《生物化学分析原理》课件

生物化学分析原理生物化学分析原理是生命科学领域的核心课程，旨在探索生命活动的分子基础和化学机制本课程将系统介绍生物大分子的结构功能、代谢途径分析以及现代生化分析技术的原理与应用课程学习要求与考核方式成绩构成平时成绩占，包括课堂表现、作业完成情况和实验报告；期末考试占40%，主要考查理论知识掌握和分析应用能力60%实验要求完成个必修实验项目，包括蛋白质定量、酶活测定、分离纯化等核心技8术，实验报告需详细记录过程和结果分析学术论文撰写一篇生物化学分析相关的综述或研究报告，字数不少于字，要求3000引用不少于篇近五年的文献资料15课堂测验绪论生物化学分析的意义生命本质探索疾病诊断治疗产业技术应用生物化学分析是揭示生命活动分子机制现代医学诊断严重依赖生物化学分析技生物化学分析在农业、食品、环境、制的重要手段，通过对生物大分子结构和术，从常规的血液生化检验到复杂的分药等多个领域发挥重要作用，如转基因功能的深入研究，我们能够理解细胞代子诊断，都建立在生化分析原理基础作物检测、食品安全监控、环境污染物谢、基因表达调控等基本生命过程上分析等这些研究为理解遗传疾病的发生机制、肿瘤标志物检测、遗传病筛查、药物代这些应用不仅保障了公共健康安全，也细胞信号转导过程以及生物体适应环境谢监测等临床应用，直接关系到疾病的推动了生物技术产业的快速发展，为经变化的分子基础提供了重要依据早期发现、准确诊断和个性化治疗方案济社会发展提供了强有力的技术支撑的制定生物化学原理发展简史1年代有机化学突破1850-德国化学家沃勒首次人工合成尿素，打破了生命力学说，证明有机化合物可以通过化学方法合成，标志着生物化学学科的诞生2世纪初酶学兴起20-酶的发现和研究使人们认识到生物催化的重要性，米氏动力学方程的建立为酶学研究奠定了理论基础，推动了生化分析方法的发展3年代分子生物学革命1950-1980-双螺旋结构解析、遗传密码破译、技术发明等重大突破，使生物化DNA PCR学分析从宏观转向分子水平，开创了现代分子诊断时代4世纪组学与精密分析21-基因组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学技术的发展，结合高通量测序、质谱分析等精密仪器，实现了对生物系统的全面深入分析生物化学与其他学科的关系化学基础生物学融合有机化学、物理化学、分析化学提供理论基细胞生物学、分子生物学、遗传学深度结合础•分子结构与性质关系•细胞代谢途径•化学反应机理分析•基因表达调控•仪器分析原理•蛋白质功能研究物理数学支撑医学应用光学、电化学、统计学等提供技术手段临床诊断、药物开发、疾病机制研究•光谱分析原理•分子诊断技术•数据处理方法•生物标志物发现•仪器工作原理•个性化医疗生物体化学组成综述水分占细胞重量的，是生命活动的重要介质，参与各种生化反应，维持细胞渗透压和酸碱平衡70-80%有机大分子蛋白质、核酸、多糖、脂类构成细胞的主要结构成分，承担着催化、遗传、储能、膜结构等重要功能无机盐离子钠、钾、钙、镁、磷等离子维持细胞电解质平衡，参与酶活性调节和信号传导过程小分子代谢物氨基酸、糖类、维生素、激素等参与细胞代谢调控，作为酶的辅助因子或信号分子发挥作用生物大分子基础分类蛋白质核酸由氨基酸通过肽键连接形成的大分子，由核苷酸组成的信息大分子，包括具有复杂的三维结构承担催化、结和两大类储存遗传信DNA RNA DNA构、运输、免疫等多种生物功能，是生息，参与基因表达过程，是生命RNA命活动的主要执行者遗传的物质基础•酶蛋白催化生化反应•遗传信息储存-DNA-•结构蛋白维持细胞形态•遗传信息传递-mRNA-•载体蛋白运输物质•蛋白质合成-tRNA-多糖与脂类多糖主要起储能和结构支撑作用，如糖原、淀粉、纤维素脂类包括中性脂肪、磷脂、固醇等，参与能量储存、膜结构和信号传导•糖原动物储能多糖-•磷脂生物膜主要成分-•胆固醇膜流动性调节-蛋白质结构与功能四级结构多个多肽链的空间排列三级结构单个多肽链的整体折叠二级结构螺旋、折叠等局部结构αβ一级结构氨基酸序列蛋白质的功能完全由其结构决定酶蛋白通过活性中心的精确构型实现高效催化；载体蛋白通过构象变化实现物质运输；抗体蛋白通过可变区识别特定抗原蛋白质结构的任何改变都可能影响其功能，这是蛋白质工程和药物设计的重要理论基础核酸基础及生物信息传递结构特点功能多样性DNA RNA脱氧核糖核酸呈双螺旋结构，由两条反向平行的单链通过氢键结核糖核酸主要为单链结构，包括信使、转移、核糖体RNA RNA合碱基配对遵循、规律，保证了遗传信息的准确复等多种类型携带基因信息，运输氨基酸，A-T G-C RNAmRNA tRNA制和传递参与蛋白质合成rRNA分子稳定性高，适合长期储存遗传信息每个细胞含有相近年来发现的微小、长链非编码等调控性分子，DNA RNA RNARNA同的序列，但不同基因的表达调控决定了细胞的分化和功在基因表达调控中发挥重要作用，成为生物医学研究的新热点DNA能特化碳水化合物与能量代谢单糖基础葡萄糖、果糖等提供直接能量来源寡糖连接蔗糖、乳糖等双糖水解供能多糖储存糖原、淀粉作为能量储备形式碳水化合物是细胞最主要的能量来源，葡萄糖在细胞呼吸过程中被完全氧化，每摩尔葡萄糖可产生摩尔血糖浓度受到胰岛38ATP素、胰高血糖素等激素的精密调控，维持在的正常范围内糖原作为动物体内主要的糖类储存形式，主要分布在肝

4.4-

6.1mmol/L脏和肌肉中，在饥饿状态下分解供能脂质结构与生理功能储能功能膜结构组成信号传导甘油三酯是机体最主要的磷脂双分子层构成细胞膜前列腺素、白三烯等脂质能量储存形式，每克脂肪的基本框架，胆固醇调节介质参与炎症反应和免疫产生的是糖类的膜的流动性，蛋白质镶嵌调节，类固醇激素调控基ATP

2.25倍，为长期能量储备提供其中执行特定功能因表达和代谢过程保障辅助因子脂溶性维生素、、、ADE的吸收运输需要脂类参与，K这些维生素在视觉、骨代谢、抗氧化等方面发挥重要作用生物分子的定性分析方法样品预处理生物样品通常含有复杂的成分混合物，需要通过细胞破碎、蛋白沉淀、脱盐等步骤去除干扰物质，富集目标分子预处理质量直接影响后续分析的准确性和重现性分离纯化利用不同生物分子的理化性质差异进行分离，包括分子筛层析分离不同分子量组分、离子交换层析分离不同电荷组分、反相层析分离不同疏水性组分等特异性检测通过特征反应或特异性结合进行定性鉴定，如蛋白质的双缩脲反应呈紫色、的甲基绿染色呈绿色、多糖的碘碘化钾反应等DNA-经典颜色反应生物分子的定量分析方法光源选择标准曲线建立根据待测物质的吸收特性选择合适波用已知浓度的标准品绘制吸光度浓度-长，紫外光适用于核酸和蛋白质关系曲线，确保线性关系良好结果校正样品测定考虑稀释倍数、干扰物质等因素，对测在相同条件下测定未知样品的吸光度定结果进行必要的校正和验证值，通过标准曲线计算浓度酶的本质与分类酶的结构与活性中心活性位点酶分子中能与底物结合并催化反应的特定区域，通常由几个氨基酸残基组成活性位点的空间构型决定了酶的底物专一性和催化机制辅酶作用许多酶需要非蛋白质的辅助因子才能发挥催化活性，如、等电子载NAD+FAD体，以及各种维生素衍生的有机辅酶，参与电子传递和基团转移金属离子、、等金属离子作为酶的辅助因子，通过配位结合稳定酶的Mg2+Zn2+Fe2+构象，或直接参与催化反应过程，是许多酶活性必需的组分变构调节变构酶具有活性中心以外的调节位点，调节分子结合后引起酶构象变化，从而改变酶活性，这是细胞代谢调控的重要机制酶促反应动力学基础酶活性测定基本方法终点法在规定时间后停止反应，测定产物或底物的最终浓度连续监测法实时监测反应过程中吸光度的变化，计算初始反应速率条件控制严格控制、温度、离子强度等反应条件确保结果准确pH活性计算根据摩尔消光系数和反应体系计算酶活性单位酶的调控与生理意义4调控层次基因转录、蛋白修饰、变构调节、竞争抑制100+代谢酶种类参与糖酵解、柠檬酸循环等主要代谢途径10^6催化效率提升相比非催化反应的速率提高倍数°37C最适温度人体酶活性的最适温度条件酶调控是维持细胞稳态的关键机制变构调节通过调节分子与酶结合改变其活性；反馈抑制中代谢终产物抑制合成途径中的关键酶；酶的磷酸化修饰可快速改变其活性状态这些调控机制使细胞能够根据需要调整代谢强度，维持能量平衡和物质稳态酶工程与酶分析在生物化学中的应用工业酶制剂医疗检测应用通过基因工程技术改造酶的性质，提高其稳定性、催化效率和底酶联免疫吸附试验利用酶标记抗体实现高敏感性检测，ELISA物专一性洗涤剂中的蛋白酶、纺织工业中的纤维素酶、食品工广泛用于疾病诊断和药物监测血糖仪利用葡萄糖氧化酶的专一业中的淀粉酶等广泛应用性实现快速准确的血糖测定定向进化技术通过随机突变和筛选获得性能更优的酶变体，使酶心肌酶谱检测通过测定肌酸激酶、乳酸脱氢酶等特异性酶的活性能在极端条件下保持活性，满足工业生产的严苛要求变化，为心肌梗死的诊断提供重要依据，具有快速、特异、敏感的优点能量转换与生物氧化合成ATP合酶利用质子梯度驱动磷酸化ATP ADP电子传递和通过呼吸链传递电子NADH FADH2线粒体基质柠檬酸循环产生还原型辅酶生物氧化是细胞产生的核心过程，通过逐步氧化有机物释放的化学能转化为中的高能磷酸键线粒体内膜的电子传递链包含ATP ATP复合体，电子从传递到氧气，同时泵出质子形成电化学梯度合酶利用这一梯度合成，整个过程的效率约为I-IV NADHATP ATP，远高于非生物系统的能量转换效率38%糖代谢分析糖酵解柠檬酸循环葡萄糖分解为丙酮酸，产生和丙酮酸完全氧化，产生、、ATP CO2NADH，为细胞提供快速能源和NADH FADH2GTP戊糖磷酸途径糖异生产生和核糖，支持合成代谢和NADPH从非糖物质合成葡萄糖，维持血糖稳定抗氧化脂质代谢分析脂肪动员脂肪酶催化甘油三酯水解为甘油和脂肪酸，激素敏感性脂肪酶受胰高血糖素和肾上腺素激活，促进脂肪分解氧化β脂肪酸在线粒体中经历脱氢、水化、再脱氢、硫解四步反应，每轮产生一分子乙酰辅酶、和A FADH2NADH脂肪酸合成乙酰辅酶在胞质中经脂肪酸合酶催化合成长链脂肪酸，需要A NADPH提供还原力和提供能量ATP代谢调控胰岛素促进脂肪合成和储存，胰高血糖素和肾上腺素促进脂肪分解，维持能量代谢平衡氨基酸与蛋白质代谢氨基酸脱氨转氨反应氨基酸脱去氨基生成酮酸和氨氧氨基酸与酮酸之间的氨基转移，由α-α-化脱氨主要在肝脏进行，谷氨酸脱氢酶转氨酶催化丙氨酸转氨酶和天ALT催化谷氨酸脱氨产生酮戊二酸和冬氨酸转氨酶是临床重要的诊断α-AST氨指标•谷氨酸脱氢酶主要脱氨酶•肝功能指标-ALT-•联合脱氨转氨脱氨•心肌损伤指标-+AST-•嘌呤核苷酸循环肌肉脱氨•磷酸吡哆醛辅酶--尿素循环肝脏中氨的解毒过程，将有毒的氨转化为无毒的尿素包括鸟氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、精氨酸四个主要中间产物•氨甲酰磷酸合成酶限速酶I-消耗分子•3ATP•肝硬化时功能受损核酸代谢与检测1核苷酸合成嘌呤和嘧啶核苷酸的从头合成和补救合成途径，为复制和转录提DNA RNA供原料抗代谢药物如氟尿嘧啶通过抑制核苷酸合成发挥抗肿瘤作用5-核酸降解核酸酶将和降解为核苷酸，进一步分解为核苷和碱基嘌呤最终DNA RNA代谢产物为尿酸，嘧啶分解为丙氨酸和氨基异丁酸β-β-同位素标记标记探针用于杂交检测特定基因序列胸腺嘧啶32P DNASouthern3H-掺入法测定合成速率，反映细胞增殖活性DNA荧光检测荧光染料如、溴化乙锭结合后发出荧光，用于细胞周期分析荧DAPI DNA光原位杂交技术检测染色体异常和基因表达FISH生物样品的采集与预处理血液样品尿液样品组织样品细胞裂解血清和血浆是最常用的小时尿液收集用于组织匀浆需要在低温下机械破碎、渗透裂解、24临床检测样品血清不肾功能评估和代谢产物进行，防止蛋白酶活去垢剂裂解等方法根据含纤维蛋白原，适用于定量晨尿浓缩度高，化加入蛋白酶抑制剂实验目的选择分级离大多数生化指标检测适用于蛋白质、葡萄糖保护目标蛋心分离细胞核、线粒cocktail血浆保留凝血因子，用等定性检测尿液白组织固定用于形态体、微粒体等不同细胞pH于凝血功能检测和比重影响检测结果学观察和免疫组化器组分经典分离纯化技术亲和层析离子交换层析基于生物分子间特异性结合进行分离，如凝胶过滤层析利用蛋白质等电点差异进行分离，阳离子蛋白亲和层析纯化抗体、肝素亲和层析A根据分子大小分离蛋白质和核酸，大分子交换树脂结合带负电荷的蛋白质纯化凝血因子标签蛋白纯化是重组蛋DEAE-His先流出小分子后流出纤维素、纤维素是常用的离子交换介白表达中的标准方法Sephadex G-75CM-适用于分子量道尔顿的蛋质，梯度洗脱提高分离效果1000-80000白质分离，常用于脱盐和分子量测定分子吸收光谱分析荧光分析原理与应用激发原理分子吸收特定波长光子后电子跃迁至激发态，返回基态时发射更长波长荧光核酸标记、、等染料与结合发出荧光，用于细胞周期和凋亡DAPI PISYBR DNA检测蛋白标记、罗丹明等荧光素标记抗体，实现免疫荧光检测和流式细胞术分FITC析定量分析荧光强度与浓度呈正比关系，灵敏度比吸收光谱高个数量级2-3放射性同位素分析技术碳标记磷标记14¹⁴C32³²P半衰期年，代谢研究首选半衰期天，高能射线

573014.3β•¹⁴C-葡萄糖追踪糖代谢•³²P-ATP研究磷酸化氚标记安全防护³H•¹⁴C-乙酸研究脂肪酸合成•³²P-dCTP标记DNA探针半衰期年，适用于长期示踪•稳定性好便于储存•检测灵敏度极高辐射防护和废料处理规范

12.3•胸腺嘧啶标记合成•时间、距离、屏蔽原则³H-DNA•亮氨酸标记蛋白质合成•个人剂量监测³H-•安全性相对较高•放射性废料分类处理质谱分析在生物化学的应用精确质量测定亚级质量精度ppm结构解析碎裂模式分析MS/MS质量指纹图谱肽质量指纹法鉴定蛋白质样品预处理胰蛋白酶酶解制备肽段质谱技术通过测定离子的质荷比实现分子鉴定和定量分析质谱适用于蛋白质分子量测定和肽质量指纹分析，适用于在线MALDI-TOF ESI-MS联用分析串联质谱通过碎裂离子获得结构信息，是蛋白质组学研究的核心技术同位素标记结合质谱分析可实现蛋白质的相对和LC-MS MS/MS绝对定量免疫分析与生物大分子检测抗原抗体结合基于抗原抗体的高特异性结合，抗体可识别蛋白质上个氨基酸组成3-5的抗原表位单克隆抗体特异性高，多克隆抗体敏感性好，选择合适抗体是成功检测的关键检测技术ELISA酶联免疫吸附试验包括直接法、间接法、竞争法和双抗体夹心法辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶是常用的标记酶，催化底物HRP AP产生有色产物实现检测免疫层析技术基于毛细现象的快速检测方法，如妊娠试纸、抗原检COVID-19测等胶体金标记抗体在硝酸纤维素膜上形成可见条带，操作简便结果直观分子杂交与扩增PCR变性°退火°95C50-65C高温破坏双链氢键，模板链分离为引物与模板链特异性结合，退火温度根DNA单链，为引物结合创造条件据引物值设计，通常比低°Tm Tm5C循环扩增延伸°72C个循环实现的指数式扩聚合酶从引物端开始合成25-40DNA TaqDNA3增，理论上每轮循环使目标序列增加一新链，延伸时间根据产物长度确定倍生化自动分析仪原理自动化样本处理机械臂精确吸取血清样本，自动稀释配制反应体系，避免人工操作误差，提高检测通量和重现性试剂管理系统冷藏试剂自动上样，实时监测试剂余量和有效期，确保反应条件一致性和结果可靠性多波长检测光栅分光系统提供连续波长，同时检测多个生化指标，如肝340-800nm功能、肾功能、血脂等数据处理分析内置质控程序监测仪器性能，自动计算浓度并生成报告，与医院信息系统无缝对接生物芯片与高通量检测基因芯片技术蛋白芯片应用在固体基质上固定成千上万个探针，通过杂交检测样品中蛋白芯片将抗体、酶或其他蛋白质固定在芯片表面，实现蛋白质DNA对应基因的表达水平芯片采用原位合成技术，相互作用、酶活性检测和免疫分析与传统相比具有通量Affymetrix ELISA芯片使用预合成探针高、样品用量少的优势Illumina全基因组表达谱分析可同时检测万多个基因，为疾病分子分抗体芯片可同时检测数百种细胞因子和信号分子，组织芯片允许2型、药物靶点发现和个性化医疗提供重要工具数据标准化和生在单张载玻片上分析数百个组织样本，大大提高病理诊断和药物物信息学分析是获得可靠结论的关键筛选效率组学技术与大数据分析蛋白质组学代谢组学数据整合研究特定条件下细胞或分析细胞内所有小分子多组学数据融合分析揭组织表达的全部蛋白质，代谢物，反映基因型与示生物系统复杂性，需包括蛋白质鉴定、定量、表型的最终结果，为疾要强大的计算能力和先修饰分析和相互作用网病诊断和药物代谢研究进的算法支持络构建提供重要信息模式识别机器学习算法从海量数据中识别疾病特征模式，发现新的生物标志物和治疗靶点。