《微生物培养技术》课件

微生物培养技术微生物培养技术是现代生物学、医学和工业应用的基础技术之一本课程将系统介绍微生物培养的理论基础、实践技能和应用前景，帮助学生掌握从基础培养基制备到复杂发酵工艺的全套技术体系通过学习，学生将能够独立完成微生物的分离、纯化、培养和检测，为从事科研、医学检验、食品工业和生物制造等领域工作奠定坚实基础微生物培养技术在推动生物技术产业发展和解决人类面临的环境、健康等重大问题中发挥着不可替代的作用微生物学基础回顾细菌单细胞原核生物，细胞壁含肽聚糖，繁殖速度快，广泛分布于自然环境中，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等真菌真核微生物，包括酵母菌、霉菌和蘑菇，细胞壁含几丁质，在发酵工业和食品生产中应用广泛病毒非细胞性微生物，必须在活细胞内繁殖，由核酸和蛋白质外壳组成，在医学研究和疫苗生产中具有重要意义其他微生物包括原生动物、古细菌等，各具独特的生理特性和生态功能，为生物多样性研究提供重要材料微生物培养的应用领域科学研究与医学工业与环保应用微生物培养是基础生物学研究的核心技术，用于研究微生物的发酵工业利用微生物培养生产抗生素、酶制剂、有机酸和生物生理代谢、遗传变异和进化机制在医学领域，培养技术用于燃料等产品食品工业中，酵母菌和乳酸菌的培养是面包、酒病原体诊断、抗生素敏感性测试和疫苗研发类和发酵乳制品生产的关键环节现代分子生物学实验中，大肠杆菌等模式微生物的培养为基因环境保护领域，微生物培养技术用于污水处理、土壤修复和生克隆、蛋白表达提供了重要平台物降解，为解决环境污染问题提供了绿色解决方案培养技术发展简史1年显微镜发现1676列文虎克首次观察到微生物，开启了微生物学研究的新纪元，为后续培养技术的发展奠定了观察基础2年发酵理论1857巴斯德证明发酵是由微生物引起的，建立了微生物学理论基础，推动了无菌操作技术的发展3年固体培养基1881科赫发明了固体培养基和平板培养法，使微生物的分离和纯化成为可能，现代培养技术由此诞生4年抗生素发现1928弗莱明发现青霉素，开启了抗生素时代，微生物培养技术在医药工业中的应用价值得到充分体现微生物的营养需求碳源氮源微生物细胞碳骨架的来源蛋白质和核酸合成必需葡萄糖、淀粉等有机碳源氨基酸、蛋白胨等有机氮••等无机碳源硝酸盐、氨盐等无机氮•CO2•提供能量和构建细胞成分影响细胞生长速度••生长因子矿物质促进生长的特殊物质酶活性和细胞结构维持维生素族、生物素钾、镁、磷等大量元素•B•氨基酸、嘌呤嘧啶铁、锌、钼等微量元素••某些微生物必需补充参与代谢反应调节••微生物的最适生长条件温度条件不同微生物对温度要求差异显著嗜冷菌适宜℃，常温菌适宜℃，嗜热0-2020-45菌可在℃生长极端嗜热菌甚至能在℃以上存活，如深海热泉中的古细菌45-80100酸碱度控制大多数细菌适宜中性环境，酵母菌偏酸性，某些细菌如pH

6.5-

7.5pH

4.5-

6.5硫杆菌能在强酸环境中生存值直接影响酶活性和细胞膜稳定性pH1-2pH氧气需求好氧菌需要充足氧气进行呼吸，厌氧菌在无氧环境中生长，兼性厌氧菌能适应有氧和无氧条件微需氧菌需要低浓度氧气，氧气浓度过高反而抑制生长渗透压平衡微生物对渗透压敏感，需要适当的盐浓度维持细胞形态嗜盐菌能在高盐环境中生存，而普通微生物在高盐条件下会失水死亡培养基的渗透压调节至关重要微生物的生长曲线滞育期对数期稳定期衰亡期微生物适应新环境，细胞数细胞快速分裂增殖，生长速营养耗尽或毒素积累，细胞营养严重不足，死亡细胞数量不增加但代谢活跃，为分度达到最大，是培养和收获增殖与死亡达到平衡，细胞量超过新生细胞，总细胞数裂做准备的最佳时期总数保持恒定呈指数下降培养基的概述精确配方培养基化学成分完全已知的合成培养基半合成培养基含有部分天然成分的培养基天然培养基由天然有机物制成的基础培养基培养基是为微生物生长提供营养的人工配制的营养基质，是微生物培养技术的核心要素根据成分来源可分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基根据物理状态分为液体培养基和固体培养基根据用途可分为基础培养基、选择性培养基、鉴别培养基和富集培养基选择合适的培养基类型是成功培养微生物的关键步骤天然培养基肉汤培养基以牛肉浸膏为主要成分，含有丰富的氨基酸、维生素和矿物质制备简单，营养全面，但成分复杂难以控制，批次间可能存在差异广泛用于细菌的常规培养和增菌马铃薯培养基以马铃薯煮汁为基础，添加葡萄糖和琼脂制成偏酸性，特别pH适合真菌和酵母的培养制备成本低，原料易得，是真菌分离培养的首选培养基应用优势与局限天然培养基营养丰富，能满足大多数微生物的生长需求，但化学成分不明确，重现性差，不利于代谢研究在科研中逐渐被合成培养基替代，但在教学和常规检测中仍广泛应用合成培养基与选择性培养基合成培养基特点选择性培养基应用化学成分完全已知，可精确控制各营养成分的浓度，重现性好，通过添加抑制性物质或特殊营养成分，选择性促进特定微生物适用于代谢研究和工业生产常用的合成培养基如培养基，生长而抑制其他微生物如麦康凯培养基含有胆盐和结晶紫，M9含有明确的碳源、氮源、磷源和微量元素可选择性培养革兰阴性菌虽然制备成本较高，但能排除未知因子的干扰，为精确的科学在临床检验和环境监测中，选择性培养基是分离目标微生物的实验提供可靠基础重要工具，大大提高了检测效率和准确性鉴别性培养基颜色变化鉴别血平板鉴别生化反应鉴别形态学鉴别通过指示剂显示微根据溶血能力区分细菌，检测特定酶活性，如接结合菌落形态、细胞形pH生物代谢产物，如麦康溶血呈绿色，溶血触酶试验、吲哚试验等，状和染色特性，为微生αβ凯培养基中乳糖发酵菌呈透明圈，溶血无变通过生化反应模式确定物的初步鉴定提供重要γ呈红色，非发酵菌呈无化，用于链球菌分类微生物种类依据色培养基的制备流程原料称取按照配方精确称取各种成分，使用分析天平确保准确性，避免交叉污染溶解混合先溶解难溶性成分，再加入易溶成分，充分搅拌均匀，必要时加热助溶值调节pH使用计精确测定，用或调节至目标值，温度对pH NaOHHCl pH有影响需注意pH灭菌处理高压蒸汽灭菌℃保持分钟，热敏性成分需过滤除菌后无菌12115添加培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌过滤除菌℃高温高压分钟，最常用最可使用滤膜过滤，适用于热敏

121150.22μm靠的灭菌方法，能杀死所有微生物包括性物质如维生素、抗生素等，不能去除芽孢病毒化学灭菌紫外线消毒使用环氧乙烷等化学试剂，适用于精密波长紫外线照射，主要用于表254nm仪器和热敏材料，需充分通风排除残留面消毒和空气净化，穿透力有限培养基的储存与质量控制储存条件控制液体培养基℃冷藏保存，固体培养基室温避光存放避免反复冻融，4防止成分析出和变质标明制备日期和有效期有效期管理一般培养基有效期周，含有不稳定成分的培养基应现配现用定期2-4检查外观变化，如变色、沉淀、异味等污染防控使用无菌容器分装，避免开启后长时间暴露设置阴性对照检验无菌性，发现污染立即废弃处理质量验证用标准菌株验证培养基性能，检查生长促进能力和选择性记录批次信息，建立质量档案无菌操作的原则环境无菌化操作前清洁工作台面，使用酒精消毒，开启无菌工作台或酒精灯创造无菌区域75%个人防护到位佩戴无菌手套和口罩，穿着实验服，操作前充分洗手消毒，避免直接接触无菌物品器具彻底灭菌所有接触培养基和微生物的器具必须预先灭菌，使用前在酒精灯火焰中烧灼消毒无菌操作是微生物培养技术的基石，任何污染都可能导致实验失败或结果错误操作过程中要时刻保持无菌意识，动作轻柔避免产生气流，及时发现和纠正可能的污染源严格的无菌操作不仅保证实验结果的可靠性，也是实验室生物安全的重要保障常用无菌操作器材酒精灯与火焰灭菌提供高温火焰进行器具灭菌，操作简便成本低火焰温度可达℃，能快速杀死微生物使用时注意安全，保持火焰稳定蓝色800-1000接种环与接种针用于微生物的转移和接种，材质通常为铂丝或镍铬丝使用前后必须在火焰中烧红灭菌，冷却后方可接触培养基无菌工作台通过高效过滤器提供无菌空气流，创造局部无菌环境使用前需紫外灯照射分钟，操作时避免阻挡气流30接种技术390%主要接种方法成功率要求划线法、稀释法、平板法是最基础的三种熟练操作者的无菌接种成功率应达到90%接种技术以上24培养时间大多数细菌接种后小时可观察到明24-48显生长接种技术的关键在于无菌操作和适量接种接种量过大会导致菌落密度过高难以分离，接种量过小则可能无法观察到生长划线法适用于菌株保存和单菌落分离，稀释法用于计数和定量分析，平板法则广泛应用于常规培养掌握正确的接种技术是获得可靠实验结果的前提微生物的分离与纯化概述平板划线法1初次划线用接种环蘸取菌悬液，在平板区域来回划线，线条密集但1/4不重叠2二次划线烧灼接种环冷却后，从第一区域末端开始，在新区域进行划线3三次划线重复操作，在第三区域划线，逐渐稀释菌液浓度4培养观察倒置培养小时，观察单菌落形成，挑取分离菌落24-48稀释涂布法系列稀释制备到的系列稀释液，每次稀释倍，10^-110^-8100充分混匀定量涂布取稀释液滴加到琼脂平板中央，用无菌涂布棒均匀

0.1mL涂布培养计数℃培养小时，选择个菌落的平板进行计数3724-4830-300浓度计算根据菌落数和稀释倍数计算原液中的活菌浓度含气培养与厌氧培养厌氧培养系统微需氧培养厌氧培养瓶或厌氧手套箱为严格厌氧菌提供无氧环境使用产某些微生物如弯曲杆菌需要的低氧环境使用三气培5-15%气袋或氮气置换除去氧气，添加还原剂维持还原性环境厌氧养箱或产气袋调节氧气浓度，同时增加浓度至CO25-10%指示剂监测氧气浓度，确保培养条件达标这类细菌在食品安全检测中是重要的病原指标常用的厌氧菌如梭菌、拟杆菌等在临床和环境研究中具有重要掌握不同气体环境的控制技术对于特殊微生物的培养至关重要意义液体培养法振荡培养静置培养在恒温振荡器中进行，转速通培养瓶静置于恒温箱中，适用常为，保证充于厌氧菌或兼性厌氧菌培养150-200rpm分的氧气供应和营养混合适液面与空气接触有限，形成氧用于大多数好氧菌的快速繁殖，气梯度，不同深度微生物种类培养量大且操作简便可能不同通气培养通过无菌空气或特定气体混合物，严格控制溶氧量和值多用于pH工业发酵和精确的生理实验，设备复杂但控制精度高真核微生物培养方法酵母菌培养特点酵母菌适宜在弱酸性环境（）中生长，温度范围较宽pH

4.5-

6.5（℃）常用培养基含有酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖，20-30YEPD营养丰富促进快速生长培养时间通常比细菌长，需要小时24-72丝状真菌培养霉菌需要较低的水活度和通风良好的环境马铃薯葡萄糖琼脂（）是常用培养基，培养温度℃孢子萌发需要适当湿PDA25-28度，菌丝生长呈放射状，需要较大的培养空间培养条件优化真核微生物对环境变化敏感，需要稳定的培养条件光照对某些真菌孢子形成有影响，培养过程中要注意避光或提供特定光照营养成分的比对菌丝形态和代谢产物有显著影响C/N病毒的培养与宿主细胞细胞系建立病毒接种培养宿主细胞如、等细胞系，HeLa Vero将病毒样品接种到健康细胞中，控制感提供病毒复制所需的细胞机器和营养环染复数确保病毒能够有效感染细胞境病毒收获感染监测收集含病毒的细胞培养液，通过离心或观察细胞病变效应（），检测病3CPE过滤纯化病毒颗粒毒蛋白表达和核酸复制水平微生物数量的测定总述直接计数法平板计数法比浊法测定显微镜下直接观测定活菌数量的通过测量培养液察计数，包括血金标准，通过培的光密度估算细球计数板法和自养形成可见菌落胞浓度，快速简动细胞计数器，进行计数，准确便，适用于生长快速但无法区分性高但耗时较长曲线监测死活细胞分子计数法基于定量或DNA流式细胞术的现代方法，精度高速度快，逐渐在高端实验室普及平板计数法理想计数范围个菌落的平板最适合计数30-300统计学要求至少重复个平板，计算平均值和标准差3适当稀释倍数制备系列稀释，选择合适浓度进行涂布无菌操作基础整个过程必须严格保持无菌条件平板计数法的准确性受多种因素影响，包括稀释精度、涂布均匀性、培养条件和计数方法菌落重叠、片状生长或培养基污染都会影响计数结果音乐厅效应指高密度培养时菌落相互抑制，导致计数偏低正确的操作技术和质量控制措施是获得可靠结果的关键显微镜直接计数法样品准备将细胞悬液适当稀释，避免细胞重叠，加入台盼蓝等染料区分死活细胞计数板装载将样品滴加到血球计数板上，盖上盖玻片，避免气泡产生显微镜观察倍镜下观察，计数指定网格内的细胞数量，遵循计数规则400浓度计算根据计数结果、稀释倍数和计数板体积计算原样品中的细胞浓度比浊法光密度测定/

6000.1-

1.0测量波长线性范围是最常用的波长，对细菌细胞有良在此值范围内，光密度与细胞浓度呈良OD600OD好的线性响应好线性关系10^8对应细胞数大约对应个细胞OD600=

1.010^8-10^9/mL比浊法基于细胞对光的散射原理，光密度值与细胞浓度在一定范围内呈线性关系这种方法快速简便，特别适用于监测细菌生长曲线和发酵过程但是比浊法不能区分死活细胞，且受细胞大小、形状和培养基成分影响建立值与活菌数的标准曲线对于准确定量至OD关重要其他常用数量测定方法最可能数法（）自动化计数设备MPN用于估算低浓度微生物数量，特别适用于水质检测和食品微生现代实验室越来越多地采用自动菌落计数器、流式细胞仪等设物分析通过多管发酵试验和统计学方法估算细菌浓度，虽然备这些设备能够快速准确地进行细胞计数，减少人为误差，精度不如平板计数法，但适用于难培养微生物的定量提高工作效率常用于大肠菌群和粪大肠菌群的检测，是环境监测的重要技术图像分析软件能够识别和计数菌落，适用于大批量样品的处理手段流式细胞术还能同时分析细胞的多种参数实验五培养基制备与消毒灭菌1材料准备阶段准备牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂等原料，精确称量各组分检查天平精度，确保称量误差在允许范围内2溶解配制阶段按顺序溶解各组分，先加难溶性成分再加易溶成分加热助溶时控制温度，避免营养成分破坏用计调节至pH

7.2-

7.43灭菌处理阶段分装到锥形瓶中，用棉塞封口包扎高压灭菌锅℃处理分钟，12115注意排冷空气和压力释放过程4质量检验阶段灭菌后检查培养基外观，用标准菌株验证生长促进能力设置阴性对照检验无菌性，记录实验数据和观察结果实验六细菌的生理生化实验生理生化实验是细菌鉴定的重要手段，通过检测细菌的酶活性和代谢特征来确定菌种过氧化氢酶试验检测细菌分解过氧化氢的能力，阳性反应产生氧气泡沫氧化酶试验用于区分革兰阴性菌，阳性菌株使试剂呈紫色糖发酵试验观察细菌利用不同碳源的能力，产酸产气情况反映代谢类型吲哚试验检测色氨酸酶活性，甲基红试验检测混合酸发酵能力这些实验组合起来形成生化反应模式，为细菌的准确鉴定提供依据实验三微生物的数量测定样品系列稀释取菌悬液加入无菌水制成稀释液，依次制备1mL9mL10^-110^-至系列稀释每次稀释后充分振荡混匀，使用新的吸管避210^-8免交叉污染严格的稀释操作是准确计数的前提平板涂布操作取适当稀释度的菌液滴加到琼脂平板中央，用无菌型涂

0.1mL L布棒快速均匀涂布动作要轻柔避免划破琼脂表面，涂布要彻底覆盖整个平板表面每个稀释度至少做个重复平板3培养与计数将平板倒置放入℃培养箱培养小时选择菌落数在3724-48之间的平板进行计数，记录菌落数量和形态特征30-300计算原样品中的活菌浓度，分析实验误差来源实验十微生物的分离与纯化样品接种划线分离单菌落挑取纯度验证用无菌棉拭子采集环境样品，用接种环蘸取培养液，在琼培养后观察菌落形态，挑取重复划线纯化，显微镜检查接种到富集培养基中增菌培脂平板上进行三区域划线分形态典型的单个菌落转种到细胞形态一致性，确认获得养离新平板纯培养发酵工业中的微生物培养发酵罐系统工业发酵罐容积从几升到几百立方米不等，配备精确的温度、、溶pH氧和搅拌控制系统自动化监测确保培养条件的稳定性和一致性无菌控制技术采用蒸汽消毒、无菌空气过滤、清洗系统等多重保障所有进料管CIP路都配备无菌阀门和过滤器，防止杂菌污染过程监控优化实时监测细胞密度、代谢产物浓度、营养成分消耗等参数通过数据分析优化培养条件，提高产品得率和质量规模化生产从实验室小试到中试再到工业化生产的逐级放大过程每个阶段都需要验证工艺参数，确保产品质量和生产效率实验室发酵案例原料处理酵母接种麦芽糖化制备发酵培养基，调节糖度和活化干酵母或接种液体酵母培养物，控值，添加必需的营养成分如氮源和pH制接种量确保发酵启动快速而稳定矿物质产品收获发酵控制发酵完成后分离酵母沉淀，检测酒精含维持适宜温度℃，监测发酵进18-22量和风味物质，评价发酵效果程中糖分消耗和酒精产生情况理化因素对微生物生长的影响大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌环境微生物的培养与检测空气微生物检测使用沉降法、撞击法或过滤法采集空气中的微生物沉降法简单经济，撞击法效率高，过滤法适用于大体积采样不同方法检测结果可能有差异，需要标准化操作水体微生物分析水样采集后立即检测或℃保存使用膜过滤法浓缩微生物，选择性培养基分离特定菌群大肠菌群是常用的指示菌，反映水体粪便污染程度4土壤微生物培养土壤样品需要预处理去除大颗粒物质，制备悬液进行稀释培养土壤微生物种类繁多，需要多种培养基和培养条件功能菌群如固氮菌、纤维素分解菌有特殊的检测方法食用菌（如蘑菇）培养技术菌种制备从优质子实体分离纯化菌株，在培养基上培养获得母种菌丝体PDA原种扩繁将母种接种到小麦粒等谷物培养基上制备原种，为大规模栽培提供菌种栽培种制作用木屑、棉籽壳等农业废料配制栽培基质，接种原种制备栽培种出菇管理控制温度、湿度、光照和通风条件，诱导子实体形成和发育成熟食用菌培养是应用微生物学的典型实例，涉及无菌操作、营养调配、环境控制等多个技术环节现代工厂化生产采用标准化工艺和自动化设备，确保产品质量和生产效率不同品种的食用菌对培养条件要求不同，需要针对性地调整培养参数。