作效率，降低污染风险实现大规模菌种库的智能化管理振荡磁场保藏利用特定频率的磁场延缓微生物衰老过程通过调节细胞内生物大分子的构象，维持细胞活性该技术仍在实验阶段。