蛋白质浓度的测定实验报告

蛋白质浓度的测定实验报告实验内容本次实验我们学习考马斯亮蓝G-250法测试豆芽的蛋白质含量1取六支具塞试管，编号后按下表加入试剂操作项目告1234560ml

0.2ml

0.4ml

0.6ml

0.8ml

1.0ml玩熊白度溶液m1蒸期ml

1.0ml

0.8ml

0.6ml

0.4ml

0.2ml0mlG-250试剂ml5ml5ml5ml5ml5ml5ml蜜臼声含量Ug Oug20ug40ug60ug80ug100ug2盖上塞子摇匀，放置2分钟，以1号试管溶液作为对照液在595nm波长下比色测定比色应在Imin内完成以牛血清蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线3接下来准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中加入5ml蒸储水研磨成匀浆，离心4000r/min,10mino另取一支具塞试管，准确加入

0.1ml样品提取液，再力□入

0.9ml蒸储水，5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管溶液作为对照溶液，在595nm波长下比色，记录吸光度值4实验结果注意事项

1.蛋白质所测的0D值一定要位于标准曲线范围内，因为G-250的曲线随着蛋白浓度增高有些略微偏离线性，若蛋白质浓度太高，可适当稀释后再测

2.用于标准样品的牛血清白蛋白最好现配现用，已经配好的溶液即使是-20度保存一段时间后也会造成结果偏高

3.大量的去污剂如TritonX-

100、SDS等会严重干扰测定

4.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡;其结合物在室温下lh内保持稳定.因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低总结通过这个实验，我们可以学习到蛋白质相关知识，能够增强动手能力，提高实验技能，希望同学们在操作过程中要注意以上事项，提前预习，做好准备工作!蛋白质的含量测定的五种经典方法

1.凯式定氮法原理:蛋白质是含氮的有机化合物蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸镁然后碱化蒸储使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量

2.紫外吸收法原理:蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm附近具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定280nm处的吸光度值可用于蛋白质含量的测定

3.双缩胭法原理:双缩服是两个分子服经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩版与CuSO4,形成紫色络合物，称为双缩服反应凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩服反应紫色络合物在540nm处有最大吸收，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量

4.Folin-酚试剂法原理:此法是双缩眼法的发展，在碱性溶液中铜-蛋白质复合物还原（磷铝酸-磷鸨酸试剂Folin试剂），.产生深蓝色（相蓝和鸨蓝混合物）在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比

5.考马斯亮蓝法原理:考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也有棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质的浓度成正比方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定道法灵敏度低.适费时将蛋白转化为蛋白鼠《可用F标准蛋白质（Kjedahl法用尸

0.

21.8-10小双，用酸吸收后用三氟乙酸含战的准确测Omg鼠,误差时滴定沉淀蛋白质定卜扰少费为±2%而分离）时太长双缩曝法取敏度低中速卷肽键+碱性瓶酸钺Tris用f快速测定，（Biuret法）1~20mg20^30Cu2+-＞紫色线冲液:某些但不太灵敏:不分钟络介物软基酸同蛋白质显色相似紫外吸收法较为又取快速5蛋白质中的酪各种嚓吟和用于层析50**100jig〜10分同酸和色氨酸残瞎唳8柱流出液的检钟塔在280nm处的各种核什酸测核酸的吸收光吸收可以校正丈敏度高慢速破酸钺Folin—酚试双缩琳反耗费时间长;剂法Lowry〜加40〜应:瞬铝酸一磷Tris缓冲操作要产格计法）60分钟锯酸试剂被Tyr液时和Phu还原甘氨酸颜色深浅随不同蛋白质变化各种破桁芍马斯亮蓝乂敏度最高快速5芍4斯比蓝染料强瞩性缓冲最好的方法:卜法（Bradford1~5席〜15与蛋白质结合液扰物质少分钟法）时，Jtkmax由TritonX-雌稳心颜色深浅165nm变为100;随不同蛋白质变595nm SDS________化五种方法的对比表格考马斯亮蓝法的突出优点和缺点优点⑴灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达Img这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质——染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多，2测定快速、简便只需加一种试剂，完成一个样品的测定，只需要5分钟左右由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、磕基乙醇、EDTA等均不干3干扰物质少如干扰Lowry法的钾、钠、镁离子、扰此测定法缺点⑴由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差2仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、TritonX-

100、十二烷基硫酸钠SDS和

0.1N的NaOHo3标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。