生物工艺学复习（提纲版） 2

第二章工业微生物基础菌种选育的目的和途径

（1）过量（-over）或超量（-super、hyper-）生产目的产物

（2）提高产物纯度，减少副产物

（3）改变菌种性状，改善发酵过程

（4）获得新产物菌种诱变技术

1、自发突变自然界中自发突变频率非常低（10-5-10-8）,但一些野生型微生物仍然会有相当高的自发突变，如大肠杆菌

2、理化诱变传统的理化诱变是最常用的菌种选育手段采用物理、化学或生物因素诱发菌株发生突变可大幅提高突变频率100倍，达到

10.3-1（）-6常见的诱变因子诱变育种仍用以选育高产量、高生产速率、能利用粗原料、适应特殊发酵条件、副产品少以及动力消耗少的菌株

（1）离子束诱变技术（常用N,离子）

（2）激光辐射诱变

（3）原生质体诱变

（4）诱变时对增变因子的使用原生质体融合定义用脱壁酶把生物细胞壁除去，原生质体接触、融合、细胞间遗传物质进行传递和交换达到基因重组目的应用高产菌种选育；双优良性状组合；合成新产物新技术诱变剂直接处理原生质体；使参与原生质体融合的一方在融合前先行灭活；电融合技术；电穿孔法基因工程现代生物技术的核心，利用体外重组DNA技术去获得基因或其它序列全新组合的DNA分子，大大提升了传统发酵工业的技术水平

1、基因表达

2、分子定向进化定向分子进化定向分子进化工程是继蛋白质工程之后的第三代基因工程，就是在试管中进行的“分子进化”，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白质以及其他有机物分子等分子水平上的延伸和应用它通过人工合成或借助于生物表达的手段，人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化菌种的高通量筛选筛选是决定菌种选育效率的一个重要步骤通过正确、灵敏的筛选方法从大量未变和负变的群体中把仍然是很少量的正向突变挑选出来采用微量化仪器和自动操作系统，培养基自动灌注、清洁，以高通量筛选，在短时间内以最少的资源筛选大量的经诱变的群体采用96孔板替代摇瓶进行初筛能进行高通量筛选，但难点是如何防止发酵期间的蒸发及菌2）可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间3）便于自动控制发酵罐内微生物、基质、产物和溶解氧浓度等各参数维持在一定水平，易于控制但是由于长时间的连续培养难以保证纯种培养，并且菌种发生变异的可能性较大，故在工业规模上很少采用连续培养因为微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境A发酵热发酵过程中，随着菌对培养基的利用，以及机械搅拌的作用，将产生一定热量同时因罐壁散热，水分蒸发等也带走部分热量发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量Q发酵=Q生物+Q搅拌一Q蒸发一Q辐射发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响因此必须掌握发酵过程中pH的变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态近年来，就补料方式而言，有连续流加和变速流加每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加从补加的培养基成分来区分，又可分成单一组分补料和多组分补料等等为了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数对于微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系在反馈控制的操作中，有非直接方法，是以溶氧、pH、呼吸商、排气中二氧化碳分压及代谢物质浓度等作为反馈控制参数

一、简要说明微生物诱变育种的操作步骤

201、出发菌株的选择1）从自然界分离得到的野生型菌株2）通过生产选育，即由自发突变经筛选得到的菌株3）已经诱变过的菌株常采用连续诱变的方法，在每次诱变之后选出3-5株较好的菌株继续诱变

2、菌悬液的制备一般采用生理状态一致的单细胞或胞子进行诱变处理，采用生长旺盛的对数期营养细胞，变异率较高且重现性好细胞悬液经玻璃珠振荡打散，并用脱脂棉或滤纸过滤以达到单细胞状O

3、前培养诱变处理前，将细胞在添加喋吟、喀咤等碱基或酵母膏的培养基中培养20-60min,再进行诱变处理，可使变异率大幅度提高

4、诱变剂处理使用理化诱变剂诱发基因突变物理诱变剂主要为各种射线，如紫外线、X射线、丫射线、射线、B射线和超声波等，紫外线应用最广化学诱变剂常用的如甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胭、亚硝酸、氮芥等

5、变异菌株的分离和筛选从多数负突变体中筛选出个别突变个体，分为初筛和复筛两个阶段，前者以量为主，后者以质为主

6、进行发酵试验，检查生产性状，经过生长性状比较，再平行试验比较，结合其他因素，确定用于生产或进一步改良诱变的菌株，保藏或扩大试验，直至用于生产

二、简要说明微生物菌种冷冻干燥保臧法的主要步骤

281、安甑瓶的准备冷冻干燥用的安甑管形状不一，内径一般为8Tomni,长度不小于100mm先用毛细管加入洗涤液浸泡过夜，第二天用蒸播水洗净后干燥，瓶口加脱脂棉塞用纸包好，在121c灭菌30min后，再在60℃烘箱中干燥

2、分散剂作用使悬浮液悬浮其中保持活的状态；尽量减少冷冻干燥时对微生物引起的损伤可分为低分子化合物和高分子化合物，常用脱脂牛乳和血清

3、收集菌种

4、冷冻装入悬液后立即冷冻否则会使菌体自行沉淀成为不均匀的悬液而不利于冷冻，同时分散剂起培养基作用使微生物再次生长或萌发胞子，不利于长期保藏-30℃

5、真空干燥℃,此时升华还在继续，样品不会融化而能达到干燥目的干燥完毕后，关闭真空泵、排气、取出安瓶管将管径拉细，再装在多孔管道上抽真空和熔封

6、安甑管的熔封必须在第二次抽真空情况下，在多孔管道上进行要求熔封完全无任何泄露，外观完整均匀，是在棉塞下部安甑管已拉细处

7、标签在灭菌前加入有菌名、日期的小纸片

8、安甑管的保藏安甑管可置于4-5℃低温下保藏，室温保藏效果不佳，保藏期一般为5T0年影响保藏效果的因素除菌种、菌龄外还和干燥样品中含水量直接相关1%-3%比较好，5%-6%会相应降低，10%以上很难保藏

9、安甑管的启封启封时，在无菌条件下，将熔封口处在火焰上稍加热，立即加上「2滴无菌蒸储水，或用酒精棉球轻擦一下，使玻璃管产生裂缝，稍与轻击即可断落加入最适生长的液体培养基少量使管内干燥粉末溶解，即可接种在斜面或液体培养基内，一般使用经过复壮的第二代菌种

三、在淀粉制糖工艺中，比较酸解、酶解和酸酚结合水解方法的优缺点44优点缺点方法酸水解法生产方便；设备要求简单；水解时间短；高温高压，设备要求高；设备生产能力大条件苛刻；副反应较多，淀粉转化率低；淀粉乳浓度不宜过高酶水解法反应时间较长；反应条件温和，设备要求较低；设备要求内容较多；专一性强，副反应较少，淀粉转化率高；酶是蛋白质，引起糖液过滤困难淀粉乳的浓度可以达到一定水平；糖液纯净，质量高酸酶结合水具有酸水解以及酶水解双重优点，包括克服了酸水解和酶水解的缺点，本身缺解法酸酶法和酶酸法点较少

四、简述酸水解淀粉制备糖液方法的基本原理，分析影响酸水解淀粉的因素44在酸催化下，淀粉发生水解反应转变为葡萄糖同时，在水解过程中由于酸和热的作用，一部分葡萄糖产生复合反应和分解反应葡萄糖通过7,6-糖昔键结合生成异麦芽糖、龙胆二糖等二糖或低聚糖分解反应使部分葡萄糖会分解声场5,-羟甲基糠醛、有机酸和有色物质等小分子非糖物质糖化过程中，复合、分解及水解这三种化学反应是同时进行的，其中水解反应是主要的，复合和分解反应是次要的，但对葡萄糖的生产不利影响因素

（1）淀粉的质量以酸为催化剂，水解非专一，耍获得质量好的糖液，尽量减少糖化杂质，对淀粉质量有较高要求谷物淀粉较薯类淀粉难水解

（2）淀粉乳浓度浓度下降，DE值上升，表明糖液中复合糖和分解反应杂质减少，但是淀粉乳浓度过低，则设备利用率较低一般浓度在18-19BXo

（3）酸的种类和用量盐酸催化效能高，但中和后会产生氯化物硫酸效能比盐酸低，但大部分的硫酸根可用钙离子除去，可大大提高糖液质量草酸绥化能力更低，但是弱酸，分解符合反应少，可在较高温度下水解，草酸钙加热后又可回收草酸，缺点是成本太高加入方法所有酸一次投入淀粉浆一一由于进料时间先后差异，造成先进锅的淀粉受热易糊结块，影响糖化进行全部酸用水稀释先放入锅一一先进锅的淀粉在高浓度酸作用下，迅速生成葡萄糖，易产生复合分解反应，造成糖液颜色加深部分稀释入锅，其余放入粉浆一一较好，锅内有沸腾的底酸水，可避免先进锅的料液结块，可越过糊化温度点进行水解，所得糖化液颜色较浅

（4）糖化温度、压力和时间淀粉水解是蒸汽直接加热，温度与水解速度成正比常采用高温短时间随时间增加，糖液的葡萄糖值达到最高点，如进一步延长糖化时间，糖浓度反而下降放料时间不可确定在糖液DE值最高点，应适当提前

（5）淀粉中含蛋白质等杂质对糖液质量的影响蛋白质和磷酸盐降低氢离子浓度，水解成氨基酸与葡萄糖转化成类黑素，蛋白质容易产生泡沫应选用蛋白质低和杂质少的淀粉为原料

五、尽可能多的列出酶水解制备糖液的工艺，并分析它们的特点51液化淀粉酶作用下完成，水解淀粉及其产物中的1,4-糖昔键，越过1,6-糖昔键水解淀粉分子没有先后次序，直链淀粉分子水解产物为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三塘支链淀粉分子还有异麦芽糖及含有1,6-糖昔键的低聚糖低压蒸汽喷射液化工艺调浆一一配料------------次喷射液化一一液化保温一一二次喷射一一高温维持——二次液化——冷却——糖化糖化酶从非还原性末端开始，将1,4-和1,6-糖昔键水解，能水解麦芽糖成为葡萄糖尽量选择较高温度，较低PH进行糖化，速度快便于脱色可加入1,6糖昔键葡萄糖甘酶加快1,6键水解速度，选用较高糖化PH抑制糖化酶的催化复合反应工艺液化一一糖化——灭菌一一过滤一一储糖计量——发酵

六、请列出适用于培养基灭菌的灭菌方法，并比较各自的优缺点59原理适用范围方法特点火焰灭菌法利用火焰直接把微生物杀死接种针、玻璃棒、试管口、方法简单，灭菌彻底，适用范三角瓶口、接种管□围有限干热灭菌法金属或玻璃器皿热空气将为生物体内的蛋白质灭菌后物料可保持干燥，方法简单，但灭菌效果不如湿执氧化湿热灭菌法高温蒸汽将物料的温度升高使蒸汽来源容易、潜热大、穿透广泛应用与生产设备及培微生物体内的蛋白质变性力强、灭菌效果好、操作费用养基的火菌低，经济快速射线灭菌法用射线穿透微生物细胞使用方便，但穿透能力较差，适无菌室、无菌箱、摇瓶间用范围有限和器皿表面化学试剂化学试剂对微生物的氧化作用使用方法较广，可用于无法用环境空气灭菌及表面灭菌或损伤细胞加热方法进行灭菌的物品过滤除菌过滤介质将微生物菌体细胞过不改变物性而达到灭菌目的，生产中空气净化除菌及容滤除去设备要求高易被热破坏的培养基火菌

七、请分析培养基间歇灭菌过程和连续灭菌过程的温度变化情况（图示），写出间歇灭菌过程中各段对灭菌的贡献67优点缺点灭菌方式连续灭菌灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装失置操作条件怛定，灭菌质量稳定操作较麻烦易于实现管道化和自控操作染菌的机会较多不适合于含大量固体物料的灭菌避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率发酵设备利用率高对蒸汽的要求高间歇灭菌设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降操作要求低，适于手动操作需进行反复的加热和冷却，能耗较高适合于小批量生产规模不适合于大规模生产过程的灭菌发酵罐的利用率较低适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌间歇灭菌°C有灭菌作用连续灭菌短时间内加热到保温温度，并且能很快的被冷却，可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌,保温时间较短图示

八、说明如何提高反应器中溶解氧的浓度提高反应器中溶解氧的浓度可以首先提高氧的传递速率OTR,途径主要有两条一是提高传质推动力，二是提高传质系数提高传质推动力的方法主要有增加操作压力即罐压；通入纯氧；通过基因工程加强培养物对氧的利用提高传质系数的方法有提高搅拌转数；加大通气量；改进通气装置和气体分布装置；改变发酵液的理化性质，加入传氧中间介质

九、论述生物反应器设计的内容、要求和过程内容根据发酵体系确定反应器型式；由小试结果确定操作条件（温度、PH、通气量、搅拌转速等）；确定反应器体积（核心）、结构参数（传热面积、搅拌桨、电机、接管尺寸）

1、改善生物催化剂

2、好的过程控制

3、好的无菌条件

4、克服速度限制因素（物质热量、质量传递等）要求生物因素生物反应器必须有很好的生物相容性，能很好地模拟细胞在动物体内的生长环境化学因素设计必须提供足够的停留时间，完成所需要的转化度，符合过程反应动力学的要求传质因素对于非均相反应，反应过程往往可能被反应底物的扩散速率制约，而不是被反应动力学所控制，因此，必须满足物质传递的要求传热因素有能力除去和加入反应过程的热量，无过热点安全因素有毒害的反应物和产物的隔离，有优良的防污染性能操作因素便于操作和维修

1、以转化成本或原料成本为主的过程要求设计的生物反应器有高的生产能力和高的回收率

2、以回收成本为主的过程要求生物反应器有高浓度的产物及低含量杂质

3、以底物的高转化率为主的过程要求生物反应器有高的生产能力过程

1、过程工程方面的广泛文献资料的利用

2、考虑过程需求后，选择合适的反应器系统

3、有效的实验室和中试规模的试验

4、将实验数据合理外推到工业化规模的工厂

5、发展设计程序和成本模型

6、将从初始设想到工厂生产之间的间隔期间到最低程度

十、分析生产过程染菌的原因和途径，并有针对性的列出相应的防止染菌的措施

1411、种子带菌种子保存管染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养所涉及的设备和装置染菌等1建立相应的无菌室，严格控制无菌室的污染程度，间替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理2将种子的转移、接种等操作放在超净工作台上进行，从而保证不被杂菌污染3在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格加以限制，防止杂菌的进入而受污染4对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受染菌后才能使用5对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理

2、空气带菌净化流程和设备的设计，过滤介质的选用和装填，过滤介质的灭菌和管理不完善1加强生产场地的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，前置粗过滤，加强预处理2设计合理的空气预处理过程，尽可能减少空气的带油、水量，提高温度，过滤介质保持干燥，防止冷却水进入空气系统3设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质

3、设备的渗漏或“死角”造成的染菌1盘管的渗漏染菌仔细清洗，检查渗漏；降低冷却水中C1-的含量2空气分布管的“死角”染菌频繁更换空气分布管或认真洗涤3发酵罐的渗漏或“死角”染菌采用不锈钢或复合钢，安装边阀使灭菌彻底，注意清洗，加强罐体清洗，适当降低搅拌桨位置4管路的安装或管路的配置不合理形成“死角”染菌采用单独的排气、排水和排污管,法兰的加工、焊接、安装要符合灭菌要求，务必使各衔接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片与法兰匹配，安装时对准中心，尽量减少法兰5管件的渗漏形成染菌采用加工精度高，材料好的阀门

4、培养基灭菌不彻底1原料性状不一造成灭菌不匀而染菌实罐灭菌，大颗粒先过筛除去，固形物较多的罐外预先配料2灭菌时温度与压力不对应造成染菌灭菌生物时要打开排气阀门，使蒸汽能通过并驱除罐内空气3灭菌过程中产生的泡沫造成染菌添加消泡剂防止泡沫的大量产生4连续灭菌维持时间不够而染菌避免蒸汽压力的波动过大，严格控制灭菌温度，自动控温5灭菌过程中的压力剧变而造成染菌冷却前先通入无菌空气维持压力再冷却6一些仪器探头灭菌不彻底造成染菌采用化学试剂浸泡灭菌

5、噬菌体染菌环境污染，设备渗漏或“死角”，空气系统，培养基灭菌不彻底，菌种带进噬菌体或本身是病原性菌株，补料过程及操作失误净化环境为中心的综合防治法净化生产环境，消灭污染源，改进提高空气的净化度，保证纯种培养，做到种子本身不带噬菌体，轮换使用不同类型的菌种，使用抗噬菌体的菌种，改进设备装置，消灭“死角”，药物防治等措施

十一、指出微生物分批培养、补料分批培养和连续培养的区别分批发酵在一个密闭的系统中投入有限数量的营养物质后，接入少量菌种进行培养，使微生物的生长繁殖在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法补料分批培养在分批发酵过程中间歇的或连续的补加新鲜的培养基的培养方法，又称为半连续培养或半连续发酵连续培养培养基料液连续的加入发酵罐，并同时以同样的流速放出含有产品的发酵液区别

1、分批培养为封闭式系统，补料分批培养为半封闭式系统，而连续培养在一定意义上为开放式系统

2、分批培养的前期培养基和后期的培养液均是一次性加入，一次性排出；补料分批培养有间歇连续的补加新鲜培养基，后期培养液一次性排出；连续培养在补加培养基的同时，放出等量的培养液

3、分配培养是非定态培养方式，连续培养基本可认为是恒定培养条件下的定态培养，补料分配培养介于两者之间

4、工艺过程控制不同

十二、说明如何实现发酵过程的最优化控制

1、明确控制目标最优化控制的目标是得到最大比产物生成速率，其次是最短的生产周期,并由此获得最佳的经济效益

2、明确影响因素影响目标值比产物生成速率的因素有营养物质的浓度、种类、比例、溶解氧浓度和氧化还原电位、C02等

3、确定实现目标值的方法可用营养物质转化成产物的得率或效率、转化率作为目标值,例如用葡萄糖浓度等参数

4、确定最佳工艺根据最佳的参数来确定生产工艺，例如营养物质种类、浓度和比例需转化成培养基原料的种类、浓度和比例等

5、实施最佳工艺通过优化管理，严格执行发酵工艺，将发酵控制在最佳状态，从而最终实现目标值，达到最大的比产物生成速率要实现最佳工艺必须对诸如温度、PH、溶氧等进行控制

十三、动物细胞的主要培养特性是什么，请有针对性的选择一种反应器和相应的培养方式动物细胞培养将活体细胞或活体组织从动物的体内取出，用机械或消化的方法使其分散成单个细胞后放在模拟体内生理环境的特定条件下进行哺育培养，使其生长发育的方法培养特性对营养要求高、对环境条件要求严格、细胞生长周期长、能对其合成产物进行转录后修饰，使之具有完整的生物学功能，能不断合成不断分泌，从而在培养过程中不断收获细胞产物，产物纯化过程相对简单，主要用于生产植物和微生物难以生产的具有特殊功能的蛋白质类物质可选用中空纤维管生物反应器，相应的有两种培养方式

1、粘附性细胞必须附着在一定固定支持物表面才能生长的细胞

2、悬浮性细胞不需要附着于支持物表面，在悬浮状态下就可生长的细胞

十四、植物细胞的主要培养特性是什么，请有针对性的选择一种反应器和相应的培养方式植物细胞培养将立体的愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法培养特性植物细胞具有全能性；含有液泡，使得细胞对渗透压和物理压力很敏感；具有纤维素，有很强的抗张性，抗剪力能力相当弱；具有凝集成团的倾向培养方式间歇培养一一气升式反应器，连续培养一一流化床式反应器，固定化培养一一填充床式生物反应器

十五、提高基因工程菌稳定性的策略

1、施加选择性压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素；载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组分

2、分段控制培养在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达

3、控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度，或使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数

4、优化基因工程菌的培养工艺工程菌的培养工艺参数的控制对其质粒的稳定性和表达效率影响很大

5、控制培养条件有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性通过间隙供养的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性

6、固定化固定化可以在一定程度上提高基因工程菌的稳定性落形态计算机识别法用计算机视觉替代人的视觉量化菌落形态特征，并与其性能相联系，形态特征值对应较高的菌种活性，实现菌种的分离筛选培养基优化方法•界面响应方法、均匀设计菌种保藏的基本目的是使菌种不死亡，不被污染,不发生或少发生变异，更进一步可利用现代生物技术构建种质基因文库和DNA文库,对微生物种质资源进行分子水平的保护、保藏和研究•至今保藏方法有20多种，从总体上可分为4大类传代法、干燥法、冷冻法及冷冻干燥法•其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境,如低温,干燥,缺氧,营养缺乏等•冷冻干燥法是目前保藏技术领域研究最多并应用最为广泛的一种方法种子罐级数制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据菌种生长特性，泡子发芽及菌体繁殖速度以及采用发酵罐体积而定种龄种子罐中培养的菌种开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间通常以菌体处于生长旺盛期为合适接种量移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例第三章培养基•培养基是人工配制的供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料，同时、培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必须的环境条件•培养基的组成和配比是否恰当对微生物等的生长、产物的形成，提取工艺的选择、产品的质量和产量等都有很大的影响•但对某一微生物和产品来讲，究竟用哪些原料作培养基还需经过一系列实验的摸索才能确定一种既有利于微生物生长，又能保证得到高产优质的较为理想的培养基配方•工业生产培养基所用的原材料还必须来源丰富、价格低廉、质量稳定•一种好的培养基配方还应随菌种的改良、发酵控制条件（pH、溶解氧、中间补料等工艺条件）和发酵设备的变化而作相应的变化碳源•碳源是组成培养基的主要成分之一常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇•在特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解产物或氨基酸等也可被某些菌种作为碳源使用•由于菌种所含的酶系统（包括透性酶）不完全一样，各种菌种对不同碳源的利用速率和效率也不一样•葡萄糖是碳源中最易利用的糖，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖但是过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，从而抑制微生物的生长和产物的合成•糖蜜是制糖厂生产糖时的结晶母液，它是蔗糖厂的副产物糖蜜含有较丰富的糖、氮素化合物和无机盐维生素等，它是微生物工业的价廉物美的原料氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物常用的氮源可分为两大类有机氮源和无机氮源A有机氮源常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白陈、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等它们在微生物分泌的蛋臼酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，因而微生物在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝浓度增长迅速的特点B无机氮源常用的无机氮源有钱盐、硝酸盐和氨水等微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快,所以也称之谓迅速利用的氮源但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化前体•指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高抑制剂•在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来在考虑培养基总体要求时，要注意一些问题第一，考虑碳源、氮源时，要注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合，发挥各自的优势，避其所短第二，选用适当的碳氮比培养基中碳氮比的影响极为明显氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量碳源过多，则容易形成较低的pH,若碳源不足，易引起菌体衰老和自溶另外碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成菌体在不同的生长阶段，其对碳氮比的最适要求也不一样一般碳源因为既作碳架又作能源，因此用量要比氮多第三，要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配这是根据该菌种在现有工艺设备条件下，其生长和合成产物时pH的变化情况，以及最适pH的控制范围等，综合考虑选用什么生理酸碱性物质及其用量，从而保证在整个发酵过程中pH都能维持在最佳状态（有时也可考虑用中间补料来控制pH）o在选择培养基所用的有机氮源时，特别要注意原料的来源、加工方法和有效成分的含量有些原料在使用前要进行预处理淀粉原料使用量大，需要预先进行蒸煮、糊化，使酵母能有效地将其糖化糊化程度与温度、时间有关，蒸煮温度过低使糊化不充分，影响糖化率；反之，则会发生焦化等情况，影响营养成分，甚至产生黑色素等有害物质第四章淀粉制糖工艺结合书上思考题看第五章培养基的灭菌某些培养过程，由于培养基中的基质不易被微生物利用，或者温度、pH不适于一般微生物生长,因而可在不很严格的条件下生产，但是多数培养过程要求在严格的条件下进行纯种培养，具体采取以下措施1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好气培养过程中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，生物反应器中要维持高于环境的压力；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子灭菌的方法所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程常用的灭菌方法有以下几种

（1）化学药剂灭菌一些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌作用常用的化学药剂有甲醛、氯（或次氯酸钠）、高铳酸钾、环氧乙烷、季铁盐（如新洁尔灭）等由于化学药剂也会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，所以不用于培养基的灭菌

（2）射线灭菌即利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法波长为的紫外线有灭菌作用，最常用的波长为

2.537X10—7n的紫外线但紫外线的穿透力低,所以仅用于表面消毒和空1气的消毒

（3）干热灭菌常用的干热灭菌的条件为在160℃下保温lh进行干热灭菌时，微生物主要是由于氧化作用而死亡干热灭菌不如湿热灭菌有效，其Q10（即温度升高10℃,灭菌速度常数增加的倍数）为2—3,而湿热灭菌对耐热的芽泡可达8—10,对营养细胞则更高一些要求保持干燥的实验器具和材料（如培养皿、接种针、固定化细胞用的载体材料等）可以进行干热灭菌

（4）湿热灭菌即利用饱和蒸汽进行灭菌由于蒸汽有很强的穿透力，而且在冷凝时放出大量冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物常用蒸汽对培养基灭菌的条件是在120C（约1X105P表压）维持20—30min

（5）过滤除菌即利用过滤方法阻留微生物，达到除菌的目的本方法只适用于澄清流体的除菌工业上利用过滤方法大量制备无菌空气，供好气微生物的沉没培养过程使用在产品提取过程中，也可利用无菌过滤方法处理料液，以获得无菌产品影响灭菌的因素•培养基成分、培养基的物理状态、培养基的pH值、培养基的微生物数量、微生物细胞中水含量、微生物细胞菌龄、微生物的耐热性、空气排除情况、搅拌、泡沫培养基的连续灭菌培养基的连续灭菌，就是将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌连续灭菌时，培养基能在短时间内加热到保温温度，并能很快被冷却，因此，可在比分批灭菌更高的温度下灭菌，而保温时间则很短，这样就有利于减少营养物质的破坏在培养基连续灭菌过程中，蒸汽用量平稳，但蒸汽压力一般要求高于5X1051%（表压）连续灭菌设备比较复杂，投资较大培养基采用连续灭菌时，发酵罐应在连续灭菌开始前先进行空罐灭菌，以容纳经过灭菌的培养基加热器、维持罐和冷却器也应先进行灭菌，然后才能进行培养基连续灭菌组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分开灭菌，以减少物料受热破坏的程度也可将糖和氮源分开灭菌，以免醛基与氨基发生反应，防止有害物质生成第六章空气灭菌空气的预处理

1、提高压缩前空气的洁净度

2、去除压缩后空气中所带的油水大气中的微生物大多依附于空气中的尘埃颗粒上一般认为，高度每上升10m,大气中微生物量下降一个数量级空气在进入压缩机前先要经过粗过滤器，除去较大的尘埃颗粒和相当量的微生物空气的过滤除菌空气过滤器使用的过滤介质，按其孔隙大小可分为两类第一类的孔隙小于细菌和抱子，当空气通过时，微生物被阻留在介质的一侧，这种介质称为绝对过滤介质例如，将聚乙烯醇（PVA）与甲醛缩合，制成多孔性的聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）,经过耐热处理制成Um的滤膜这种材料有很好的除菌效果，通气性好，并且可以用蒸汽灭菌，耐受多种有机溶媒和酸、碱另一类过滤介质的孔隙大于微生物，为了达到所需的除菌效果，介质必须有一定的厚度，因此称为深层过滤介质这种介质除菌的机理比较复杂，主要是纤维介质对颗粒的拦截、颗粒的惯性冲击、布朗运动（扩散）、颗粒与介质之间的静电引力以及重力等因素一般认为拦截、惯性和布朗运动的作用较大，而重力和静电引力的作用则很小第七章氧的供需用深层培养的方法来大量生产细胞及其有用的代谢产物往往需要不断地向培养液供氧在实验室中，可以通过摇瓶机的往复运动或偏心旋转运动对摇瓶中的细胞供氧，而中间试验规模和生产规模的培养装置则采用通入无菌压缩空气并同时进行搅拌的方式7•1细胞对氧的需求许多细胞需要有分子态的氧作为呼吸链电子传递系统末端的电子受体，最后与氢离子结合成水此外，氧还直接参与一些生物反应对于这些细胞，供氧不足就会抑制细胞的生长代谢兼性厌气微生物如酵母、乳酸菌等，在无氧情况下通过酵解获得能量，对于绝对厌氧微生物，氧则是一种有害物质如果溶氧浓度高于临界值，细胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶氧浓度低于临界值，细胞的比耗氧速率就会大大下降，这时细胞便处于半厌气状态，代谢活动可能受到影响单位体积培养液在单位时间内消耗氧的量称为摄氧率摄氧率和比耗氧速率有以下关r=Q02•X其中r一摄氧率，mmol02/m3•sQ02一呼吸强度，mol02/（kg干细胞S）；X一菌的浓度，kg（干重）/ni3细胞浓度直接影响培养液的摄氧率在对数生长的初期，比耗氧速率达到最大值，此时细胞浓度尚很低，摄氧率并不高随着细胞浓度的迅速增高，培养液的摄氧率也迅速增高，在对数生长期的后期达到峰值然后,由于培养基中营养物质的消耗，以及培养装置氧传递能力的限制，对数生长阶段结束，比耗氧速率下降，虽然这时细胞浓度仍有增加，但培养液的摄氧率下降最后，因基质耗尽，细胞自溶，摄氧率便迅速下降碳源种类对细胞的需氧量有很大影响一般微生物细胞利用葡萄糖的速度比其他糖快，因而在含葡萄糖的培养基中表现出较高的耗氧速率当以油脂或烧类为碳源时，微生物需要的氧更多，因此在石油发酵过程中，发酵罐要有良好的供氧能力，才能满足微生物的要求碳源的浓度也会影响细胞的耗氧速率在分批培养过程中，随着碳源的消耗，成为限制性基质，细胞的呼吸速率下降，补入碳源后，培养液的摄氧率往往有明显的增加此外，培养条件（如pH、温度等）对细胞的需氧要求也有影响，一些有害代谢产物的积累，也会抑制细胞的呼吸很多时候培养的目的不是为了取得细胞而是获得其代谢产物，而溶解氧浓度对细胞生长和产物生成的影响可能是不同的，即对于细胞生长的最佳氧浓度不一定就是生成产物的最佳氧浓度氧浓度与临界氧浓度之比称为氧的满足度通过三较酸循环进行产物生产的，通过酵解产物丙酮酸和磷酸烯醇丙酮酸而得到产物的,对供氧要求不同微生物的次级代谢产物生产也有类似情况7-2培养过程中的氧传递对培养液中的细胞进行鼓泡通气时，氧从气泡传递到细胞内要克服一系列的阻力，它们的相对大小决定于流体力学特性、温度、细胞的活性和浓度、液体的组成、界面特性以及其他因素在克服上述阻力进行传递的过程中，要损失推动力，传递过程的总推动力就是气相与细胞内的氧分压之差，这一总推动力消耗于从气相到细胞内的各项串联的传递阻力当氧的传递达到稳态时，总的传递速率与串联的各步传递速率相等，这时通过单位面积的传递速率n02=推动力/阻力=△Pi/l/ki其中n02一氧的传递通量，mol m2•s；△Pi一各阶段的推动力分压差，Pa；1/ki—各阶段的传递阻力，Ns/mol o对于难溶气体如氧，气膜传递阻力与液膜传递阻力之比可以忽略不计，因此kL^KLo在单位体积培养液中，氧的传递速率为0TR=KLa C*一CL这就是气液传递的基本方程式其中0TR——单位体积培养液中的氧传递速率，mol/m3,s a一比表面积,m2/m3o通常将KL与a合并在一起，作为一个参数处理，称为容量传递系数s-lo也适于其他气体的传递，例如二氧化碳从液相到气相的传递双膜理论认为，气液两相间存在一个界面，界面两侧分别为呈层流状态的气膜和液膜；在气液界面上两相浓度互相平衡，界面上不存在传递阻力；气液两相的主流中不存在氧的浓度差氧在气膜和液膜间的传递速率是相等的a C*-COTR=KL由上式可以看出，提高反应器中溶解氧的浓度可首先提高氧传递速率OTR,途径主要有两条一是提高氧传质推动力C*-C,二是提高a值KL提高C*-C增加操作压力，即罐压；通入纯氧提高C*,通过基因工程加强培养物对氧的利用,降低Co提高K-值提高搅拌转速，加大通气量，改进通气装置和气体分布装置反应器生物反应器设计的内容根据发酵体系确定反应器型式由小试结果确定操作条件温度、pH、通气量、搅拌转速等确定反应器的体积、结构参数传热面积、搅拌桨、电机、接管尺寸反应体积的确定是反应器设计的核心内容设计的基本方程、物料衡算式、基质、产物、细胞能量衡算式生物反应器的设计必须满足如卜一的要求生物因素生物反应器必须有很好的生物相容性，能很好地模拟细胞在动物体内的生长环境化学因素设计必须提供足够的停留时间，完成所需要的转化度，符合过程反应动力学的要求传质因素对于非均相反应，反应过程往往可能被反应底物的扩散速率制约，而不是被反应动力学所控制，因此，必须满足物质传递的要求传热因素有能力除去和加入反应过程的热量，无过热点安全因素有毒害的反应物和产物的隔离，有优良的防污染性能操作因素便于操作和维修通用式发酵罐常用的圆盘涡轮搅拌器有平叶式、弯叶式和箭叶式三种，叶片数量一般为六个，少至三个，多至八个发酵罐的传热装置有夹套和蛇管两种，℃℃）o如果采用5—10℃低温冷却水，也有发酵罐采用外蛇管作为传热装置它是把半圆形的型钢或角钢制成螺旋形焊于发酵罐的外壁上而成的发酵罐的放大是发酵工程中一个重要课题，无论从学术上或从工程角度上都有重要意义目前为止尚未得出一个十分有效而正确的放大关联式，所以发酵罐的放大技术仍处于凭经验或半经验状态本节所述的放大是指在模型罐与生产罐之间以几何相似为前提的放大在发酵罐放大中，主要需解决放大后生产罐的空气流量、搅拌转速和搅拌功率消耗等三个问题第九章发酵染菌及其防治发酵染菌在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵液，使发酵过程失去真正意义上的纯种培养种子培养异常菌体生长缓慢菌丝结团菌体老化代谢不正常发酵异常菌体生长差pH值（或DO）过高或过低泡沫过多菌体浓度过高或过低染菌的检查与判断显微镜检查肉汤培养法平板划线培养斜面培养检查法发酵过程的异常现象观察法发酵染菌的分析发酵染菌的规模分析不同污染时间分析染菌的杂菌种类分析染菌对不同发酵过程的影响染菌的种类和性质对发酵过程的影响染菌发生时间不同对发酵的影响染菌程度对发酵的影响种子培养期染菌的处理发酵前期染菌的处理发酵中、后期染菌的处理染菌后对设备的处理菌种退化的原因环境条件菌种自身突变种子带菌及其防治空气带菌及其防治设备的渗漏或死角造成的染菌及其防治培养基灭菌不彻底导致的染菌噬菌体染菌及其防治

10、发酵工艺控制微生物发酵的生产水平取决于生产菌种本身的性能，和合适的环境条件、才能使它的生产能力充分表达出来我们通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度，pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中一般来说，菌种的生产性能越高，使其表达它应有的生产潜力所需的环境条件就越难满足高产菌种比低产菌种对工艺条件的波动更为敏感化学工程和计算机应用的发展为发酵工艺控制打下另一方面的基础，研究发酵动力学，找出适于描述和真正能反映系统的生化反应过程的数学模型，通过现代化的试验与计算手段，为发酵的优化控制开创一个新的局面由于生物反应过程的复杂性，使得发酵工业生产过程的监控落后其中一个重要原因是，能有效监测过程状态变量的传感器不足或质量不过关有许多重要的参数，如菌体浓度及某些基质浓度至今仍无适合的传感器可供使用因此，要使发酵工程现代化，改进和推广应用现有的传感器，开发新的可靠、适用的传感器是至关重耍的研究发酵动力学一般有以下几个步骤首先要尽可能寻找能反映过程变化的各种理化参数其次，将各种参数变化和现象与发酵代谢规律联系起来，找出它们之间的相互关系和变化规律第三，建立各种数学模型以描述各参数之间随时间变化的关系第四，通过计算机的在线控制反复验证各种模型的可行性与适用范围了解生产菌种在具有合适的培养基、训、温度和通气搅拌等环境条件下对基质的利用、细胞的生长以及产物合成的代谢变化，有利于人们对生产的控制采用不同的发酵操作方式，其代谢变化规律也不同这里介绍分批发酵、补料分批发酵及连续发酵三种类型的操作方式下的代谢特征分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养,使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系，将微生物产物形成动力学分为与生长有联系的和与生长无联系的类型补料分批发酵又称半连续发酵或半连续培养，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法补料分批发酵与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度连续发酵或连续培养也称连续流动培养或开放性培养，即培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液所加入的培养基是一种限制性基质，并保持在较低的恒定值换句话说，由于营养物质的供应与消耗相平衡，才能建立一个稳定的环境状态与分批发酵相比，连续培养具有以下优点1）补料分批培养能维持低基质浓度；。