《生物实验技术》课件

生物实验技术生物实验技术是现代生命科学研究的核心组成部分，涵盖了从基础的实验室安全规范到前沿的分子生物学技术等各个方面通过系统性的实验技能训练，研究人员能够深入探索生命现象的奥秘，推动生物医学、农业科学、环境保护等领域的创新发展本课程将全面介绍生物实验的基本概念、操作技能和应用实例，帮助学习者掌握扎实的实验基础，培养严谨的科学态度和创新思维能力实验室安全与规范管理要点个人防护装备5S整理、整顿、清扫、清正确佩戴实验服、护目洁、素养五个环节确保实镜、手套等防护用品，严验室环境安全有序，有效格按照实验要求选择合适降低事故风险的防护等级安全处置方法建立完善的化学品和生物样品分类储存、标识管理和废料处理流程，确保实验安全常用实验室仪器与设备离心机设备显微镜系统移液器工具高速离心机转速可达光学显微镜提供倍放大倍精密移液器量程从不等，15000-10-

10000.1-1000μL，适用于细胞分离、蛋白数，荧光显微镜可观察特定标记分准确度可达每日使用前检查密20000rpm±1%纯化等实验台式离心机操作简便，子定期清洁镜头、校准光路系统、封性，定期校准确保移液精度，及时主要用于日常样品处理正确设置转更换光源灯泡是维护显微镜正常工作更换吸头避免交叉污染速和时间参数是确保实验成功的关的必要措施键样品采集与处理流程植物样品采集选择健康植株的新鲜叶片或根系，避免病虫害组织，采集后立即液氮冷冻保存动物样品获取严格按照实验动物伦理要求，采用适当麻醉方法，快速准确获取目标组织微生物培养无菌条件下接种培养，控制温度湿度，定期观察生长状态并记录形态特征样品保存运输根据样品特性选择冷冻、冷藏或常温保存，确保运输过程中温度稳定实验记录和数据管理实验日志内容原始数据格式详细记录实验日期、操作步采用标准化的数据记录表格，骤、试剂配方、观察现象等信包含样品编号、测量数值、单息使用防水笔书写，避免涂位、测量条件等要素数字记改，确保记录的真实性和可追录精确到仪器精度，避免主观溯性建立统一的记录格式标推测和数据修饰准数据保存追踪建立电子档案备份系统，定期备份重要实验数据使用版本控制管理数据修改历史，确保数据安全和完整性，便于后续分析和验证溶液浓度与配置缓冲液配制浓度计算方法水质要求标准缓冲液，含摩尔浓度计算公式蒸馏水电导率PBS pH

7.

4、，质量百分比浓，超纯水电137mM NaCl

2.7mM C=n/V10μS/cm、磷酸盐度计算考虑溶质密导率，KCl10mM

0.1μS/cm缓冲液常用浓度稀释计算使用分子生Tris-HCl TOC10ppb度为，范公式，配制物学实验需使用10-50mM pHC1V1=C2V2DEPC围，适用于蛋时先加少量溶剂溶解处理水去除污

7.0-

8.5RNase白质实验后定容染，确保实验结果准确性移液技巧与操作规范正确握持姿势垂直握持移液器，拇指轻压活塞，保持手腕稳定选择合适量程的移液器，避免在最大或最小量程边缘操作精确移液操作吸头完全插入液面下方，缓慢松开活塞吸取液体，2-3mm避免产生气泡排液时贴住容器壁面，确保液体完全释放校准维护方法每季度使用标准重量法校准移液器精度，检查活塞弹性和密封性及时更换磨损的密封圈，定期清洁内部管路系统样品离心技术超高速离心转速达100,000rpm以上，用于蛋白质纯化和亚细胞结构分离高速离心转速15,000-30,000rpm，细胞破碎、DNA/RNA提取的常用方法低速离心转速1,000-6,000rpm，用于细胞沉淀、血液分离等基础操作离心力计算公式RCF=

1.12×R×rpm/1000²，其中R为半径cm操作前检查转子平衡，确保离心管对称放置，避免转子损坏和实验事故显微镜观察与成像光学系统调节调整目镜视度差，校准光轴对中，设置适当的光圈和聚光镜位置选择合适的物镜倍数，从低倍镜开始观察，逐步切换到高倍镜进行细节观察荧光成像操作选择正确的激发和发射滤光片组合，调整激发光强度避免荧光漂白控制曝光时间获得最佳信噪比，使用防褪色封片剂延长观察时间图像采集优化设置适当的分辨率和色彩深度，确保图像质量满足分析需求使用标准化的成像参数，保证不同样品间的可比性，及时保存原始图像数据细胞培养原理温度控制气体环境大多数哺乳动物细胞适宜温度维持培养基稳定37°C5%CO₂pH培养箱恒温系统湿度保持以上•CO₂•95%•温度波动范围±

0.1°C•定期校准气体浓度无菌操作营养供给超净工作台层流保护完全培养基含氨基酸、维生素、无机盐•75%酒精表面消毒•血清提供生长因子无菌技术培训抗生素预防污染••微生物实验基础接种操作培养基配制火焰灭菌接种环，无菌条件下挑取菌培养基含胰蛋白胨、酵母提LB10g/L落，采用三区划线法或涂布法接种到取物、，调至，5g/L NaCl10g/L pH

7.0新鲜培养基上高温高压灭菌计数分析菌落观察选择个菌落的平板进行计记录菌落形态、大小、颜色、质地等30-300数，应用稀释倍数计算原始样品中的特征，计算菌落形成单位，分析CFU活菌数量生长曲线变化分子生物学实验引论提取技术提取方法质量检测指标DNA RNA法适用于植物组织，能有效去除试剂含异硫氰酸胍，能快速裂紫外分光光度计检测比CTAB TRIzolA260/A280多糖和多酚类化合物酚氯仿法是经解细胞并抑制活性操作过程值，纯净为，为RNase DNA

1.8-

2.0RNA

2.0-典提取方法，通过有机溶剂分相分离需严格防止污染，使用处琼脂糖凝胶电泳观察核酸完整RNase DEPC

2.2核酸商业试剂盒方法操作简便，采理水和无试剂提取的需性，无降解条带表明质量良好浓度RNase RNA用硅胶膜吸附原理，提取效率高且重立即进行处理或保存测定精确到级别DNase-80°C ng/μL现性好基因扩增技术（）PCR反应体系组成热循环参数电泳结果分析标准反应体系包含模板预变性分钟，循环变性琼脂糖凝胶电泳检测产25μL DNA94°C3-

51.5%PCR，引物各秒，退火物，对比确定片段50-500ng

0.2-94°C3050-65°C30DNA marker，，酶秒，延伸分钟，最终延大小，观察条带亮度评估扩增效

1.0μM dNTPs

0.2mM Taq72°C1/kb，缓冲液和伸分钟率

0.5-

2.5U MgCl₂72°C10电泳技术原理与应用凝胶制备琼脂糖浓度

0.8-

2.0%适用于DNA分离，聚丙烯酰胺凝胶用于蛋白质分析电泳操作样品加载染料后上样，设置适当电压和时间，监控电泳进程结果记录EB染色或安全染料显色，紫外透射仪下拍照记录条带信息故障排查无条带检查模板质量，条带模糊调整电压参数，拖尾现象优化缓冲液分子克隆基础酶切反应选择合适的限制性内切酶，37°C反应1-3小时，确保切割位点完全开放，回收目的片段连接反应T4DNA连接酶催化载体与插入片段连接，16°C过夜反应或室温2小时，摩尔比例1:3-5转化操作制备感受态细胞，冰浴条件下与质粒混合，42°C热激90秒，冰浴恢复后涂布选择培养基阳性筛选抗生素抗性筛选，蓝白斑筛选，菌落PCR验证，质粒提取后酶切鉴定插入片段正确性蛋白质提取与纯化细胞裂解物理破碎结合化学裂解，加入蛋白酶抑制剂防止降解粗纯化盐析沉淀去除大部分杂蛋白，硫酸铵分级沉淀初步富集目标蛋白层析分离离子交换层析基于电荷差异，凝胶过滤基于分子量差异分离蛋白纯度检测电泳检查纯度，法或法测定蛋白浓度SDS-PAGE BradfordBCA（）实验WB WesternBlot蛋白电泳SDS-PAGE分离蛋白质，根据分子量选择合适的凝胶浓度，确保目标蛋白完全分离转膜过程半干转或湿转将蛋白从凝胶转移到PVDF膜，控制电流和时间防止过热封闭孵育5%脱脂奶粉或BSA封闭非特异性结合位点，一抗4°C过夜，二抗室温1小时信号检测ECL化学发光检测，X光片曝光或数字成像系统采集信号，分析条带强度免疫组化与ELISA组织切片染色检测原理ELISA石蜡切片脱蜡水化，抗原修复包被抗原固定在微孔板，样品恢复抗原活性，内源性过氧化中的抗体与抗原结合，酶标二物酶封闭一抗特异性结合目抗识别形成复合物底物TMB标抗原，二抗偶联辣根过氧化被酶催化产生蓝色产物，硫酸物酶，显色呈现棕黄色阳终止反应转为黄色，波DAB450nm性信号长检测吸光度试剂盒操作实例严格按照说明书操作，注意试剂平衡至室温，孵育时间和温度精确控制标准品绘制标准曲线，样品浓度根据回归方程计算，重复实验确保结果可靠性酶活性与生化分析Km Vmax米氏常数最大反应速率反映酶与底物的亲和力，数值越小亲和力酶被底物饱和时的反应速率，反映酶活性越强大小kcat转换数单位时间内单个酶分子转化底物的分子数酶活性测定采用分光光度法监测底物消耗或产物生成，绘制米氏方程双倒数图计算动力学参数常用的生化试剂包括ATP、NADH、辅酶A等，需严格控制pH值和离子强度，确保酶活性测定的准确性和重现性细胞周期与流式细胞仪细胞周期检测染色含量分析，期细胞含量为，期细胞合PI DNAG0/G1DNA2n SDNA成增加，期达到流式细胞仪激光激发荧光，检测器收G2/M4n PMT集信号生成直方图多参数分析检测细胞凋亡，标志物检测细胞表面抗原表FITC-Annexin VPE-CD达双参数散点图分析不同细胞亚群，门控技术精确定量目标细胞比例数据处理流程软件进行数据分析，设置适当的门控参数排除细胞碎片和双联FlowJo体统计学分析比较不同处理组间的差异，绘制柱状图展示实验结果细胞凋亡与分选技术凋亡检测磁珠分选结合磷脂酰丝氨酸，磁性微珠偶联特异性抗体，磁场作用Annexin V-FITC染色细胞核，双染色区分早期下分离目标细胞，阳性选择或阴性选PI DNA凋亡、晚期凋亡和坏死细胞择获得纯化细胞群细胞培养荧光分选分选后细胞立即转移到培养基中，监系统根据荧光强度和散射光分选FACS测细胞活力和增殖能力，评估分选对细胞，单细胞水平精确分离，纯度可细胞功能的影响达以上95%实验动物基础知识常用实验动物级标准动物福利规范SPF小鼠是最常用的哺乳动物模型，繁殖无特定病原体动物饲养环境严格控制遵循原则替代、减3R Replacement周期短、基因背景清楚大鼠体型较温度，湿度，小时少、优化20-26°C40-70%12Reduction Refinement大便于手术操作，生理指标与人类相光照周期空气过滤除菌，正压梯度提供充足的食物水源，适宜的栖息环似度高兔子主要用于抗体制备和药防止污染定期监测病原微生物，确境，减少应激反应人道处死方法包物安全性评价，豚鼠常用于过敏反应保动物健康状态括窒息和颈椎脱臼CO₂研究动物实验基本操作麻醉技术异氟烷吸入麻醉起效快、恢复迅速，戊巴比妥钠腹腔注射用于短时手术监测呼吸频率和心率评估麻醉深度采血方法眼眶静脉丛采血适用于小鼠，心脏穿刺获得大量血样，尾静脉采血用于重复采样严格无菌操作防止感染解剖操作CO₂安乐死后立即解剖，快速分离目标器官，液氮冷冻或固定液保存记录器官重量和形态特征伦理审批实验前提交动物实验申请，详细说明实验目的、方法和动物使用数量定期接受伦理委员会监督检查干细胞与诱导分化神经细胞分化维甲酸诱导神经管形成，神经生长因子促进轴突延伸心肌细胞诱导BMP4和Activin A处理形成中胚层，后续分化为跳动心肌细胞骨软骨分化地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸诱导成骨细胞分化多能性维持LIF、bFGF等因子维持胚胎干细胞自我更新能力重编程技术5Oct

4、Sox

2、Klf

4、c-Myc四因子诱导体细胞重编程为iPSC基因编辑技术简介系统靶向效率评估CRISPR-Cas9引导蛋白精酶切检测突变效率，guide RNACas9T7E1确识别目标序列，在测序验证具体突变类型DNA序列上游个碱基处产检测敲除基因的PAM3qPCR生双链断裂修复过程中水平变化，mRNA Western引入突变实现基因敲除或确认蛋白表达缺失blot插入功能脱靶分析方法生物信息学预测潜在脱靶位点，扩增后测序验证全基因组PCR测序检测意外突变，确保基因编辑的特异性和安全性生物芯片技术与应用芯片原理设计探针固定在硅片或玻璃基质上，形成高密度阵列样品提DNA RNA取后逆转录合成，荧光标记后与芯片杂交杂交信号强度反cDNA映基因表达水平差异样本制备流程总质量检测合格后，采用引物逆转录合成第一链RNA oligo-dT和荧光染料分别标记对照组和实验组样品，混合cDNA Cy3Cy5后加样到芯片进行杂交反应数据分析应用激光扫描仪获取荧光信号，专业软件进行图像分析和数据标准化差异表达基因筛选、功能富集分析、信号通路分析揭示生物学意义，应用于疾病诊断和药物开发生物光学成像技术荧光成像GFP、RFP等荧光蛋白标记细胞和组织，特定波长激发产生荧光信号多光谱成像区分不同荧光标记物生物发光荧光素酶催化荧光素氧化反应产生光子，无需外源激发光常用于肿瘤转移、感染扩散的动态监测活体成像高灵敏度CCD相机捕获微弱光信号，麻醉动物固定在成像平台，实时监测生物过程变化定量分析ROI区域光子计数，背景信号扣除，时间序列分析信号变化趋势，统计学检验评估处理效果行为学分析实验迷宫实验设计Morris水迷宫检测空间学习记忆能力，八臂迷宫评估工作记忆Y迷宫测试自发交替行为，高架十字迷宫评估焦虑水平实验前适应环境减少应激反应视频追踪系统高分辨率摄像头记录动物行为轨迹，红外线照明确保暗环境下正常拍摄自动追踪软件识别动物位置，计算运动距离、速度和停留时间等参数行为指标统计逃避潜伏期反映学习能力，平台象限停留时间评估记忆保持开臂进入次数和时间比例量化焦虑程度，总距离评估运动活性水平代谢实验技术神经生物学实验技术神经环路示踪脑片制备观察逆行示踪剂如荧光金注射到投快速断头取脑，冰冷人工脑脊射区，标记投射神经元胞体液中切片厚度振动400μm顺行示踪剂从胞体运输到切片机精确控制切片质量，保BDA轴突末梢，显示投射纤维分持神经元活性免疫荧光染色布病毒载体转基因标记特定观察蛋白表达分布模式类型神经元电生理记录玻璃微电极胞外记录动作电位，膜片钳技术测量离子通道电流场电位记录群体神经元同步活动，诱导检测突触可塑性变化LTP环境与生态实验土壤采样技术采用五点采样法或蛇形采样法，采集0-20cm表层土壤使用无菌采样器避免交叉污染，GPS定位记录采样点坐标水体监测方法水质采样瓶预先酸洗处理，现场测定pH、溶解氧、温度等指标不同深度分层采样，冷藏运输保持样品活性大气环境检测大气采样器收集颗粒物和气体污染物，滤膜称重法测定PM

2.5浓度气相色谱检测挥发性有机化合物含量生态数据统计SPSS软件进行方差分析，R语言绘制生态网络图多元统计分析环境因子与生物群落的相关性关系分子遗传学实验范例基因型检测表型观察记录扩增目标基因片段，限制性内切详细记录亲本和子代的形态特征，按PCR1酶消化产生特征性条带标记照标准化描述符记录数据拍照记录CAPS利用酶切位点多态性区分不同基因型典型表型，建立表型数据库假说验证遗传比例分析设计对照实验验证遗传假说，重复实卡方检验验证分离比是否符合孟德尔验确保结果可靠性统计学分析支持定律，计算重组频率确定基因间连锁或否定初始假设关系构建遗传图谱定位基因遗传群体学实验He Fst预期杂合度群体分化系数反映群体遗传多样性水平，数值越高多样衡量群体间遗传分化程度，范围0-1，值性越丰富越大分化越明显Ne有效群体大小对群体遗传结构有贡献的个体数量，影响遗传漂变强度微卫星标记检测等位基因频率，计算哈迪-温伯格平衡偏离度STRUCTURE软件进行群体遗传结构分析，主成分分析显示群体间遗传关系基因流估算评估群体间基因交流水平，为保护遗传学提供科学依据实验化学品分类与管理危险品标识系统分类储存原则应急处置流程红色标签标识易燃物质如乙醇、丙易燃液体储存在防爆柜中，强酸强碱化学品泄漏立即疏散人员，佩戴防护酮，黄色警示氧化剂如过氧化氢蓝分开存放防止反应剧毒化学品双人装备处理酸碱泄漏用中和剂处理，色表示健康危害物质，白色标识腐蚀双锁管理，建立详细的使用记录台有机溶剂泄漏用吸附材料清除眼部性化学品如强酸强碱全球统一账通风良好、温度适宜的专用库房接触立即大量清水冲洗，皮肤接触脱GHS标识系统提供标准化安全信息确保储存安全去污染衣物冲洗生物医学常用技术综述临床样本处理血液、尿液、组织活检标准化采集流程，冷链运输保存病理学检查组织形态学观察，免疫组化辅助诊断，分子病理学分析分子诊断技术3基因突变检测，病原体核酸检测，个体化医疗指导生物标志物发现4蛋白质组学筛选疾病标志物，代谢组学分析代谢通路转化医学研究将基础科学发现转化为临床应用，缩短从实验室到病床的距离临床试验设计需要严格的对照和随机化，确保新技术的安全性和有效性质粒构建与转染质粒设计酶切连接转染方法效率评价选择合适的载体骨架，设计多限制性内切酶切割载体和插入脂质体介导转染效率高毒性荧光蛋白报告基因检测转染效克隆位点插入目的基因添加片段，T4连接酶催化粘性末低，电穿孔适用于难转染细胞率，qPCR定量分析目的基因启动子、终止子和选择标记基端连接形成重组质粒系，磷酸钙沉淀法经济实用表达水平因原位杂交与FISH1探针制备标记DIG标记或生物素标记的DNA探针，荧光素直接标记或间接检测系统探针长度500-1000bp确保特异性杂交，避免非特异性结合杂交条件优化变性温度80-90°C破坏DNA双链结构，杂交温度37-50°C促进探针与目标序列结合盐浓度和甲酰胺浓度影响杂交严谨性信号检测分析荧光显微镜观察杂交信号，数字图像分析系统定量荧光强度阳性信号呈现特定的细胞核或染色体定位模式故障排查方法无信号检查探针活性和杂交条件，背景高调整洗涤严谨性，信号弱增加探针浓度或延长杂交时间实验室管理与团队合作分工协作机制进度管理系统数据共享交流建立明确的角色分甘特图制定实验时间实验室信息管理系统工，技术员负责日常表，里程碑节点检查记录所有实验数LIMS维护，研究生承担具实验进度仪器预约据，云端存储确保数体实验，指导实验系统避免使用冲突，据安全定期学术讨PI设计定期团队会议样品处理流水线提高论会分享最新进展，交流进展，共享实验效率紧急实验绿色邀请外部专家讲座拓经验和技术诀窍通道确保重要项目顺展视野利进行实验误差与质量控制随机误差阳性对照操作技术不稳定引起验证实验系统有效性增加重复次数已知阳性样品••系统误差阴性对照标准化操作程序标准反应条件••仪器校准不准确导致排除非特异性干扰定期校准标准化空白对照组••标准品质量追溯溶剂对照组••。