《生物大分子分离与分析》课件

生物大分子分离与分析欢迎来到《生物大分子分离与分析》课程本课程将系统介绍生物大分子分离与分析的技术原理、方法及其典型应用在接下来的学习中，我们将深入探讨蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的特性，以及如何利用各种分离和分析技术来研究这些复杂的生物分子课程导论生物大分子定义及分类生物大分子研究意义研究生物大分子有助于理生物大分子是生物体内分解生命现象的本质，阐明子量较大的有机物质，主疾病发生机制，开发新型要包括蛋白质、核酸、多药物和诊断方法，推动生糖和脂质等这些分子是物技术和医学的发展生命活动的物质基础，具有高度特异性的结构和功能行业领域应用概述生物大分子主要类型蛋白质核酸多糖由氨基酸通过肽键连接而成，是生命包括和，由核苷酸通过磷酸由单糖通过糖苷键连接而成，是生物DNA RNA活动的主要执行者蛋白质具有一二酯键连接而成主要储存遗传体重要的能量储备和结构物质多糖DNA级、二级、三级和四级结构，其空间信息，参与遗传信息的传递和表结构多样，可以是线性或分支状RNA构象决定了其生物学功能达多糖如淀粉、糖原、纤维素等在能量蛋白质分子量从几千道尔顿到上百万核酸的结构与其功能密切相关，如储存、细胞结构支持以及细胞识别等道尔顿不等，结构复杂多样，功能包的双螺旋结构确保了遗传信息的方面发挥重要作用DNA括催化、运输、防御、调节等稳定传递，而的多样结构则与其RNA多种功能相适应生物大分子的物理化学特征敏感性pH温度敏感性值改变会影响生物大分子的电荷分pH大多数生物大分子在高温环境下容易变布，进而影响其溶解度、结构稳定性和性失活蛋白质在高温下会发生三级结生物活性蛋白质在等电点时溶解度最构解折叠，核酸双链在高温下会解链小结构稳定性离子强度影响生物大分子的高级结构对其功能至关重盐离子浓度变化会影响生物大分子表面要，在分离纯化过程中需要维持其天然电荷的屏蔽效应，进而影响分子间相互构象以保留生物活性作用和溶解性生物样品预处理基础低温操作通常在°或冰浴条件下进行样品处理，减缓分子降解和酶促反应4C洁净环境避免微生物和外源污染，使用无菌器材和试剂缓和条件使用适当的缓冲系统维持稳定，添加保护剂保持分子活性pH在生物大分子分离分析过程中，样品预处理是关键的第一步合理的预处理不仅能保证后续分析的准确性，还能最大限度地保持生物大分子的完整性和活性常见的预处理方式包括组织匀浆、细胞裂解、去除干扰物质等，具体方法应根据样品类型和目标分子特性选择分离与纯化工艺路线初步分离通过离心、过滤等物理方法去除固体杂质，澄清样品溶液粗提纯通过沉淀、粗层析等方法进行初步纯化，去除大部分杂质精细纯化通过高分辨率层析、电泳等技术进一步提高纯度质量检测通过多种分析方法验证纯度、活性和结构完整性生物大分子的分离纯化工艺路线设计应遵循由粗到精、先易后难的原则，注重高选择性与高效率的平衡在整个工艺路线中，保持生物分子的活性是首要考虑因素，这要求我们在每一步操作中都要选择合适的条件和方法分析与定量的基本理念分析目的明确化方法可靠性保证在开始分析前，明确需要获取的信所选方法应具有足够的特异性、灵息类型是定性识别、定量测定，敏度、准确度和精密度，能够可靠还是结构表征不同目的决定了不地反映样品中目标分子的真实情况同的技术路线和精度要求方法验证是确保结果可靠的关键步骤数据质量控制通过设置标准品、空白对照、重复测定等质控措施，确保数据的真实性和可比性数据处理和统计分析同样重要，需要采用科学合理的方法生物大分子分析的基本理念是准确、可靠地获取目标分子的相关信息在实际工作中，我们需要根据分析目的选择合适的方法，控制好实验条件，进行严格的质量控制，才能获得科学可信的结果同时，分析方法的选择还需要考虑样品量、时间、成本等实际因素沉淀分离法原理溶解平衡盐析作用生物大分子在溶液中的溶解度受多种高浓度盐类通过减少水分子与蛋白质因素影响，当环境条件改变导致溶解表面的相互作用，降低蛋白质水合度下降时，分子会从溶液中析出形成度，促使蛋白质分子间疏水相互作用沉淀增强而聚集沉淀有机溶剂沉淀等电点沉淀有机溶剂降低溶液介电常数，减弱生当等于蛋白质等电点时，蛋白质pH物大分子水合，促进分子间相互作表面净电荷为零，分子间静电排斥减用，导致沉淀形成弱，易于聚集形成沉淀沉淀分离应用举例30-60%

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5.2硫酸铵饱和度酪蛋白等电点pH用于抗体的初步富集分离，在这一范围内牛奶中酪蛋白在此范围内达到等电点沉淀，IgG pH大部分会沉淀下来，而许多杂蛋白仍保持是乳制品加工的重要步骤IgG溶解状态70%乙醇浓度提取过程中，添加至此浓度的乙醇可有效RNA沉淀核酸，是分子生物学实验中常用的方法沉淀分离法因其操作简单、成本低廉、适用于大规模处理等优点，在生物大分子初步分离中广泛应用在实际应用中，常需要优化沉淀条件，如沉淀剂浓度、值、温度等，以获得最佳分离效pH果值得注意的是，沉淀过程可能导致某些敏感蛋白质活性丧失，因此需要针对具体样品选择合适的沉淀方法离心分离技术离心原理常见离心类型离心技术变种离心分离技术基于颗粒在离心力场中低速离心×用于差速离心通过逐步提高离心力，依3,000-5,000g沉降速率的差异进行分离当样品在分离细胞、大颗粒沉淀等，如血细胞次沉淀不同大小的颗粒高速旋转的离心机中旋转时，样品中分离密度梯度离心样品在预先制备的密的颗粒会受到离心力作用，向离心管高速离心×度梯度溶液中离心，颗粒在其等密度10,000-20,000g底部移动用于分离亚细胞器、大分子聚合体位置停留，实现更精细的分离沉降速率由颗粒的大小、密度、形状等，如线粒体分离等密度离心也称为平衡密度梯度离以及溶液的粘度等因素决定大颗粒超速离心心，颗粒在离心过程中移动到与其密100,000-和高密度颗粒沉降速率较快，而小颗×用于分离大分子、病度相等的位置500,000g粒和低密度颗粒沉降速率较慢毒颗粒、核糖体等，如蛋白质复合物分离离心应用实例细胞器分离通过差速离心技术，可依次分离获得细胞核、线粒体、微粒体和细胞质等不同细胞组分这种方法广泛应用于细胞生物学研究，为研究不同细胞器的功能提供了基础蛋白质复合物分离利用超速离心结合蔗糖密度梯度，可以分离不同大小和密度的蛋白质复合物这在研究蛋白质相互作用、多聚体形成等方面具有重要应用临床血液成分分离在临床上，离心技术用于将全血分离为血浆、白细胞层和红细胞等组分，为血液成分治疗和检测提供样品这是输血医学和血液检验的基础技术过滤与膜分离技术（定义与原理）微过滤MF孔径，分离微粒、细菌

0.1-10μm超滤UF2孔径，分离大分子蛋白、病毒

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0.1μm纳滤NF孔径，分离小分子有机物

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0.001μm反渗透RO孔径，分离离子级别物质

0.0001μm膜分离技术是基于半透膜的选择透过性原理，利用压力差、浓度差或电位差等驱动力，使不同大小的分子通过或被截留在膜两侧，从而实现分离膜分离过程中存在的主要现象包括筛分作用、溶解扩散和静电排斥等膜材料的选择直接影响分离效果，常用的膜材料包括聚砜、聚醚砜、再生纤维素、聚偏氟乙烯等不同材料具有不同的化学稳定性、机械强度和生物相容性，应根据分离对象特性选择合适的膜材料膜分离典型应用1蛋白质浓缩与脱盐利用超滤膜，可以在保留蛋白质的同时，去除样品中的小分子杂质和盐离子这是生物制药和蛋白质研究中常用的纯化手段，可大大提高后续纯化步骤的效率血液蛋白分离利用不同分子量截留值的超滤膜，可以从血浆中分离出白蛋白、球蛋白等不同组分这在血液制品工业中有重要应用，是生产血浆蛋白类药物的关键技术发酵液澄清微过滤膜可用于从发酵液中分离菌体和大颗粒杂质，获得澄清的粗产物溶液这在酶制剂、抗生素等生物产品的生产中广泛应用，提高了下游纯化工艺的效率病毒过滤利用病毒过滤膜，可以从生物制品中去除潜在的病毒污染，提高产品安全性这是生物制药领域病毒清除验证的重要方法之一，尤其对于来源于人或动物的生物制品至关重要透析技术基础半透膜原理透析技术利用半透膜的选择透过性，允许小分子物质通过而阻止大分子物质通过这种选择性主要取决于膜的孔径大小，通常以分子量截留值MWCO表示扩散作用透析过程中，小分子物质从高浓度区域向低浓度区域扩散，直至达到平衡这一过程遵循菲克定律，扩散速率与浓度梯度、膜面积成正比，与膜厚度成反比动力学特点透析是一个相对缓慢的过程，受多种因素影响，包括温度、搅拌状态、膜特性等通常需要多次更换透析外液或延长透析时间以达到理想效果设备类型常见的透析设备包括透析袋、透析管、透析盒等近年来，还发展了切向流透析、空心纤维透析等新型设备，提高了透析效率和自动化程度透析典型应用脱盐缓冲液更换样品纯化缓慢浓缩去除样品中的盐离子和小分子缓冲将样品从一种缓冲体系转移到另一去除反应产物中的小分子副产物或利用聚乙二醇等高分子物质吸水特成分种体系未反应物质性进行温和浓缩在纯化中，透析技术常用于去除限制性内切酶反应后的缓冲盐和酶蛋白，或去除连接反应中的未反应寡核苷酸和这对于提高后续转化效率和减少背DNA ATP景干扰至关重要在蛋白质研究中，透析是去除变性剂（如尿素、盐酸胍）的温和方法，可用于蛋白质复性过程通过逐步降低变性剂浓度，使蛋白质缓慢复性，最大程度保留其生物活性层析分离技术综述层析技术是一种基于组分在两相间分配系数差异而实现分离的方法固定相通常是柱中填充的固体材料，流动相则是通过柱的液体或气体不同组分在两相间的分配系数不同，导致它们在柱中的移动速度不同，从而实现分离根据分离机制的不同，层析技术可分为分子筛层析、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析、反相层析等多种类型各种层析技术各有特点，适用于不同性质的生物大分子分离，在实际应用中常结合使用，形成多步纯化策略分子筛层析原理固定相材料分子筛层析使用具有特定孔径的多孔材料作为固定相，如葡聚糖凝胶、Sephadex琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等这些材料形成三维网络结构，含有大Sepharose量大小均一的孔道分离机制小分子可以自由进入凝胶颗粒内部的孔道，在柱中的有效体积较大；而大分子无法进入小孔，只能在颗粒间的空隙中流动，有效体积较小因此，分子按照大小顺序洗脱大分子先出，小分子后出关键参数分子筛层析的关键参数包括凝胶的分子量排阻范围、柱体积、样品体积、流速等合理选择这些参数可以优化分离效果此外，洗脱体积与分子量的关系可用于估算未知蛋白的分子量分子筛层析又称凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，是一种基于分子大小差异的分离GFC SEC技术它在生物大分子研究中有广泛应用，特别适合于最终纯化步骤，可以有效去除聚集体、降解产物等大小异常的杂质分子筛层析案例离子交换层析原理基本原理离子交换剂类型影响因素离子交换层析基于带电分子与固定相上带阳离子交换剂含有负电荷基团（如磺酸值影响蛋白质和交换剂的电荷状态pH相反电荷的基团之间的可逆结合当值基、羧基），能结合正电一般选择使目标蛋白带有与交换剂相反电pH-SO3--COO-和离子强度适当时，带电的生物分子会吸荷蛋白质强阳离子交换剂如荷的值SP-pH附在离子交换剂上；随后通过改变值或在宽范围内都带负电，而pH Sepharose pH离子强度高盐浓度会减弱静电相互作用，增加盐浓度，使吸附的分子依次洗脱下来弱阳离子交换剂如的电CM-Sepharose用于洗脱结合的蛋白质通常采用盐浓度荷状态受影响较大pH梯度洗脱，使不同强度结合的蛋白质依次离子交换层析的选择性主要取决于分子的阴离子交换剂含有正电荷基团（如季铵洗脱净电荷、电荷分布以及分子表面的离子化基、氨基），能结合-N+CH33-NH3+温度影响离子化程度和结合动力学，通基团数量这使得即使是电荷差异很小的负电荷蛋白质强阴离子交换剂如Q-常在恒温条件下进行分子也能被有效分离在宽范围内都带正电，而SepharosepH弱阴离子交换剂如的DEAE-Sepharose电荷状态受影响较大pH离子交换层析应用吸附层析原理吸附机制吸附层析利用固定相表面与溶质分子之间的非共价相互作用，如氢键、范德华力、疏水相互作用等，使溶质分子从流动相中暂时转移到固定相表面不同分子与固定相的亲和力不同，导致它们在柱中的移动速度不同，从而实现分离固定相类型吸附层析常用的固定相材料包括活性炭、硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等这些材料具有大的比表面积和特定的表面化学性质，能够选择性地吸附不同类型的分子例如，活性炭对芳香族化合物和疏水性分子有较强的吸附能力，而羟基磷灰石则对蛋白质和核酸有良好的亲和性洗脱策略吸附在固定相上的分子可以通过改变流动相条件来洗脱常用的洗脱方法包括改变值，引起分子或固定相表面电荷状态变化；增加离子强度，pH减弱静电相互作用；添加有机溶剂，减弱疏水相互作用；使用竞争性配体，置换吸附的目标分子洗脱条件的选择应考虑目标分子的稳定性和活性保持脱色与脱盐层析活性炭脱色活性炭具有强大的吸附能力，可吸附溶液中的色素和其他有机杂质在酶制剂、抗生素等生产中，活性炭脱色是常用的纯化步骤凝胶过滤脱盐利用分子筛层析原理，大分子先洗脱，小分子盐离子后洗脱，实现生物大分子与盐的分离是常用的脱盐介质Sephadex G-25离子交换脱盐利用混合床离子交换树脂，同时去除阳离子和阴离子，获得低离子强度的生物大分子溶液常用于需要低盐环境的分析和实验脱色和脱盐是生物大分子纯化中的重要步骤，直接影响产品的纯度和后续处理效果在实际应用中，脱色通常在初级纯化阶段进行，去除发酵液或提取液中的色素和多酚类物质；而脱盐则多在精细纯化后进行，为后续冻干或制剂化做准备现代生物技术中，还发展了许多高效的脱盐方法，如超滤、渗透透析、离子交换膜等，可根据样品特性和处理规模选择合适的方法值得注意的是，脱盐过程中应避免生物大分子的变性和活性损失，可通过添加稳定剂或控制操作条件来保护样品亲和层析基础亲和层析原理固定化配基材料亲和层析基于生物分子之间的特异常用的固定相载体包括琼脂糖、纤性相互作用，如抗原抗体、酶底维素、聚丙烯酰胺等配基与载体--物、受体配体等通过将一种特异的连接通常通过活化剂（如-性配体（如抗体）共价连接到固定、偶联剂等）实现理想的CNBr相材料上，可以从复杂混合物中特固定化配基应具有高特异性、高结异性地捕获目标分子（如抗原），合容量、良好的化学稳定性和可重然后通过改变条件将目标分子洗脱复使用性常用的配基包括抗体、下来，实现高选择性的分离纯化蛋白、凝集素、金属螯合剂A/G等洗脱策略亲和层析的洗脱通常采用以下方法值改变（酸性或碱性洗脱）、高盐浓pH度、变性剂（如尿素）、竞争性配体、特异性洗脱剂等洗脱条件的选择需要平衡洗脱效率与目标分子活性保持之间的关系，避免过于苛刻的条件导致生物活性丧失亲和层析实际应用抗体纯化重组蛋白纯化糖蛋白分离蛋白亲和层析是纯化抗体（特别是金属螯合亲和层析是纯化带有凝集素亲和层析利用凝集素（如A/G IMACCon类）的最常用方法蛋白能特标签重组蛋白的主要方法利用镍、、等）与特定糖基的特异性结IgG A/G HisA WGA异性结合抗体的区，使抗体从血清或钴等金属离子与组氨酸残基的特异性结合，可从混合物中分离特定糖基化模式Fc细胞培养上清中高效分离这一技术是合，可以从大肠杆菌或其他表达系统的的糖蛋白这一技术在糖蛋白研究和糖抗体药物生产的核心纯化步骤，通常可裂解液中一步获得高纯度的目标蛋白基化分析中有重要应用，能揭示蛋白质达到以上的纯度翻译后修饰的差异90%膜层析与新型材料膜层析原理高通量优势膜层析结合了膜分离和层析技术的优膜层析流速快、背压低，处理能力是1点，利用功能化膜作为固定相，样品传统颗粒层析的倍，特别适合大5-10中的目标分子通过对流流动（而非扩规模生物制品的快速纯化散）快速接触膜表面，实现高效分离新型材料发展自动化趋势单分散聚合物、金属有机骨架、分子现代膜层析系统集成了自动化控制、印迹聚合物等新型材料的应用，进一在线监测和清洁验证等功能，大大提步提升了层析分离的选择性和容量高了操作便捷性和过程可靠性膜层析技术在生物制药领域的应用日益广泛，特别是在抗体药物的生产中，膜吸附剂已经部分取代了传统的颗粒层析材料例如，蛋白膜层析可用于抗体的捕获纯化，阳离子交换膜可用于去除聚集体和宿主细胞蛋白，病毒过滤膜可用于去除潜在的病毒污染A电泳分离原理基本原理影响因素电泳技术类型电泳是利用带电分子在电场作用下的迁值影响分子的电荷状态当等区带电泳最基本的电泳形式，样品在pH pH移行为进行分离的技术带电分子在电于蛋白质的等电点时，蛋白质不带净电均匀缓冲液中迁移，形成独立的区带场中的移动速度取决于其电荷与质量之荷，不发生迁移凝胶电泳使用凝胶作为支持介质，结比、分子形状、支持介质的阻力以及电电场强度电压越高，分子移动速度越合分子筛效应增强分离场强度等因素快，但过高的电压可能导致样品变性或等电聚焦电泳利用梯度，使蛋白pH正电荷分子向负极（阴极）移动，负电支持介质过热质在其等电点处聚焦荷分子向正极（阳极）移动移动速度支持介质如琼脂糖、聚丙烯酰胺等，与分子所带电荷成正比，与分子大小和脉冲场凝胶电泳通过周期性改变电场提供分子筛效应，增强分离效果不同介质阻力成反比方向，分离大分子DNA浓度和交联度的凝胶适用于不同大小范围的分子分离毛细管电泳在细管中进行电泳，具有高分辨率和高灵敏度胶体电泳类型聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PAGE原态保持蛋白质天然状态的电泳，主要基于蛋白质的电电泳利用琼脂糖凝胶分离片段因磷酸骨架PAGE DNA DNA DNA荷与大小进行分离适用于分析蛋白质的天然构象和活性带负电，在电场中向阳极迁移，移动速度与分子量成反比常用于产物分析、限制性酶切分析等PCR在变性条件下进行的电泳，使蛋白质变性并SDS-PAGE SDS赋予均一负电荷，使分离主要基于分子量是蛋白质分子量测定电泳通常在变性条件下进行，以防止二级结构形RNA RNA和纯度分析的标准方法成常用于总完整性检测、印迹等分析RNA Northern双向电泳结合等电聚焦和，先按等电点分离，再脉冲场凝胶电泳通过周期性改变电场方向，使大分子SDS-PAGE PFGE按分子量分离，形成二维图谱是蛋白质组学研究的重要工具能够在凝胶中重新取向，实现大片段的分离常用于DNA DNA染色体分析和基因组图谱构建DNA胶体电泳是生物大分子分析的基础技术，具有操作简便、成本低廉、分辨率高等优点在现代分子生物学、蛋白质组学和基因组学研究中，电泳技术仍然是不可或缺的分析工具电泳结果通常需要通过染色（如考马斯亮蓝、银染、溴化乙锭等）或免疫印迹等方法进行可视化和进一步分析电泳分析结果判读条带清晰度评估高质量的电泳结果应具有清晰的条带和低背景干扰条带模糊可能表明样品降解、过载或电泳条件不适合背景染色过重可能表明染色脱色不当或样品纯度低/分子量确定通过与已知分子量标准物的迁移距离比较，可确定目标分子的分子量通常绘制标准曲线（迁移距离对分子量对数的关系曲线）进行计算准确的分子量测定有助于确认目标分子的身份纯度与含量分析通过扫描密度分析，可以计算目标条带占总蛋白的百分比，评估样品纯度同时，与已知浓度标准品比较，可以估算目标蛋白的含量现代图像分析软件可以提供快速准确的定量结果变异体与修饰分析电泳可检测蛋白质的电荷变异体、分子量变异体以及翻译后修饰例如，糖基化蛋白通常表现为弥散条带或分子量高于理论值；磷酸化可能导致电荷变化和迁移率改变等电聚焦电泳等电聚焦原理等电聚焦电泳（）是基于蛋白质在梯度中迁移到其等电点（）位置的IEF pH pI技术蛋白质在低于其时带正电，向阴极移动；在高于其时带负pH pI pHpI电，向阳极移动；当到达等于其的区域时，蛋白质不带净电荷，停止迁pIpH移，从而在特定位置聚焦梯度形成pH现代主要使用固定梯度（）条带，通过共价结合的两性电解质IEF pH IPG在凝胶中形成稳定的梯度与传统的载体两性电解质相比，提供了pHIPG更高的稳定性和重现性，已成为蛋白质组学研究的标准工具应用领域等电聚焦是高分辨率分离蛋白质的强大工具，能区分等电点差异仅为单位的蛋白质它广泛应用于蛋白质组学研究、翻译后修饰

0.01pH分析、蛋白质变异体鉴定以及生物制药产品的质量控制作为二维电泳的第一维，与结合可提供蛋白质组的全面分离图谱IEF SDS-PAGE电泳技术拓展毛细管电泳微流控芯片电泳数字电泳PCR毛细管电泳（）在细内径将电泳系统微型化到芯片上，结合数字和高分辨率电泳CE PCR（通常）的毛细实现样品处理、分离和检测的技术，可实现单分子水平的核20-100μm管中进行分离，具有高效率、集成具有分析速度快、高通酸分析这一技术对于稀有突高分辨率、样品和试剂消耗少量、自动化程度高等优势，是变检测、基因拷贝数变异分析等优点可应用于多种生物现代生物分析的前沿技术等具有重要应用价值CE大分子分析，包括蛋白质、核酸、糖类等自动化电泳系统现代电泳仪器集成了样品加载、电泳分离、染色检测和数据分/析等功能，大大提高了工作效率和结果重现性代表性系统包括生物分析仪、Agilent2100自动电泳工作站等Bio-Rad层析与电泳联合分析2D LC-MS二维分离液质联用等电聚焦电泳结合，形成高分辨率蛋液相色谱与质谱联用，实现复杂混合物的高效分离SDS-PAGE白质组分离系统，可分离数千种蛋白质与高灵敏度检测3D三维分离结合尺寸排阻、离子交换和疏水相互作用三种机制，实现更全面的蛋白质组覆盖多维分离策略通过结合不同的分离机制，显著提高了生物大分子分析的分辨率和覆盖度例如，在蛋白质组学研究中，多肽混合物首先通过强阳离子交换层析分成多个级分，然后每个级分再通过反相液相色谱进行进一步分离，最后通过质谱进行鉴定这种多维分离策略可以识别数万种蛋白质，极大地提高了蛋白质组分析的深度在基因组学研究中，二维电泳（如脉冲场凝胶电泳结合常规电泳）可用于复杂样品的高分辨率分DNA离在代谢组学研究中，气相色谱与液相色谱的联合使用可覆盖更广泛的代谢物种类这些多维分离技术是现代组学研究的关键支撑色谱仪器简介高效液相色谱（）气相色谱（）HPLC GC是一种在高压下使流动相通使用气体作为流动相，通过挥发HPLC GC过填充有固定相的色谱柱进行分离性差异分离组分主要包括气源系的技术其核心组件包括泵系统统、进样口、色谱柱（毛细管柱或（提供恒定或梯度流动相）、进样填充柱）、检测器和数据系统GC器、色谱柱、检测器和数据处理系适用于分析挥发性和热稳定性好的统的分离效率高、速度化合物，在小分子代谢物、脂类分HPLC快、适用范围广，是生物大分子分析中具有重要应用析的主力设备常见检测方式常用检测器包括紫外可见吸收检测器、荧光检测器、示差折光检测HPLC-器、蒸发光散射检测器和质谱检测器等常用的检测器有火焰离子化检测GC器、热导检测器、电子捕获检测器和质谱检测器等检测器的选择应基于分析物的特性和检测需求应用案例HPLC在生物分子分析的应用GC小分子代谢物检测脂类分析适用于分析挥发性或经衍生化后是分析脂肪酸组成的标准方法GC GC变得挥发的小分子代谢物在代谢组通过甲酯化等衍生化处理，可以将脂学研究中，是检测和量化氨肪酸转化为挥发性甲酯进行分析这GC-MS基酸、有机酸、糖类、脂肪酸等小分在食品科学、营养学和脂质组学中具子代谢物的强大工具有重要应用生物标志物研究蛋白质组学补充可用于发现和验证疾病相关GC-MS在蛋白质组学研究中，可作GC-MS的小分子生物标志物例如，在癌为补充技术，分析蛋白质翻译后修饰4症、代谢疾病等研究中，分GC-MS相关的小分子例如，蛋白质糖基化析尿液、血液或组织样品中的代谢物修饰分析中，可用于单糖组GC-MS变化，有助于疾病机制研究和诊断标成和连接方式的确定志物开发光谱分析原理光与物质相互作用吸收光谱基础常见光谱技术光谱分析基于电磁辐射与物质相互作用产紫外可见吸收光谱是最常用的光谱分析紫外可见吸收光谱用于分子的定性和--生的现象，包括吸收、发射、散射、反射方法之一根据朗伯比尔定律定量分析，特别适合含有发色团的分子-等不同分子因其化学结构不同，与光的（），吸光度与溶液浓度和A=εcl Ac荧光光谱分子吸收光后发射较长波长光相互作用也不同，产生特征性的光谱光程长度成正比，比例系数是摩尔吸lε的现象，灵敏度高，选择性好光系数，反映分子对特定波长光的吸收能在紫外可见光谱区域（-190-力红外光谱反映分子振动和转动能级，用），主要是分子中的电子、非800nmπ于结构分析和官能团鉴定键电子发生跃迁；在红外区域（这一定律是光谱定量分析的基础通过测

2.5-），主要是分子振动能级跃迁；在量样品在特定波长的吸光度，与标准曲线25μm拉曼光谱基于分子振动引起的散射光频核磁共振区域，是原子核自旋状态的跃比较，可以准确测定样品浓度率变化，与红外光谱互补迁核磁共振提供分子中原子环境的NMR详细信息，是结构解析的强大工具紫外分光测定蛋白核酸/质谱分析与联用技术精确分子量测定分辨率高达小数点后位4-6结构解析碎片离子提供分子结构信息修饰分析检测翻译后修饰及其位点定量分析相对和绝对定量方法联用技术等多维分析LC-MS,GC-MS质谱分析是基于将分子电离后，根据质荷比进行分离和检测的技术现代生物质谱主要使用电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离等软电离技m/z ESIMALDI术，能够保持生物大分子的完整性质谱分析器种类多样，包括四极杆、离子阱、飞行时间、静电场轨道阱等，各有优势质谱在生物大分子分析中的优势超高灵敏度现代质谱仪可检测飞摩尔甚至阿托摩尔级别的样品，比传统分析方法灵敏度高出数个数量级这使得极低丰度蛋白质的检测和分析成为可能，对于生物标志物发现和稀有修饰分析至关重要高特异性质谱可提供分子的精确质量和结构信息，具有极高的特异性尤其是串联质谱MS/MS技术，通过碎片离子谱图可以确定氨基酸序列或核苷酸序列，是蛋白质鉴定的金标准方法翻译后修饰分析质谱可以精确定位和表征蛋白质翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、泛素化等这PTMs些修饰对蛋白质功能调控至关重要，但传统方法难以全面分析质谱技术已成为研PTMs究的核心工具蛋白质组学应用液相色谱串联质谱是现代蛋白质组学的基础技术，可在单次实验中鉴定和-LC-MS/MS定量数千种蛋白质结合标记如、或无标记定量技术，可进行高通量蛋白质iTRAQ TMT组比较分析，揭示疾病机制和药物作用靶点样品自动化处理趋势液体处理工作站自动化液体处理系统可执行精确的移液、分装、混合等操作，处理从微升至毫升范围的样品现代工作站配备多通道移液头，可同时处理或孔板，极大提高通量96384样品追踪系统基于条形码或技术的样品管理系统，实现样品从采集到分析全过程的追踪与实RFID验室信息管理系统集成，确保数据完整性和可追溯性，减少人为错误LIMS集成自动化平台结合机械臂、传送带、孵育器等设备，形成完整的自动化工作流可执行从样品制备到分析的全过程，如蛋白质提取、酶解、脱盐、上样等，最大程度减少人工干预智能控制软件先进的调度算法和机器学习技术优化工作流程，提高设备利用率和样品处理效率用户友好的界面允许操作者轻松设计和监控复杂实验流程，甚至可远程操作生物大分子在线分析实时监控技术在线分析方法利用各类传感器和检测器实时监测分将分析设备与分离系统直接连接，实离过程中的关键参数，如吸光度、pH2现连续采样和分析，无需人工干预值、电导率、压力、温度等过程控制策略质量保证体系基于在线分析结果，自动调整工艺参通过实时数据收集和分析，确保产品数，如流速、梯度、值等，实现闭pH质量符合预设标准，提高批次一致性环控制在生物制药生产中，在线分析技术已成为过程分析技术的核心组成部分例如，在单克隆抗体纯化过程中，紫外检测器监PAT测蛋白浓度变化，电导率计监测盐浓度，计监测值，这些数据结合软件算法可自动控制收集点，确保产品纯度和得率pH pH分离纯化的组合优化明确目标与要求确定纯度、产量、活性保留等关键指标流程设计原则正交性、高分辨第

一、粗分离在前单步优化与整合平衡各步骤效率，消除瓶颈环节生物大分子的纯化通常需要多步骤组合才能达到目标纯度在设计纯化流程时，应遵循正交性原则，即选择基于不同分离机制的技术组合，如尺寸、电荷、疏水性等，以最大化去除杂质的能力通常将高通量但分辨率较低的技术（如沉淀、粗层析）用于初步纯化，将高分辨率但处理量较小的技术（如精细层析、电泳）用于最终纯化在多步骤纯化中，每一步的条件优化不仅要考虑单步效率，还要考虑与前后步骤的衔接例如，上一步的洗脱条件应尽量与下一步的起始条件兼容，减少中间处理步骤此外，应权衡纯度与得率的关系，特别是对于高价值产品，有时宁可牺牲一些得率也要确保产品纯度和质量典型案例重组蛋白的分离表达系统选择大肠杆菌是最常用的原核表达系统，适合表达不需要复杂翻译后修饰的蛋白质对于需要糖基化等修饰的蛋白质，可选择酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统表达系统的选择直接影响后续纯化策略细胞破碎根据表达系统和蛋白质特性选择适当的破碎方法对于大肠杆菌，常用超声破碎、高压均质或冻融溶菌酶处理；对于动物细胞，通常采用温和的裂解缓冲液破碎过程中-添加蛋白酶抑制剂保护目标蛋白初步纯化通过离心去除细胞碎片后，可采用硫酸铵沉淀、热处理（对于热稳定蛋白）或初步层析（如离子交换、疏水相互作用等）进行粗纯化，去除大部分杂质蛋白和核酸亲和纯化对于带有亲和标签（如标签、标签）的重组蛋白，亲和层析是最有效的纯化方His GST法例如，标签蛋白可通过镍亲和层析一步获得高纯度根据需要，可使用特异性His蛋白酶切除标签，再通过第二次亲和层析去除未切除的蛋白和标签典型案例单克隆抗体纯化蛋白亲和层析A蛋白是从金黄色葡萄球菌分离的细胞壁蛋白，能特异性结合多种的区蛋白亲和层析是抗体纯化的核心步骤，可一步获得以上纯度的抗体通常使用低缓冲A IgGFc A90%pH液（）洗脱，洗脱后立即中和以保持抗体活性pH

2.5-

3.5离子交换层析蛋白亲和层析后，通常使用阳离子交换层析作为抛光步骤，去除聚集体、电荷变异体和残留宿主细胞蛋白大多数在中性下带轻微正电荷，适合使用阳离子交换剂A IgGpH通过调节和盐浓度梯度优化分离条件，可有效去除杂质pH病毒过滤对于治疗用抗体，病毒清除是必要的安全步骤通常采用纳米级病毒过滤膜（孔径）进行病毒过滤，能去除大多数病毒颗粒而允许抗体通过此外，低处理15-35nm pH（蛋白洗脱步骤）也有灭活某些病毒的作用，两者结合提供多重病毒清除保障A典型案例基因组提取DNA细胞裂解方法纯化方法DNA化学裂解法使用、蛋白酶等试剂破坏细胞膜和核膜，释放酚氯仿抽提法经典方法，利用有机溶剂与水相分离，留在SDS K-DNA优点是操作简便，适用于多种样品类型；缺点是可能引入水相，蛋白质变性聚集在界面优点是收率高，适合大规模提取；DNA化学污染物缺点是使用有毒试剂，步骤繁琐机械裂解法通过研磨、超声、珠磨等物理方式破碎细胞优点是盐析法使用高浓度盐（如）促使蛋白质沉淀，保持溶NaCl DNA效率高，适用于坚硬组织；缺点是可能导致剪切解，再用乙醇沉淀优点是操作简单，无毒；缺点是纯度较DNA DNA低酶法裂解使用溶菌酶、蛋白酶等酶制剂温和裂解细胞优点是特异性高，完整性好；缺点是成本较高，有些样品效果不佳硅胶膜吸附法在高浓度混沌阳离子（如盐酸胍）存在下，DNA DNA选择性吸附到硅胶膜上，杂质被洗脱，再用低盐缓冲液洗脱DNA优点是纯度高，操作快捷；缺点是收率可能较低磁珠法使用带有亲和配基的磁性微粒捕获，通过磁力DNADNA分离，再洗脱优点是易于自动化，污染少；缺点是成本较DNA高典型案例总、分离RNA miRNA样品裂解使用含有强变性剂（如异硫氰酸胍）的裂解液破坏细胞结构，同时迅速灭活内源性，防止降解部分商业试剂还添加巯基乙醇和蛋白酶增强裂解效果RNase RNAβ-K提取RNA常用方法包括

①酚氯仿法经典方法，利用酸性条件下留在水相而和蛋白质-RNA DNA进入有机相或界面的特性；

②硅胶膜法在高盐条件下选择性结合硅胶膜，杂质被洗RNA脱；

③磁珠法使用带有亲和基团的磁珠捕获，便于自动化操作RNA RNA3小富集RNA等小提取需要特殊策略

①改良的沉淀条件调整乙醇浓度，优先沉淀小miRNA RNA；

②尺寸排阻层析利用分子筛原理分离不同大小的；

③特异性捕获使用互补RNA RNA探针特异性捕获目标小商业试剂盒通常优化了这些方法，简化操作流程RNA4质量评估提取的需要评估质量

①纯度通过（应）和（应RNA A260/A

2801.8A260/A230）比值评估蛋白质和有机溶剂污染；

②完整性通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪检

2.0查和条带清晰度，计算完整性数值；

③浓度通过分光光度法28S18S rRNARNA RIN或荧光染料法测定挑战与解决方案活性损失问题降解防止措施生物大分子在分离纯化过程中容易因温生物大分子易受酶促降解，特别是蛋白度、、剪切力等因素导致变性或活性质和核酸容易被内源性蛋白酶和核酸酶pH损失解决方案包括维持适宜温度降解防止措施包括快速低温操作、（通常°操作）、使用缓冲系统控制添加各类抑制剂（如、等4C PMSFEDTA、添加稳定剂（如糖类、表面活性蛋白酶抑制剂，抑制剂等）、避pH RNase剂）、减少不必要的冻融循环、使用温免微生物污染、去除潜在降解酶（如通和分离技术等对于特别敏感的蛋白过热处理灭活核酸酶）等样品制备和质，可考虑添加特异性配体或辅因子维保存条件也应优化，如使用适当保存缓持活性构象冲液，分装避免反复冻融高通量与工业化难题从实验室规模到工业化生产面临多重挑战，包括放大效应、一致性控制、成本控制等解决方案包括开发连续化、自动化生产工艺；采用一次性技术减少交叉污染和清洗验证负担；优化工艺设计减少步骤和中间产物处理；建立完善的过程分析技术实时PAT监控产品质量；应用质量源于设计理念，通过深入理解关键质量属性和关键工艺QbD参数，确保产品质量稳定可控国内外最新进展智能分离设备新型层析材料膜技术突破近年来，人工智能和机器学习层析材料领域出现多项创新新一代膜材料如石墨烯膜、仿技术逐渐应用于生物分离设备，高容量单分散聚合物颗粒大幅生膜等展现出优异的分离性能，实现自主优化分离条件、预测提高蛋白结合能力；新型亲和具有更高的通量和选择性功分离效果和故障诊断例如，配基如人工抗体、适配体等提能化膜技术将特异性结合位点智能层析系统可根据样品特性供更高选择性；可控孔径材料引入膜结构，实现高效生物分自动调整洗脱梯度，大大提高和单体结构材料实现更精准的子捕获，是膜分离领域的重要分离效率分子分离方向微型化与集成微流控芯片技术将复杂的分离分析流程微型化，实现样品制备、分离、检测的一体化其优势在于样品和试剂消耗少、分析速度快、便于自动化和高通量操作，特别适合单细胞分析等新兴领域课程内容回顾分离技术基础理论沉淀、离心、过滤、膜分离、层析、电泳等各类分离方法生物大分子的物理化学特性、分离与分析的基本原理分析方法光谱分析、色谱分析、质谱分析等定性定量技术前沿发展应用案例自动化、高通量、新材料、微型化等技术趋势蛋白质、核酸、抗体等生物大分子的分离分析实例通过本课程的学习，我们系统了解了生物大分子分离与分析的理论基础和技术方法从样品预处理到最终分析，我们掌握了一系列分离技术的原理和应用，包括各类沉淀法、离心技术、膜分离、各种层析方法和电泳技术等同时，我们也学习了光谱分析、色谱分析和质谱分析等重要的分析方法，了解了它们在生物大分子研究中的关键作用未来发展与挑战单细胞分离分析从单个细胞水平揭示生物学个体差异多组学数据整合蛋白质组、基因组、代谢组等数据的系统分析绿色分离技术减少有机溶剂使用，开发环境友好的分离方法高效率大规模生产4连续化、自动化工艺，降低生物制品成本智能化与数字化人工智能辅助分离工艺设计和优化生物大分子分离与分析技术正经历快速发展，单细胞分析技术突破了传统批量分析的局限，能够揭示细胞间的异质性；多组学数据整合则为理解生物系统提供了更全面的视角与此同时，行业面临着发展绿色、环保分离技术的压力，以减少有机溶剂使用和废弃物产生思考与讨论如何选择最佳分离策略？临床应用中的挑战在面对特定生物大分子时，我们应如何综合考虑样品性质、目生物大分子分析技术在临床诊断中面临哪些特殊挑战？如何提标纯度、规模和成本等因素，制定最优的分离纯化策略？不同高检测的灵敏度和特异性？点快速检测技术的发展方of-care分离技术的组合如何达到最佳协同效果？向是什么？工业化生产的瓶颈新技术的应用前景生物制药领域的分离纯化工艺面临哪些放大和成本控制挑战？人工智能、微流控技术、新型材料等创新技术将如何重塑生物如何平衡产品质量与生产效率？一次性技术和连续生产工艺将大分子分离与分析领域？这些技术在实际应用中还面临哪些技如何改变行业格局？术和监管障碍？。