- 《光学分析方法》课件

光学分析方法光学分析方法是一门基于电磁辐射与物质相互作用的分析技术，凭借其高灵敏度、高选择性和快速分析能力，已成为现代分析化学的核心方法这种技术广泛应用于化学、物理、生物和材料科学等多个领域，为科研工作者提供了精确、可靠的分析手段本课程将系统介绍光学分析的基本原理、仪器结构及其在各领域的应用，帮助学习者全面掌握这一重要的分析方法课程概述光学分析法的基本原理与特点深入剖析光学分析的核心理论，包括电磁辐射特性、光与物质相互作用机制以及各种光学现象的基本规律光谱分析方法的分类与应用系统介绍各类光谱技术，从紫外-可见光谱到红外光谱，从荧光分析到拉曼光谱，全面覆盖主流光谱分析方法光学仪器的结构与工作原理详细讲解各类光学分析仪器的组成部分、工作机制及操作方法，掌握仪器的正确使用与维护数据分析与处理方法学习光谱数据的采集、预处理与高级分析技术，培养数据解读能力与结果评估技巧第一章光学分析法导论光学分析法定义技术特点发展历史与现状光学分析法是基于电磁辐射与待测具有高灵敏度（可达ppb或更低水从牛顿的棱镜实验到现代高精度光物质相互作用的分析方法，通过测平）、高选择性（能精确区分相似谱仪，光学分析技术经历了数百年量物质对光的吸收、发射、散射等组分）、快速分析（多数分析可在的发展，现已成为科学研究和工业现象来获取物质的定性和定量信几分钟内完成）及无损检测等优生产中不可或缺的分析工具息势电磁辐射的基本特性波动性与粒子性光波传播特性光的基本现象电磁辐射同时具有波动性和粒子性的光波在均匀介质中直线传播，速度为干涉现象出现在两束相干光相遇时，双重特性作为波，它表现出频率、c=3×10^8m/s（真空中）光在不形成明暗相间的条纹衍射发生在光波长和传播速度等特性；作为粒子，同介质间传播时，会发生反射、折射波遇到障碍物或小孔时偏振则描述它以光量子或光子形式存在，具有确等现象，折射定律和反射定律描述了光波振动方向的特性，是许多光学分定的能量这些现象的规律析方法的理论基础这种波粒二象性在量子力学中得到完美解释，是理解光学分析本质的基础电磁波的种类射线γ波长

0.01nm，能量极高射线X波长

0.01-10nm，可穿透物质紫外线波长10-400nm，对有机分子有激发作用可见光波长400-760nm，肉眼可见红外线波长760nm-1mm，引起分子振动除以上主要类型外，电磁波谱还包括微波（波长1mm-1m）和无线电波（波长1m）在光学分析中，不同波长区域的电磁波具有不同的能量和穿透能力，适用于分析不同类型的样品和获取不同层次的结构信息光的基本物理量波长、频率与波数波长λ表示相邻两个波峰之间的距离，单位为纳米nm或微米μm；频率ν表示单位时间内振动的次数，单位为赫兹Hz；波数σ是单位长度内的波⁻数，单位为厘米的倒数cm¹三者关系c=λν，σ=1/λ能量与强度⁻光子能量E=hν=hc/λ，其中h为普朗克常数

6.626×10³⁴J·s波长越短，光子能量越高光强度I表示单位面积上的辐射功率，与光通量相关，是光学测量中的重要参数吸收系数与透过率⁻ᵅᵈ吸收系数α描述物质对光的吸收能力，透过率T表示透过物质的光强与入射光强之比两者满足关系T=e，其中d为介质厚度这是比尔-朗伯定律的基础，也是光学定量分析的理论依据电磁辐射与物质的相互作用吸收现象发射现象物质将光子能量吸收，导致原子或分激发态的原子或分子回到低能态时释子由基态跃迁到激发态，是各种吸收放能量以光子形式发射出来，是各种光谱方法的基础发射光谱的基础能级变化散射现象量子理论指出，分子能级包括电子能光通过物质时发生方向改变，可分为级、振动能级和转动能级，不同能级弹性散射（瑞利散射）和非弹性散射跃迁对应不同光谱区域（拉曼散射）光学分析法的分类按分析原理分类按波长区域分类按分析目的分类·吸收光谱法基于物质对特定波长光·X射线光谱法内层电子跃迁·定性分析鉴定物质的化学组成和结的吸收构·紫外-可见光谱法外层电子跃迁·发射光谱法分析物质发射的光谱·定量分析测定物质的含量·红外光谱法分子振动跃迁·散射光谱法研究物质对光的散射特·结构分析确定分子的空间构型·微波光谱法分子转动跃迁性·动力学分析研究化学反应的速率·偏振光谱法利用物质的光学活性和旋光性第二章分光光度法原理比尔朗伯定律-吸光度A与溶液浓度c和光程b成正比，即A=εbc，其中ε为摩尔吸光系数，是物质的特性常数，与波长有关这是光学定量分析的基础吸光度与透射比吸光度A=-lgT，T为透射比，等于透过光强I与入射光₀强I之比吸光度是光学分析中最常用的测量参数，与样品的浓度直接相关吸收光谱的基本特征吸收光谱是物质吸光度与波长的关系曲线，反映了物质的特征吸收，受分子结构、溶剂、温度等因素影响，可用于物质的定性和定量分析紫外可见分光光度法-紫外-可见分光光度法是研究物质在200-800nm波长范围内的吸收特性的方法当有机分子中含有一些特定的不饱和基团（如C=C、C=O等，称为发色基团）时，会吸收特定波长的紫外或可见光不同化合物在紫外-可见区的吸收光谱具有特征性，可用于化合物的定性鉴定根据比尔-朗伯定律，吸光度与浓度成正比，因此可建立标准曲线进行定量分析，广泛应用于药物、食品、环境等领域的分析检测紫外可见光谱仪结构-光源系统氘灯（紫外区）和钨灯（可见区）单色器2棱镜或光栅分光系统样品室放置比色皿的区域检测器光电倍增管或光电二极管阵列现代紫外-可见光谱仪通常采用双光束设计，一束通过样品，另一束作为参比，可有效消除光源波动、溶剂吸收等因素的干扰数据处理系统将检测器接收的信号转换为数字信息，通过计算机软件生成吸收光谱图紫外可见光谱应用案例-

0.0195%5级检测限准确率分钟ppm在环境水样分析中实现超微量检测药物含量测定的准确度常规样品分析所需时间⁺⁺紫外-可见光谱法广泛应用于多个领域在环境监测中用于测定水中重金属离子（如Cu²、Fe³等）含量；在药物分析中用于药品含量测定和纯度检验；在生物样品分析中可测定蛋白质、核酸等生物大分子的含量该方法操作简便、速度快、灵敏度高，已成为实验室最常用的分析手段之一近年来，随着仪器自动化程度提高和数据处理技术发展，其应用范围不断扩大红外光谱分析法红外吸收原理当红外光辐射照射到分子时，如果光子能量与分子振动能级差恰好相等，分子就会吸收这些光子，从基态跃迁到激发振动态，产生红外吸收谱带分子振动模式分子振动包括伸缩振动（键长变化）和弯曲振动（键角变化）两种基本类型复杂分子可能存在几十甚至上百种振动模式，每种振动都可能产生特征吸收峰特征吸收与结构⁻不同官能团具有特定的红外吸收峰，如羰基C=O在1700cm¹附⁻近，羟基O-H在3300-3500cm¹区域这些指纹可用于结构鉴定红外光谱仪器设计傅里叶变换红外光谱仪关键性能指标近红外与中红外⁻现代红外光谱仪大多采用傅里叶变换分辨率指光谱仪区分相邻吸收峰的能中红外400-4000cm¹主要反映分⁻技术FTIR，其核心是迈克尔逊干涉力，典型值为

0.5-4cm¹信噪比表子基本振动，是结构分析的核心区⁻仪该技术通过测量干涉图并进行傅示有用信号与背景噪声的比值，优质域近红外4000-12500cm¹主要里叶变换，可同时获取所有波长的光仪器可达10000:1以上这些参数直接为倍频和合频吸收，虽然峰型宽且重谱信息，大大提高了数据采集速度和影响分析结果的准确性叠严重，但穿透能力强，适合整体样信噪比品和在线分析现代FTIR还具备多种附件，如衰减全⁻FTIR与传统分散型红外光谱仪相比，反射ATR、漫反射、气体池等，扩展远红外区域400cm¹反映分子骨具有扫描速度快、分辨率高和波长准了样品类型和应用范围架振动和晶格振动，在无机和金属有确度好等优点，已成为当前主流仪机化合物分析中有特殊价值器红外光谱解析方法特征峰识别技术结构确认与定量分析3指纹区与官能团区分析⁻首先识别光谱中的强特征峰，如羰通过与标准谱图库比对，可快速确1500-400cm¹为指纹区，是分子基、羟基等官能团的吸收峰，这些认已知化合物；对于未知物质，则整体结构的独特体现；4000-⁻是确定分子主要结构单元的关键需结合其他光谱方法进行综合分1500cm¹为官能团区，可用于确然后结合指纹区的细节特征，进一析在定量分析中，可选择特征峰定分子中存在的官能团类型两者步确认分子的具体结构的吸收强度建立校准模型结合可提供完整的分子结构信息红外光谱实际应用材料科学药物分析环境监测生物科学食品分析其他第三章发射光谱法原子发射光谱原理分子发光光谱特点当原子获得足够能量被激发后，外层分子的发光包括荧光和磷光两种主要电子从基态跃迁到高能态，随后回到形式荧光是分子从激发单线态回到低能态时会释放特定波长的光子由基态时发出的辐射，寿命短；磷光是于每种元素的能级结构不同，发射光从激发三线态回到基态的辐射，寿命谱具有元素特异性，可用于元素的定较长性和定量分析分子发光与分子结构密切相关，荧光激发能量可来自火焰、电弧、等离子强度受环境因素如溶剂、pH值、温度体等不同源，不同激发源适用于不同等影响，是研究分子微环境的有力工元素的分析具原子发射光谱法热激发方式火焰原子发射光谱FAES使用乙炔-空气或乙炔-氧化亚氮火焰，温度可达2500-3000℃，适合碱金属和碱土金属的分析电弧和电火花提供更高能量，可激发更多元素光谱线特性原子光谱线窄而尖锐，具有元素特异性根据谱线波长可确定元素种类，谱线强度与元素浓度成正比，是定量分析的基础谱线强度还受原子化效率、基体效应等因素影响高级激发源电感耦合等离子体ICP可产生高达10000K的温度，能有效激发大多数元素ICP光谱法具有高灵敏度、宽线性范围和多元素同时分析能力，已成为原子发射分析的主流技术原子吸收光谱法基本原理原子吸收光谱法AAS基于气态基态原子对特定波长辐射的吸收样品经原子化装置转化为气态原子，然后测量其对特征辐射的吸收程度根据比尔-朗伯定律，吸光度与原子浓度成正比仪器结构原子吸收光谱仪主要由空心阴极灯（光源）、原子化器（火焰或石墨炉）、单色器和检测系统组成空心阴极灯发射被测元素的特征谱线，确保高选择性；原子化器将样品转化为气态自由原子；单色器分离特征光波；检测系统测量吸收值样品前处理液体样品通常需要酸化处理以稳定金属离子；固体样品则需溶解或消解转化为溶液为减少基体干扰，常采用标准加入法、基体匹配或背景校正技术火焰法检出限一般为μg/mL级，石墨炉法可达ng/mL级荧光分析法激发分子吸收特定波长光内转换能量部分转为振动能发射回到基态释放荧光检测测量发射光强度⁻⁰荧光分析法的灵敏度比吸收光谱法高2-3个数量级，检出限可达10¹mol/L，适合痕量分析荧光强度与浓度成正比的线性范围覆盖4-5个数量级，但在高浓度时会出现自淬灭效应导致偏离线性影响荧光强度的因素很多，包括溶剂性质、pH值、温度、氧气含量、分子结构等荧光淬灭现象（如碰撞淬灭、能量转移等）可用于研究分子相互作用或作为分析信号荧光光谱仪结构结构部分功能和特点常用技术光源提供激发光氙灯、水银灯、激光激发单色器选择特定激发波长光栅或棱镜系统样品室固定样品，控制温度恒温、多位样品架发射单色器分离发射光谱高分辨率光栅系统检测器将光信号转为电信号光电倍增管、CCD数据系统采集处理光谱数据计算机控制系统现代荧光光谱仪多采用直角几何构型，即激发光与发射光检测方向垂直，这可最大限度减少散射光干扰高级仪器还配备双单色器和全息光栅，提供高分辨率和低杂散光时间分辨荧光光谱仪可测量荧光寿命，为分子动力学研究提供时间维度信息偏振荧光技术则通过测量荧光各向异性，揭示分子旋转和微环境信息荧光分析应用⁻荧光分析广泛应用于痕量物质检测，灵敏度可达皮克摩尔10¹²mol级别在生物分子标记与检测领域，荧光标记物如荧光素、罗丹明和量子点等被广泛用于蛋白质、核酸和其他生物分子的标记，是生物分析和诊断技术的重要手段荧光成像技术将荧光分析与显微技术结合，实现了细胞、组织甚至活体生物的多色荧光成像，为生命科学研究提供了强大工具环境监测中，荧光法可快速检测水中多环芳烃、农药残留等有机污染物；食品安全领域则用于霉菌毒素、抗生素残留等有害物质的筛查化学发光分析生物发光特点仪器结构生物发光是生物体内特定酶催化学发光分析仪无需光源和激主要应用化的化学发光反应，如萤火虫发单色器，主要由反应池、光化学发光原理中的荧光素酶-荧光素系统这学系统和高灵敏度检测器组化学发光免疫分析CLIA是临床类系统被广泛用于基因表达研成流动注射技术和微流控芯化学发光是化学反应过程中产检验的主流技术，广泛用于激究和ATP测定片技术提高了反应控制精度生的光发射现象，由激发态分素、肿瘤标志物的检测电化子回到基态时释放能量形成学发光技术则结合了电化学和与荧光不同，化学发光不需要发光分析的优势，具有更高灵外部光源激发，灵敏度更高敏度2第四章激光在光学分析中的应用激光特性与分类激光产生原理·按工作物质分类气体激光、·量子能级系统中的粒子数反转固体激光、半导体激光、染料·受激辐射产生相干光子激光等·光学谐振腔形成反馈和放大机·按工作方式分类连续激光和制脉冲激光·输出耦合器提取部分激光输出·按波长分类紫外激光、可见光激光、红外激光等分析应用优势·高单色性提供精确波长选择·高相干性实现干涉和全息技术·高方向性使能量高度集中·高亮度支持微区分析和远距离检测激光的特性相干性好激光的相位关系保持一致，波阵面具有高度规则性，使光波之间能形成稳定的干涉图样相干长度可达几米至几公里，远超普通光源这一特性使激光成为干涉测量和全息技术的理想光源方向性强激光束发散角极小，典型值为毫弧度量级，远小于普通光源这使激光能在远距离传播而保持能量密度，实现精确瞄准和远距离分析激光遥感和激光雷达技术正是基于这一特性发展起来的单色性好⁻激光的光谱线宽极窄，有些激光线宽可达

0.001nm以下，频率稳定性可达10¹⁴量级优异的单色性使激光能精确选择分子特定能级跃迁，实现高选择性分析和精确光谱测量亮度高⁶激光的能量高度集中，功率密度可达10-10¹²W/cm²，远超常规光源高亮度使激光能引发非线性光学效应，如多光子过程、受激拉曼散射等，扩展了光谱分析的范围和能力激光的发生原理激光输出通过输出耦合器提取部分激光光束激光振荡2光子在谐振腔内往返，形成放大受激辐射3入射光子诱导激发态原子发射相同光子粒子数反转高能级粒子数多于低能级，形成激光条件泵浦激励外部能量输入，使工作物质跃迁到高能态激光产生的核心是受激辐射放大原理当工作物质在外部能量泵浦下形成粒子数反转（高能级粒子数多于低能级）时，一个光子可触发一个激发态原子释放完全相同的另一个光子，形成级联效应光学谐振腔通过两个反射镜提供反馈通路，使光子在腔内往返并不断放大，最终通过部分透射镜输出稳定的激光束激光诱导荧光分析激光拉曼光谱拉曼散射原理仪器结构与特点应用优势拉曼散射是光子与分子相互作用的一种激光拉曼光谱仪主要由激发激光器通常拉曼光谱反映分子振动和转动信息，提非弹性散射现象当光子与分子碰撞是532nm或785nm激光、样品室、光供分子指纹与红外光谱互补，特别时，大部分发生弹性散射瑞利散射，谱分析器和检测器组成现代仪器多采适合分析水溶液和无机物拉曼光谱具能量不变；少部分光子会与分子交换能用共焦设计和CCD探测器，提高空间分有样品制备简单、水干扰小、可通过玻量，形成斯托克斯散射能量减少或反辨率和信号收集效率表面增强拉曼散璃分析等优点，在药物、聚合物、半导斯托克斯散射能量增加，这就是拉曼射SERS技术利用金属表面等离子体共体和生物样品分析中应用广泛⁶⁰散射振，可将信号增强10-10¹倍激光光谱应用1ppb微米检测限激光聚焦束的空间分辨率激光诱导击穿光谱的灵敏度⁻10¹⁵摩尔单分子荧光检测的极限在环境监测领域，激光光谱技术实现了大气污染物的原位、实时监测激光诱导击穿光谱LIBS能直接分析固体样品的元素组成，无需复杂前处理；差分吸收激光雷达DIAL则能远距离监测大气中特定气体的浓度分布生物医学分析中，激光共聚焦拉曼显微镜可对活细胞进行无损成像和分析；表面等离子体共振技术结合激光光源，为生物分子相互作用提供实时监测平台在材料表征领域，激光光谱方法能提供材料的化学组成、晶体结构、表面形貌等多维信息，成为材料研发的重要分析手段第五章偏振光分析方法光的偏振原理偏振光的产生与检测光学活性与旋光性自然光是由无数随机方向振动的电磁产生偏振光的常见方法包括使用偏某些分子由于结构不对称性（手波组成的，没有优先振动方向当光振片（通过选择性吸收）、双折射晶性），能使线偏振光的偏振面旋转，通过偏振片或经反射、散射等作用体（如方解石，利用折射率各向异这种性质称为光学活性或旋光性旋后，光的振动方向变得有序，这就形性）、布儒斯特角反射（利用反射光转角度与物质浓度、光程和波长有成了偏振光偏振特性）等关，可用于手性分子的定性和定量分析根据振动方式的不同，偏振光可分为检测偏振光通常使用起偏器-检偏器系线偏振光（单一方向振动）、圆偏振统，通过旋转检偏器找出光强最大和手性分子还表现出圆二色性，即对左光（电场矢量做圆周运动）和椭圆偏最小位置，确定偏振方向和偏振度旋和右旋圆偏振光的吸收不同，这为振光偏振特性可通过斯托克斯参数现代偏振测量还采用光弹性调制器和生物大分子构象研究提供了重要信和偏振度等参量定量描述偏振相机等先进技术息偏振光与光学活性自然光线偏振光电场矢量在垂直于传播方向的平面内电场矢量在一个固定方向振动随机振动旋光现象圆偏振光光学活性物质使偏振面旋转电场矢量端点做圆周运动偏振光的特性可用斯托克斯矢量完整描述，包括光强、线偏振度、偏振方向和圆偏振度四个参数马吕斯定律指出，通过偏振片的光强与入射偏振光和偏振片轴向夹角的余弦平方成正比，是偏振光强度测量的基础旋光现象的本质是光学活性物质中的手性分子对左旋和右旋圆偏振光传播速度不同，导致相位差累积，最终表现为偏振面旋转旋光角α=［α］·c·l，其中［α］为比旋光度，c为浓度，l为光程，这一关系是旋光分析的基础公式旋光分析法旋光仪结构与原理测量方法与误差分析定量分析应用旋光仪主要由单色光源、起偏器、样品常用的半影法利用人眼对亮度差异的敏旋光分析在糖类、氨基酸、生物碱等手池、检偏器和检测系统组成光通过起感性，通过寻找两半视场亮度相等的位性分子分析中应用广泛通过建立标准偏器形成线偏振光，经过含有光学活性置确定旋光角温度、浓度、光波长和曲线或直接利用比旋光度公式，可实现物质的样品后，偏振面发生旋转，通过样品纯度是影响测量精度的主要因素定量分析在药物分析中，旋光度是手旋转检偏器至光强最大或最小位置，可现代数字旋光仪精度可达±

0.001°，需性药物纯度的重要指标；食品工业中用测定旋转角度现代自动旋光仪采用法进行适当的温度控制和波长校准于糖类含量测定；生物化学研究中则用拉第调制技术实现高精度自动测量于蛋白质构象变化的监测圆二色光谱法基本原理1测量样品对左旋和右旋圆偏振光吸收差异仪器设计利用光弹性调制器产生交替圆偏振光蛋白质分析3确定蛋白质二级结构含量广泛应用4研究核酸、药物及生物大分子构象圆二色性CD是手性分子对左旋和右旋圆偏振光吸收不同的现象圆二色光谱以波长为横坐标，以消光系数差Δε或椭圆度θ为纵坐标，反映分子不对称结构的特征在远紫外区190-250nm，蛋白质的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等二级结构有特征性CD谱带，可通过谱图分析定量计算各结构所占比例现代CD光谱仪通常采用高强度氙灯光源和光弹性调制器PEM，后者通过压电效应产生交替左右圆偏振光CD技术在药物构效关系研究、蛋白质折叠机理探索和核酸-蛋白质相互作用分析等领域发挥着不可替代的作用第六章散射与浊度分析散射与浊度分析法基于光与物质相互作用中的散射现象瑞利散射发生在粒径远小于光波长的体系中dλ/10，散射强度与波长的四次方成反比，这解释了天空呈蓝色的原因瑞利散射强度与粒子体积的平方成正比，对粒径极敏感当粒径与光波长相当时，散射遵循米氏理论，散射强度与波长和角度的关系更复杂浊度是表征溶液散射能力的物理量，通过测量透射光的衰减或散射光的强度来确定，广泛用于水质分析、微生物生长监测和胶体稳定性研究散射光谱和角度分布包含丰富的粒径和形状信息，是现代颗粒分析的基础散射光分析法散射光强度与粒径关系角度散射特性多角度光散射技术对于瑞利散射区的小粒子dλ/10，散射光的角度分布包含丰富的粒径信静态光散射SLS通过测量多个角度的散射强度I与粒径d的六次方成正比，息小粒子散射近似各向同性，而大散射强度，利用Zimm图或Debye图⁶即I∝d这一极强的依赖性使散射法粒子的散射主要集中在前向通过测分析，可获得粒子的回转半径、分子对粒径的微小变化极为敏感，是纳米量不同角度的散射强度，可重构粒径量和第二维里系数等信息，特别适合粒子分析的理想方法分布，这是多角度光散射技术的基本高分子溶液研究原理当粒径增大进入米氏散射区域，散射现代散射仪器采用光电二极管阵列或强度与粒径的关系变得复杂，需要利偏振散射技术通过分析散射光的偏振CCD检测器同时测量多个角度的散射用米氏散射理论进行精确计算粒子特性，提供粒子形状和光学各向异性强度，结合先进的数学反演算法，可的折射率、形状和分布也会影响散射的信息散射矩阵可完整描述散射体实现快速、准确的粒径分布分析特性系的散射特性，包含16个元素，每个元素都反映特定的物理性质浊度分析法浊度测定原理仪器结构与设计应用领域与案例浊度是描述溶液中悬浊度计主要由光源、浊度分析在水质监测浮颗粒对光散射和吸光学系统、样品池和中用于评估饮用水清收能力的物理量，通检测器组成比浊法澈度和处理效果；在常用NTU散射浊度仪器设计简单，直接微生物学中用于测定单位或FTU福马肼比较样品与标准溶液菌液浓度和生长曲浊度单位表示浊的浊度；精密浊度计线；在化学分析中用度测定主要有透射法采用LED光源和多角于沉淀反应的终点判和90°散射法两种度检测系统，消除颜断；在药物分析中用透射法测量透过样品色干扰，提高测量精于检查注射剂的澄明的光强减弱；散射法度现代浊度计可测度；在食品工业中用测量垂直方向的散射量

0.01-1000NTU范于啤酒、果汁等产品光强度围的浊度的质量控制动态光散射技术

0.3100K分辨率数据点秒nm/最小可分辨粒径差异相关器采样速率

0.5~5000测量范围nm典型DLS分析范围动态光散射DLS技术，又称光子相关光谱法，基于布朗运动原理测量纳米粒子的尺寸分布布朗运动导致散射光强度发生起伏，这种起伏的时间尺度与粒子扩散系数成反比，而扩散系数又与粒子尺寸相关通过分析散射光强度的时间自相关函数，可计算出粒子的流体动力学直径DLS仪器由激光光源、光学系统、数字相关器和数据处理软件组成Cumulants方法用于确定平均粒径和多分散指数；CONTIN算法适用于多峰分布的反演作为一种快速、无损的粒径分析技术，DLS广泛应用于纳米材料表征、蛋白质聚集研究、药物制剂稳定性评价和胶体体系分析，能在原位条件下测量1-1000nm范围的粒子第七章显微光学分析光学显微镜原理利用可见光和光学透镜系统放大微小物体，分辨率受限于衍射极限约200nm现代显微镜采用明场、暗场、相差、微分干涉等多种成像模式，适用于不同样品类型荧光显微技术结合荧光染料或标记物与显微成像，利用特殊的激发光源和滤光系统，实现特定结构的选择性成像多波长激发和发射系统可同时观察多种荧光标记，研究复杂的生物过程共聚焦显微分析利用针孔光阑排除焦平面外散射光，获取高对比度的光学切片通过扫描系统采集多层切片，重构三维图像共聚焦系统大大提高了轴向分辨率，是现代生物成像的核心技术光学显微成像分辨率与放大倍数成像系统设计样品制备技术光学显微镜的理论分辨率由瑞利判据决现代研究级显微镜采用无限远光学系统，生物样品通常需要经过固定、脱水、包定d=

0.61λ/NA，其中λ是光波长，NA由物镜、管镜和目镜组成物镜收集样品埋、切片和染色等步骤固定使用甲醛或是数值孔径普通光学显微镜分辨率约为信息并形成无限远像，管镜将无限远光聚戊二醛保持细胞结构；染色使用HE染色200nm，最大有效放大倍数约为焦形成中间像，目镜进一步放大中间像供等方法增强对比度活细胞观察需要特殊1000×超过此值的放大被称为空放大人眼观察照明系统采用柯勒照明原理，的培养皿和环境控制系统材料样品则根，不提供额外信息数值孔径是决定分提供均匀照明相差显微镜通过相板转换据硬度选择研磨、抛光或超薄切片技术，辨率的关键参数，可通过油浸镜增大NA相位差为振幅差，提高透明样品的对比透明样品常用偏光或相差显微法增强对比值度度荧光显微分析荧光标记技术荧光显微系统包括小分子荧光染料如FITC、TRITC、由激发光源汞灯或LED、激发滤光片、荧光蛋白如GFP系列、量子点和荧光纳二向色镜、发射滤光片和检测系统组米颗粒等免疫荧光技术利用抗体-抗原成激发滤光片选择特定波长光激发荧特异性，实现特定蛋白的定位；FISH技光团，发射滤光片只允许发射荧光通术用于检测特定DNA或RNA序列过，提高信噪比生物样品分析多色荧光成像广泛应用于细胞结构研究、亚细胞器定利用不同荧光团的激发和发射光谱差位、细胞动力学跟踪、蛋白质相互作用异，通过滤光系统分离不同荧光信号，和基因表达分析定量荧光分析可通过实现多种生物分子的同时标记和观察标准曲线实现蛋白质等物质含量的测光谱分辨技术可区分光谱重叠的荧光定团共聚焦显微技术原理与特点三维成像能力生物医学应用共聚焦显微镜通过在光路中引入针孔光通过控制焦平面位置，共聚焦系统可获取共聚焦显微镜已成为细胞生物学和神经科阑，只允许焦平面上的光通过，有效阻断样品不同深度的光学切片，典型切片厚度学研究的关键工具在神经元形态学研究了焦平面外的散射光和背景荧光激光光为

0.5-1μm将这些二维切片通过计算机中，可精确重构神经元网络；在活体成像源提供高强度的点照明，通过扫描系统逐软件重构，可形成高分辨率的三维图像中，二光子共聚焦技术允许在完整生物体点采集图像这一设计大大提高了图像对多通道扫描允许同时采集多种荧光信号，内进行深层组织成像；在病理诊断领域，比度和轴向分辨率，使光学切片成为可实现复杂结构的三维重构和可视化现代共聚焦内窥镜技术实现了微观活体组织的能系统还支持体积渲染、表面重构等高级成原位观察，为早期癌症诊断提供新方法像模式超分辨显微技术第八章光学传感与检测技术光纤传感原理表面等离子体共振·基于光纤对光传导特性的变化·金属-介质界面上的电子集体振荡现象·外界参数改变引起光强、相位、偏振或波长变化·共振条件对界面折射率变化极其敏感·光纤本身作为传感元件或与敏感材料复合·可实时、无标记检测分子相互作用·具有抗电磁干扰、远程传输、分布式测量等优势·广泛应用于生物分子相互作用研究光学生物传感器·结合生物识别分子与光学检测系统·检测原理包括荧光、吸收、SPR等多种方式·具有高特异性、高灵敏度和快速响应特点·应用于医疗诊断、食品安全、环境监测等领域光纤传感技术光纤传感器类型工作原理与结构环境监测应用光纤传感器按测量原理可分为强度型光纤光栅传感器基于布拉格衍射原理，光纤化学传感器通过涂覆对特定物质敏（测光强变化）、相位型（干涉测光栅周期变化导致反射光波长移动；法感的材料，测量水体中pH值、溶解氧、量）、偏振型（测偏振态变化）和光谱布里-珀罗干涉仪型传感器利用多光束干重金属离子等参数；光纤气体传感器采型（测波长漂移）；按结构可分为内禀涉测量微小位移；分布式温度传感器利用气敏薄膜或开放光学路径技术，监测型（光纤本身作为敏感元件）和外禀型用拉曼散射光谱特性实现连续测温；温室气体、有毒气体浓度；分布式声波（光纤与敏感材料结合）；按应用可分Mach-Zehnder干涉仪型传感器通过参传感技术实现管道泄漏、结构变形等异为物理量传感器（测温度、压力、加速比光路和测量光路的相位差检测常情况的实时监测度等）和化学/生物传感器表面等离子体共振分析原理与特点仪器设计与结构生物分子相互作用分析SPR表面等离子体共振SPR是金属-介质常见SPR仪器采用Kretschmann构SPR技术已成为研究蛋白质-蛋白质、界面上自由电子的集体振荡现象在型，包括激光光源、棱镜、金属薄膜抗原-抗体、药物-靶点等生物分子相特定入射角度（共振角）下，入射光（通常为50nm厚度的金膜）、流动互作用的标准方法通过分析SPR信能量转移给表面等离子体，导致反射池和光强检测系统光源一般使用波号随时间的变化曲线，可获得分子结光强度急剧下降，形成共振吸收长为

632.8nm的氦氖激光合的动力学参数（结合速率常数ka和解离速率常数kd）和亲和力常数KD共振角位置对金属表面折射率变化极现代SPR仪器多采用角度扫描或波长为敏感，可检测分子吸附引起的微小调制方式，通过CCD或光电二极管阵⁻⁷折射率变化（10量级），实现无标列实现共振曲线的实时采集表面等SPR芯片表面通常采用自组装单分子记、实时监测分子相互作用的目的离子体共振成像SPRI技术能同时监层或羧甲基葡聚糖等修饰，提供生物测芯片表面不同区域的分子相互作分子固定的平台蛋白质固定可通过用，实现高通量分析氨基偶联、生物素-亲和素系统或His标签捕获等多种方式实现光学生物传感器免疫传感器原理光学检测DNA基于抗原-抗体特异性结合，通过光学信号利用核酸杂交原理，结合荧光或SPR等检2检测免疫反应测技术微流控芯片技术快速诊断应用3整合样品处理、反应和检测于一体的微型便携式光学生物传感器实现现场快速检测分析系统光学免疫传感器利用抗原-抗体特异性结合原理，结合荧光、化学发光、SPR等检测方式，实现对疾病标志物、病原体和药物残留等的高灵敏检测基于量子点、上转换纳米颗粒等新型荧光标记物的免疫荧光分析可达到皮克摩尔级检测限DNA光学检测技术包括荧光标记PCR、分子信标、DNA芯片等多种形式，在基因检测、病原体鉴定和法医分析中应用广泛微流控芯片与光学检测结合形成实验室芯片，实现样品处理、反应和检测的自动化和集成化便携式光学生物传感器通过微型光源、检测器和智能手机等平台的整合，为即时检测POCT提供了有力工具，在疾病诊断、食品安全和环境监测领域有广阔应用前景第九章光学分析数据处理信号处理基础光学分析信号的特征、噪声来源与类型、信号增强与滤波技术、信噪比优化策略傅里叶变换、小波变换等数学工具在光谱信号处理中的应用2定量分析方法工作曲线法、标准加入法、内标法等定量计算方法的原理与应用线性回归、非线性拟合等数据处理技术检测限、定量限、线性范围的确定3多元校正技术处理光谱数据中的重叠信号、干扰和基质效应主成分分析PCA降维和数据可视化偏最小二乘回归PLS建立预测模型聚类分析实现样品分类光谱数据预处理基线校正基线漂移是影响光谱数据精确度的常见问题，来源于仪器漂移、散射效应和基质干扰等常用校正方法包括线性或多项式拟合法、一阶或二阶求导法、滚动球算法和自适应迭代算法等基线校正可显著提高峰面积和峰高测量的准确度，是定量分析的重要前处理步骤平滑与微分光谱数据平滑可有效抑制随机噪声，常用算法包括移动平均法、Savitzky-Golay平滑、小波变换滤波等微分处理能增强光谱特征，提高分辨率，一阶微分消除基线偏移，二阶微分消除线性基线，但会降低信噪比平滑窗口大小和微分阶数需根据信号特性合理选择，避免过度平滑导致信息丢失归一化处理光谱数据归一化旨在消除样品厚度、浓度等因素的影响，实现不同样品间的可比性常用方法包括最大值归一化、面积归一化、向量归一化和标准正态变量变换SNV等归一化处理对于消除样品间的系统误差、突出光谱形状特征和提高模型稳定性具有重要意义，尤其在近红外光谱分析中应用广泛多变量光谱分析主成分分析偏最小二乘回归人工神经网络应用主成分分析PCA是一种无监督降维技术，偏最小二乘回归PLS是光谱定量分析中最人工神经网络ANN能处理光谱数据中的将高维光谱数据转换为少数几个互不相关常用的多元校正方法，同时考虑自变量X非线性关系，近年在光谱分析中应用日益的主成分PCA分解光谱数据矩阵为得分和因变量Y的变异，寻找最能解释Y变异广泛反向传播神经网络常用于光谱定量矩阵和载荷矩阵的乘积，载荷反映原始变的X潜变量与多元线性回归相比，PLS能分析；自组织映射网络用于光谱分类；深量的相对重要性，得分图可视化样品分有效处理变量间共线性问题交叉验证用度学习方法如卷积神经网络在光谱图像处布PCA广泛用于异常值检测、样品分类于确定最佳潜变量数量，预测残差平方和理中表现出色ANN模型训练需避免过拟和预处理效果评估，是光谱数据探索性分PRESS和决定系数R²评估模型性能合，通常结合主成分分析进行变量筛选，析的基础工具PLS在近红外、拉曼光谱等复杂光谱分析以减少输入维度中尤为重要总结与展望光学分析技术在过去几十年取得了长足发展，从传统的分光光度法发展到如今的超分辨显微技术和单分子检测方法随着仪器微型化和便携化趋势，手持式和芯片级光谱仪已成为现实，将光学分析从实验室带到现场应用场景，实现即时检测和远程监控人工智能和机器学习算法与光学分析的结合，正在革新数据处理和解释方式，提高了复杂样品的分析能力和自动化水平光学技术与其他分析方法（如质谱、电化学）的联用，形成了多维表征平台，为材料科学、生命科学和环境科学等领域提供了强大的分析工具未来，量子光学、超表面光学和生物光子学等新兴领域的突破，将进一步拓展光学分析的边界，开创更精准、更深入的物质探索新时代。