《分子生物学实验》课件

分子生物学实验欢迎各位同学参加《分子生物学实验》课程本课程旨在通过理论与实践相结合的教学方法，帮助同学们掌握分子生物学实验的基本技能和原理通过本课程的学习，你将能够独立进行DNA和RNA提取、PCR扩增、蛋白质分析等实验操作课程评分标准为实验报告占60%，期末考试占40%为确保实验安全和结果准确，请所有同学严格遵守实验室规范和安全指南希望通过本课程的学习，同学们能够建立扎实的分子生物学实验基础，为今后的科研工作打下坚实基础分子生物学实验概述1分子生物学定义分子生物学是研究生命现象和生命过程分子基础的学科，主要关注生物大分子如DNA、RNA和蛋白质的结构与功能这一学科的发展为我们理解生命的本质提供了全新视角2发展历史关键里程碑1953年沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，奠定了分子生物学的基础此后，科学家们陆续破解了遗传密码，完成了人类基因组测序等重大突破3中心法则确立分子生物学中心法则描述了遗传信息从DNA→RNA→蛋白质的传递过程，是理解生命信息传递的核心原理，也是分子生物学实验的理论基础4现代应用领域现代分子生物学技术广泛应用于医学诊断、药物研发、农业育种、法医鉴定等众多领域，已成为推动生命科学和医学发展的关键力量实验室安全与操作规范生物安全等级介绍生物安全等级分为BSL1-4四个等级我们的实验室属于BSL-2级别，要求采取适当的防护措施，操作潜在的致病微生物时必须严格遵循安全规程，确保实验室和环境安全个人防护装备使用进入实验室必须穿戴实验服、一次性手套和护目镜操作生物样品或有害试剂时，应根据需要增加防护面罩、防护鞋套等装备，确保个人安全危险化学品处理所有危险化学品必须在通风橱内操作，溅出应立即按程序处理，废液必须收集在专门容器中，严禁随意倾倒遵循少量取用、及时归还原则实验废弃物处理实验废弃物必须分类处理普通废弃物、感染性废弃物、化学废弃物和尖锐物品各有专门容器离开实验室前，确保所有废弃物妥善处理，保持实验台清洁实验室基本设备介绍离心机仪电泳设备PCR离心机利用离心力原理分离PCR仪通过精确控制温度循电泳设备用于分离核酸或蛋样品组分使用时必须严格环实现DNA扩增程序设置白质水平电泳系统主要用平衡，避免高速旋转导致的包括变性、退火和延伸三个于DNA/RNA分析，垂直电振动损坏不同样品需选择主要步骤，温度和时间设置泳系统多用于蛋白质分离合适的转子和离心力，确保直接影响PCR扩增效率和特操作时注意安全，避免电击样品分离效果异性风险显微镜系统显微观察和成像系统用于细胞形态学研究和免疫荧光分析操作前需熟悉显微镜光路调节和成像软件使用，确保获得清晰的细胞图像基因组提取原理DNA细胞裂解利用物理或化学方法破坏细胞膜和核膜，释放细胞内容物包括DNA蛋白质去除使用蛋白酶和变性剂处理，去除与DNA结合的蛋白质核酸纯化通过沉淀或柱层析方法分离并纯化DNA基因组DNA提取是分子生物学实验的基础步骤提取过程涉及细胞裂解、去除蛋白质和其他细胞成分、核酸纯化三个主要环节影响DNA提取质量的关键因素包括样品保存状态、裂解效率、蛋白酶处理时间以及纯化方法选择不同纯化方法各有优缺点传统的酚-氯仿法纯度高但有毒性风险；硅胶柱纯化法操作简便但成本较高；磁珠法适合高通量处理但回收率可能较低选择合适的方法对后续实验至关重要基因组提取实验步骤DNA样本预处理不同来源样本（组织、细胞、血液）需采用不同预处理方法组织样本需充分研磨，细胞样本需适当离心收集，血液样本需先溶解红细胞裂解处理添加裂解缓冲液（含SDS、EDTA等）破坏细胞膜和核膜结构SDS作为去垢剂溶解细胞膜脂质，EDTA螯合二价阳离子抑制核酸酶活性蛋白酶消化K55°C条件下蛋白酶K处理1小时，降解组蛋白等与DNA结合的蛋白质温度和时间需精确控制，过长会降解DNA，过短则蛋白去除不完全酚氯仿抽提-加入等体积酚-氯仿混合液，充分振荡后离心，形成水相和有机相分层，DNA溶于上层水相，蛋白质停留在界面和有机相中纯化与质量检测DNA1乙醇沉淀加入1/10体积3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，低温孵育促使DNA沉淀原理是乙醇降低DNA溶解度，高盐环境中DNA带正电的钠离子中和磷酸骨架负电荷，降低溶解性2浓度测定使用分光光度计测定DNA浓度，A260读数乘以稀释倍数和转换系数50μg/ml计算浓度A260/A280比值在

1.8-

2.0之间表明DNA纯度良好，低于

1.8说明有蛋白质污染3电泳检测通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，高质量的基因组DNA应在凝胶顶端形成单一清晰条带，拖尾现象表明DNA降解，多条带则可能有RNA污染4问题诊断常见问题包括DNA产量低、纯度差或降解严重解决方案包括优化样本处理方法、调整裂解条件、延长蛋白酶K消化时间或更换纯化试剂提取基本原理RNA与结构差异控制策略不同类型提取差异RNA DNARNase RNARNA是单链结构，含有核糖而非脱氧核RNase是广泛存在的核糖核酸酶，非常总RNA包含多种RNA类型，mRNA仅占糖，尿嘧啶代替胸腺嘧啶这些结构差稳定且难以灭活RNA提取过程中必须总RNA的1-5%，带有polyA尾巴小异导致RNA比DNA更不稳定，更容易降严格控制RNase污染，常用方法包括使RNA如miRNA、siRNA分子量小，提取解，因此RNA提取过程要求更严格的环用DEPC处理的水和溶液、佩戴手套、使方法需要特别调整不同RNA类型的提境控制用RNase抑制剂等取方法各有侧重RNA分子中2位羟基使其比DNA更容易DEPC通过修饰RNase活性位点的组氨酸总RNA提取通常采用酚-氯仿法或柱层析水解，成为RNA提取中需要特别注意的残基来灭活酶活性，是RNA实验中常用法，而mRNA富集则需要利用其polyA因素的RNase控制试剂尾巴与oligodT的特异性结合提取实验操作RNA样品处理组织匀浆收集组织或细胞样本，迅速处理或速冻保存使用匀浆器在TRIzol中充分研磨组织沉淀相分离RNA异丙醇沉淀水相中的RNA并洗涤加入氯仿后离心，分离RNA至水相TRIzol法提取总RNA是分子生物学中常用的技术TRIzol试剂含有异硫氰酸胍和酚，能同时抑制RNase活性并溶解细胞组分样品匀浆是关键步骤，必须确保组织完全分散以获得高产量RNA整个操作过程必须在低温（冰上或4°C）、无RNase环境下进行相分离后，RNA主要分布在上层水相，DNA和蛋白质则主要位于中间层和有机相提取的RNA最终可用75%乙醇洗涤去除残留盐分，风干后溶于DEPC水中保存质量检测与保存RNARNA质量控制是后续实验成功的关键分光光度计检测RNA纯度时，A260/A280比值应≥

1.8，表明蛋白质污染少；A260/A230比值应

2.0，表明无酚或其他有机物污染变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，完整的RNA在凝胶上应显示清晰的28S和18S核糖体RNA条带，且28S:18S条带强度比接近2:1RNA样品应保存在-80°C条件下，添加RNase抑制剂以防降解反复冻融会导致RNA降解，应将RNA分装成小份储存RNA降解的常见原因包括RNase污染、不当的温度处理、pH不适宜或样品长期存放，可通过生物分析仪（如Bioanalyzer）进行RNA完整性评估原理与应用PCR扩增原理体外指数级扩增特定DNA片段的分子生物学技术循环过程通过温度循环控制实现变性、退火、延伸三个基本步骤关键组分3模板DNA、引物、热稳定DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液PCR技术是现代分子生物学的核心技术之一，基于DNA复制的生物学原理，在体外实现DNA的特异性扩增PCR反应包括三个基本步骤变性阶段（94-98°C），双链DNA解开形成单链；退火阶段（50-65°C），引物与单链DNA模板结合；延伸阶段（72°C），Taq聚合酶从引物3端开始合成新链Taq DNA聚合酶来源于嗜热菌Thermus aquaticus，能在高温环境下保持活性，是PCR成功的关键因素PCR技术在分子生物学中应用广泛，包括基因克隆、序列分析、突变检测、基因表达研究和分子诊断等领域，已成为生命科学研究不可或缺的基础工具引物设计PCR长度选择含量控制GC理想的PCR引物长度应在18-25bp之间引物过短会降低特异性，导致引物的GC含量应保持在40-60%之间GC含量过高会导致引物形成二非特异性扩增；引物过长则会降低反应效率，增加合成成本对于大级结构或引起非特异性扩增；GC含量过低则会降低引物与模板的结合多数应用，20bp左右的引物长度能够提供足够的特异性和扩增效率稳定性GC含量直接影响引物的退火温度和PCR反应效率退火温度软件辅助设计合适的退火温度是PCR成功的关键退火温度可通过公式常用引物设计软件包括Primer Premier、Primer3和Oligo等这些Tm=2A+T+4G+C进行粗略估算，实际PCR中设置的退火温度通常工具可自动检查引物的二级结构、二聚体形成、特异性以及GC含量等比计算值低3-5°C一对引物的Tm值差异应控制在5°C以内，以确保两参数，大大提高引物设计的准确性和便捷性条引物同时发挥作用反应体系优化PCR1-100ng模板浓度DNA对扩增效率和特异性有重要影响

1.5-4mM⁺浓度Mg²影响聚合酶活性和扩增特异性200μM浓度dNTP提供DNA合成所需核苷酸原料℃5-10退火温度梯度确定最佳特异性扩增条件PCR反应体系的优化是获得高质量扩增产物的关键模板DNA浓度范围通常在1-100ng之间，过高的模板浓度可能导致非特异性扩增，过低则会影响扩增效率或导致扩增失败Mg²⁺作为DNA聚合酶的辅助因子，其浓度对反应特异性和产量有显著影响，通常需要在

1.5-4mM范围内优化dNTP浓度通常控制在200μM左右，过高会影响反应特异性，过低则会限制DNA合成退火温度优化可通过梯度PCR实现，在预测温度上下5℃范围内设置8-12个温度梯度，通过比较不同温度下的扩增效果，确定最佳退火温度此外，引物浓度、酶量、缓冲液组成等因素也需要根据具体实验目的进行调整实验操作步骤PCR反应体系配置PCR反应体系配置需在洁净环境中进行，避免DNA污染标准50μL反应体系包含模板DNA、10X PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、正反向引物、Taq酶和灭菌水加样顺序通常是先加水和缓冲液，最后加入酶，避免酶长时间暴露在室温下热循环条件设置典型的PCR程序设置包括初始变性（95°C，3-5分钟）；30-35个循环的变性（95°C，30秒）、退火（55-65°C，30秒）和延伸（72°C，根据产物长度，一般每kb需1分钟）；最后进行终末延伸（72°C，5-10分钟）对照设置与产物分析阴性对照（不含模板DNA）用于检测可能的污染，阳性对照（已知能成功扩增的模板）用于验证反应体系的可靠性PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，评估扩增特异性和产量产物应保存在-20°C，避免反复冻融多种技术变式PCR巢式PCR巢式PCR（Nested PCR）采用两轮PCR反应，第二轮使用针对第一轮产物内部序列的引物，大大提高了扩增的特异性这种技术特别适用于检测样品中含量极低的目标序列，或需要极高特异性的场合但操作过程中交叉污染风险较高，需特别注意多重PCR多重PCR（Multiplex PCR）在单个反应体系中同时使用多对引物，可同时扩增多个靶标序列这种技术大大提高了检测效率，节省样品和试剂，但引物设计要求更高，需避免引物间相互干扰引物的Tm值应相近，产物大小应有明显差别以便电泳分离实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（qPCR）通过荧光信号实时监测PCR产物的积累，实现对核酸的定量分析相比传统PCR，qPCR具有更高的灵敏度、特异性和更宽的定量范围，已成为基因表达研究和病原体检测的重要工具逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）首先利用逆转录酶将RNA转换为cDNA，然后进行常规PCR扩增这是研究基因表达的重要工具，可检测特定基因的转录水平结合实时荧光技术的RT-qPCR更是成为基因表达定量分析的金标准实时荧光定量（）PCR qPCR原理与传统区别荧光检测体系定量方法PCR实时荧光定量PCR（qPCR）的核心原理SYBR Green是一种嵌入式荧光染料，能相对定量通过比较目的基因与内参基因是在PCR反应中添加荧光报告分子，通结合双链DNA并发出强烈荧光，操作简的表达变化，计算相对表达倍数，适用过检测每个循环后荧光信号的强度来监便但缺乏特异性，所有双链DNA产物于比较不同处理组间的基因表达差异测产物的积累与传统PCR的端点检测（包括引物二聚体）都会产生信号绝对定量则通过标准曲线确定样品中目不同，qPCR能够在指数期实时监测扩增TaqMan探针是一种特异性更高的检测标核酸的确切拷贝数，需要已知浓度的过程，提供更精确的定量信息系统，基于5核酸酶活性和FRET原理，标准品系列稀释，适用于病毒载量等精qPCR仪器同时具备PCR扩增和荧光检测只有当特定靶序列被扩增时才产生荧光确定量场景功能，能在每个循环后记录荧光强度变信号，大大提高了检测特异性化，形成扩增曲线，用于计算起始模板的量实验设计与操作qPCR重复设置标准曲线制作确保实验结果的可靠性和准确性用于绝对定量和评估反应效率•每个样品设置三个技术重复内参基因选择•准备5-6个连续10倍稀释的标准品•CT值差异应

0.5个循环熔解曲线分析理想的内参基因应在不同实验条件下•覆盖预期样品浓度范围•包括无模板对照（NTC）检测污表达稳定验证产物特异性，排除非特异扩增•理想扩增效率在90-110%之间染•常用内参GAPDH、β-actin、•特异性产物显示单一峰值18S rRNA•多峰表明有非特异扩增或引物二•验证内参在实验条件下的稳定性聚体•可使用多个内参基因提高可靠性•不同产物有不同熔解温度（Tm）数据分析方法qPCR电泳技术原理DNA电泳原理DNA分子在电场作用下，由于磷酸骨架带负电荷，向正极移动小分子移动速度快，大分子移动速度慢，从而实现分离凝胶浓度选择琼脂糖浓度决定凝胶的孔径大小，影响DNA分离效果大片段DNA（5kb）适合

0.8%凝胶，小片段（500bp）适合2%凝胶染色DNA溴化乙锭（EB）是常用DNA染色剂，能插入DNA碱基对之间，在紫外光照射下发出橙红色荧光，实现DNA可视化凝胶成像通过凝胶成像系统记录紫外灯照射下的DNA条带，可用于DNA大小判断和半定量分析琼脂糖凝胶电泳实验1凝胶配制根据目标DNA大小选择琼脂糖浓度（

0.8-2%），将琼脂糖粉末加入1×TAE或TBE缓冲液中，加热至完全溶解，冷却至约60°C后加入EB染料（终浓度

0.5μg/ml），倒入凝胶槽并插入梳子，室温凝固30分钟2样品准备与上样DNA样品与6×上样缓冲液（含溴酚蓝和甘油）混合，上样缓冲液帮助样品沉入凝胶孔中并提供迁移指示使用微量加样器小心将样品加入凝胶孔中，避免穿刺凝胶底部或样品溢出3电泳条件设置将凝胶置于电泳槽中，加入足量电泳缓冲液覆盖凝胶表面设置适当电压（80-120V），根据胶的大小和浓度运行30-60分钟电压过高会导致凝胶发热和条带弥散，过低则会延长电泳时间4成像与分析电泳结束后，在紫外透射仪上观察DNA条带（注意防护紫外辐射），并使用凝胶成像系统拍照记录通过与DNA分子量标记物（Marker）比较，可估算样品DNA片段大小核酸分子量与浓度计算条带位置（cm）标准品分子量（bp）Log分子量

1.

0100004.

02.

530003.

483.

810003.

05.

25002.

76.

51002.0核酸分子量估算基于样品条带与已知分子量标准品的迁移距离比较在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段迁移距离与其分子量对数值成反比通过绘制标准曲线（迁移距离vs.log分子量），可推算未知样品的分子量DNA浓度的半定量计算可通过比较样品条带与已知浓度标准品的荧光强度实现使用图像分析软件如ImageJ可对电泳图像进行密度扫描，通过积分峰面积计算相对浓度更精确的定量需结合分光光度计测定A260值或荧光染料法条带弥散、过曝或背景高都会影响准确性，解析相近大小的片段时应优化电泳条件蛋白质电泳SDS-PAGE原理1利用SDS使蛋白质变性并带上均一负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中分离凝胶配制分离胶（

7.5-15%）和浓缩胶（5%）具有不同的pH和孔径大小样品处理样品与SDS上样缓冲液混合，100°C加热5分钟使蛋白质完全变性染色检测考马斯亮蓝R-250染液显示蛋白质条带，显影后可进行扫描分析SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是分析蛋白质分子量和纯度的重要技术SDS是一种阴离子去垢剂，能与蛋白质以固定比例（

1.4g SDS/g蛋白质）结合，使不同蛋白质带有相似的负电荷密度，从而主要基于分子量大小进行分离β-巯基乙醇在样品处理中用于还原二硫键，确保蛋白质完全变性分离胶浓度的选择取决于目标蛋白质的分子量大蛋白（100kDa）适合

7.5%胶，中等大小蛋白（30-100kDa）适合10-12%胶，小蛋白（30kDa）适合15%胶电泳通常以恒压模式进行，浓缩胶80V，进入分离胶后120V除考马斯染色外，银染可提供更高灵敏度，适合检测微量蛋白质，而荧光染料则便于后续质谱分析蛋白质印迹技术（）Western Blot电泳分离首先通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物，根据分子量大小将不同蛋白质分离成离散条带根据目标蛋白质大小选择合适的胶浓度，确保最佳分离效果电泳完成后，凝胶需轻柔处理，避免机械损伤转膜过程使用湿转或半干转系统，将凝胶中的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上湿转提供更高转移效率，适合大分子量蛋白；半干转速度快，适合常规分析转膜缓冲液通常含有甲醇，帮助SDS解离并提高膜的亲和力转膜条件为恒压100V1小时（湿转）或15-25V30分钟（半干转）免疫检测转膜后用5%脱脂奶粉或BSA封闭膜1小时，避免抗体非特异性结合随后加入特异性一抗（1:1000-1:5000稀释），4°C孵育过夜TBST洗涤后加入HRP标记的二抗（1:5000-1:10000稀释），室温孵育1小时再次彻底洗涤后，使用ECL试剂进行化学发光检测，记录目标蛋白信号限制性内切酶分类与命名识别序列与切割方式限制性内切酶是从细菌中分离的一类能特异性识别并切割双链DNA的酶根据大多数常用限制酶识别4-8bp的特定DNA序列，通常为回文序列根据切割方复杂程度和作用方式分为I型、II型和III型，其中II型最常用于分子生物学实验式分为产生粘性末端（如BamHI产生5突出端，PstI产生3突出端）和平末端酶的命名采用三字母缩写表示来源生物（如EcoRI来自大肠杆菌R株），数字和（如SmaI）两类识别位点中常含有甲基化敏感位点，甲基化可阻止某些酶的字母表示分离顺序切割活性反应条件双酶切设计不同限制酶有其最适反应条件，包括最适缓冲液（pH、盐浓度）、温度（通常双酶切反应可同时使用两种限制酶，提高克隆效率设计双酶切需考虑两种酶37°C）、BSA需求等大多数酶在37°C活性最高，反应时间通常为1-4小时过的缓冲液兼容性、最适温度和甲基化敏感性若缓冲液不兼容，需先用高盐缓量酶或延长反应时间可能导致非特异性切割（Star activity），影响实验结果冲液的酶反应，然后调整条件进行第二种酶的消化，或分两步消化准确性限制性酶切实验限制性酶切实验是分子克隆和DNA分析的基础技术标准的酶切反应体系（20μL）包含1-5μg DNA、2μL10×酶切缓冲液、

0.5-1μL限制酶（5-10U）和适量无核酸酶水反应前应充分混匀但避免剧烈振荡，离心收集管壁液滴酶切温度和时间根据酶的活性和DNA量调整，通常37°C反应1-4小时，某些特殊酶如SmaI需在25°C反应酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，观察片段大小与预期是否一致如出现异常结果，可能的原因包括DNA样品污染、酶活性下降、反应条件不适宜或DNA甲基化解决策略包括使用新鲜试剂、优化反应条件、延长消化时间或增加酶量对于难以切割的位点，可考虑使用同等位点的其他限制酶或添加适量BSA提高反应效率克隆载体系统常用载体类型选择标记pUC、pBR322等小质粒载体具有复制起点、筛选抗生素抗性基因（如氨苄青霉素、卡那霉素）用标记和多克隆位点于转化后的阳性克隆筛选表达元件多克隆位点表达载体还含启动子、终止子和融合标签等特殊含多种限制酶识别位点的区域，便于插入外源功能元件DNA片段克隆载体是分子克隆的重要工具，用于携带和复制外源DNA片段常用的pUC系列载体具有高拷贝数特性，含有lacZ基因可进行蓝白斑筛选；pBR322是早期开发的多用途载体，含四环素和氨苄青霉素双重抗性；而pET系列则是强大的原核表达载体，含T7启动子和lac操纵子调控系统多克隆位点（MCS）设计是载体的关键特征，通常包含多种不重叠的限制酶位点，便于不同策略的克隆实验表达载体还含有特殊元件如强启动子（T

7、CMV等）、有效的终止子和各种融合标签（His、GST、MBP等）选择合适的载体系统需考虑实验目的、宿主范围、克隆容量、表达效率等多种因素，为实验成功奠定基础连接反应原理与操作连接酶机制粘性末端与平末端连接连接反应优化T4DNAT4DNA连接酶来源于T4噬菌体，是连接粘性末端连接效率较高，通常在16°C反插入片段与载体摩尔比例对连接效率影反应的核心酶它催化DNA片段之间磷应1-4小时或4°C过夜低温有助于稳定响显著，通常维持3:1至5:1的比例获得最酸二酯键的形成，能修复DNA链中的缺碱基互补配对，提高连接效率粘性末佳效果计算方法摩尔比=（插入片段口，将两个双链DNA片段连接成一个完端由于碱基互补配对的辅助，连接效率ng数/插入片段bp数）÷（载体ng数/载整分子比平末端高10-100倍体bp数）连接酶利用ATP作为能量来源，首先酶的平末端连接效率较低，通常需要更多的标准连接反应体系（20μL）包含50-赖氨酸残基与ATP反应形成酶-AMP复合酶量、更长的反应时间（室温2小时或100ng载体DNA、适量插入片段、2μL物，释放焦磷酸；然后AMP转移到DNA16°C过夜）和更高的DNA浓度可通过10×连接缓冲液、1μL T4DNA连接酶5端磷酸基团上；最后酶催化5端活化的添加PEG或分子拥挤剂提高反应效率（400U/μL）和无核酸酶水反应结束磷酸基团与相邻3端羟基反应，形成磷酸平末端连接的优势是不需要考虑兼容后，可直接用于转化或65°C10分钟灭活二酯键，同时释放AMP性，任何平末端片段都可连接酶后保存避免反复冻融连接酶，可分装后-20°C保存转化原理与技术⁰10⁸10¹常规感受态效率超级感受态效率化学感受态细胞的典型转化效率（cfu/μg）商业超级感受态细胞可达到的转化效率℃

422.5kV热激温度电转标准电压化学感受态细胞热激转化的最佳温度电穿孔法使用的典型电压值转化是将外源DNA导入宿主细胞的过程，是分子克隆的关键步骤化学感受态细胞制备方法通常采用氯化钙法将对数期细胞收集后，用预冷的

0.1M CaCl₂溶液处理，使细胞表面带正电荷，有利于负电荷DNA的结合；经冰浴孵育后，可直接使用或加入甘油-80°C保存CaCl₂处理使细胞膜通透性增加，有助于DNA在热激过程中进入细胞热激转化是实验室最常用的转化方法将感受态细胞与DNA混合，冰上孵育30分钟使DNA吸附于细胞表面；随后42°C热激90秒，创造瞬时膜孔使DNA进入细胞；立即冰浴2分钟封闭膜孔；加入SOC恢复培养基，37°C振荡培养60分钟后涂板筛选电转化技术利用短暂高压电脉冲（通常

2.5kV，5ms）在细胞膜上形成微孔，效率比化学转化高10-100倍，特别适用于大质粒或低效转化系统，但设备要求较高转化实验操作步骤感受态细胞解冻将-80°C保存的感受态细胞置于冰上轻轻解冻，避免剧烈搅拌或室温放置细胞解冻后应保持在冰上，防止感受态能力下降每管细胞只能使用一次，不可反冻冻，剩余细胞应丢弃与细胞孵育DNA向100μL感受态细胞中加入10μL连接产物或1-10ng质粒DNA，轻轻混匀后冰上孵育30分钟这一步允许DNA分子吸附在细胞表面，是成功转化的重要前提孵育时间不宜过短，否则DNA吸附不充分热激处理将细胞-DNA混合物置于42°C水浴中精确热激90秒，立即转移到冰上冷却2分钟热激时间和温度必须严格控制，过长或过短都会降低转化效率热激创造的瞬时膜孔使DNA得以进入细胞内部恢复与涂板加入900μL SOC培养基（含葡萄糖和多种盐类），37°C振荡培养60分钟使细胞恢复并表达抗性基因将不同体积（50-200μL）的细胞悬液涂于含相应抗生素的琼脂平板上，37°C孵育过夜形成单菌落计数菌落数量可估算转化效率质粒提取原理DNA细菌培养大量培养含目标质粒的细菌碱裂解SDS-NaOH溶液裂解细胞并变性DNA选择性沉淀中和后染色体DNA与蛋白质共沉淀质粒纯化通过沉淀或柱层析收集纯化质粒质粒DNA提取的碱裂解法是最广泛使用的方法，基于质粒DNA与染色体DNA对碱性环境响应差异的原理首先用含EDTA的缓冲液重悬细菌，EDTA螯合二价阳离子抑制核酸酶；然后加入SDS-NaOH溶液（溶液II），SDS溶解细胞膜脂质，NaOH使DNA变性成单链；随后加入酸性钾盐溶液（溶液III）中和碱性，此时染色体DNA因分子量大，不能迅速复性而与变性蛋白质形成不溶性复合物沉淀，而环状质粒DNA能快速复性保持溶解状态小量提取（Miniprep）适用于筛选克隆和常规分析，操作简便但产量和纯度有限；大量提取（Maxiprep）用于获取高质量和大量质粒，适合测序、转染等下游应用常用试剂盒如Qiagen、Promega等基于硅胶膜吸附或离子交换树脂原理，提供标准化的操作流程和稳定的提取效果，广泛应用于实验室日常工作质粒小量提取实验DNA1菌体收集2裂解步骤挑取单菌落接种5mL含抗生素的LB培养基，37°C振荡培先用250μL溶液I（50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl养12-16小时至浑浊取

1.5mL细菌培养物于离心管中，pH

8.0,10mM EDTA）重悬菌体；加入250μL新鲜配制的12,000rpm离心1分钟收集菌体弃上清后可选择再次加溶液II（

0.2N NaOH,1%SDS），轻轻翻转混匀，室温孵入培养物增加产量这一步收集的菌体数量直接影响提取育5分钟；随后加入350μL预冷的溶液III（3M醋酸钾,的质粒产量pH

5.5），立即翻转混匀，冰上孵育5分钟轻柔混合避免染色体DNA剪切3沉淀与纯化4溶解与保存12,000rpm离心10分钟，小心吸取上清至新管中，避免触用30-50μL TE缓冲液（10mM Tris-HCl pH

8.0,1mM及沉淀向上清中加入

0.7倍体积异丙醇，混匀后室温孵EDTA）或无核酸酶水溶解沉淀，加入1μL RNaseA育2分钟，12,000rpm离心10分钟沉淀质粒DNA弃上（10mg/mL）消化RNA，37°C孵育15分钟测定浓度后清，加入500μL70%乙醇洗涤沉淀，再次离心后弃上清，可-20°C保存备用高质量的小量质粒提取产物浓度通常室温干燥5-10分钟至乙醇完全挥发在100-300ng/μL之间质粒鉴定方法鉴定限制性酶切分析测序验证PCR使用针对插入片段或载体-插利用限制酶消化质粒，通过凝直接测定克隆的核苷酸序列是入连接处的引物进行PCR扩胶电泳验证酶切图谱与预期是最精确的鉴定方法，能验证插增，可快速筛查大量克隆优否一致应选择能切出插入片入片段的完整性和正确性测点是灵敏度高、操作简便；但段的酶或产生特征性片段的酶序数据可通过BLAST等工具与可能出现假阳性结果，尤其是组合，便于直观判断电脑软参考序列比对，确认序列无突使用残留模板DNA作为起始材件可预测酶切图谱，辅助实验变或错误测序引物应设计在料进行克隆时设计和结果分析插入片段两侧的载体序列上阳性克隆筛选筛选策略应从简到繁先用蓝白斑筛选或菌落PCR快速初筛，再通过小量提取和限制性酶切确认，最后选择关键克隆进行测序验证对于表达载体，可进一步通过小规模表达实验验证目的蛋白的表达情况原核表达系统启动子类型大肠杆菌表达系统控制基因表达的关键元件最常用的原核表达系统•T7启动子最强表达，需T7RNA聚合酶•pET系列T7启动子控制，表达量高•pGEX系列tac启动子，GST融合表达•tac/lac启动子中等强度，易于控制•pMAL系列tac启动子，MBP融合增溶•araBAD启动子精确调控，低泄漏表达融合标签选择表达条件优化便于纯化和增加蛋白溶解度提高产量和溶解度的策略•His标签小巧，镍亲和层析纯化•降低温度（16-30°C）减少包涵体形成•GST标签增加溶解度，谷胱甘肽亲和•调整IPTG浓度（

0.1-1mM）控制表达强纯化度•MBP标签显著提高溶解度，淀粉亲和•选择合适宿主菌株（BL

21、Rosetta等）纯化重组蛋白诱导表达重组蛋白纯化技术亲和层析是重组蛋白纯化的主要技术，基于特定标签与固定相配体的特异性结合His标签蛋白纯化利用组氨酸侧链与镍离子Ni²⁺或钴离子Co²⁺的配位作用，常用NTA-Ni²⁺柱进行纯化；洗脱时使用咪唑竞争性取代His标签，通常20-50mM咪唑洗涤，250-500mM咪唑洗脱GST融合蛋白则利用谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽的高亲和力，用还原型谷胱甘肽洗脱蛋白浓度测定常用方法包括BCA法基于蛋白质与Cu²⁺反应生成Cu⁺，后者与BCA试剂形成紫色复合物，受氨基酸组成影响较小；Bradford法基于考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后吸收峰从465nm移至595nm的特性，操作简便但受碱性和去垢剂干扰纯化蛋白应分装并加入10-15%甘油，-80°C保存；对于不稳定蛋白，可添加还原剂、保护剂或酶抑制剂，避免反复冻融导致活性损失免疫组化技术原理抗原抗体反应基础直接法与间接法组织样本处理-免疫组化技术基于抗体分子能特异性识直接法使用直接标记的一抗（如酶或荧组织固定是保存抗原性和维持组织形态别并结合组织切片中的抗原表位这种光团标记），操作简单快速，但灵敏度的关键步骤常用10%中性福尔马林固特异性结合是由抗体分子的可变区与抗较低，常用于信号强的抗原由于每个定，时间过长会导致抗原掩蔽，过短则原表位之间的非共价相互作用（氢键、抗原分子只能结合一个标记抗体，信号组织形态保存不佳静电力、范德华力等）形成的放大有限石蜡包埋后，组织切片厚度通常为4-抗体结合抗原后，通过与抗体结合的标间接法先使用未标记的一抗与抗原结6μm，过厚会导致背景高，过薄则信号记物（如酶、荧光团）产生可视信号，合，再用标记的二抗（识别一抗的Fc弱切片经脱蜡、水化后，常需进行抗显示抗原在组织中的定位和表达水平段）进行检测优点是灵敏度高（一个原修复，恢复被甲醛交联掩蔽的抗原表这种方法不仅能确定抗原存在与否，还一抗可结合多个二抗，产生信号放位，提高染色效果能展示其在组织和细胞内的精确分布大），一种标记二抗可用于多种一抗检测，节约成本间接法是实验室最常用的方法免疫组化实验步骤组织切片准备石蜡切片需经二甲苯脱蜡（3×5分钟），梯度乙醇水化（100%、95%、85%、75%各3分钟），PBS清洗冰冻切片需冷丙酮固定10分钟，PBS清洗切片厚度通常控制在4-6μm，过厚影响抗体渗透，过薄则组织形态保存不佳抗原修复福尔马林固定导致蛋白交联掩蔽抗原，需抗原修复热修复法将切片浸入柠檬酸缓冲液（pH

6.0）中，高压锅加热2分钟或微波炉中加热10-20分钟；酶解法用胰蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶处理10-20分钟（37°C）不同抗原需选择适合的修复方法封闭与抗体孵育用5-10%正常血清（与二抗来源物种相同）或3%BSA封闭非特异性结合位点（室温30分钟）加入适当稀释的一抗（通常1:50-1:500），4°C孵育过夜或室温1-2小时PBS洗涤3×5分钟后，加入HRP或荧光标记的二抗（通常1:200-1:1000），室温孵育30-60分钟，再次PBS洗涤信号检测与分析对于HRP标记系统，加入DAB或AEC底物显色5-10分钟，显微镜下控制反应时间苏木精复染细胞核（1-3分钟），梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片结果分析可根据染色强度和阳性细胞比例进行半定量评分，如0分（阴性），1+（弱阳性），2+（中度阳性），3+（强阳性）免疫荧光技术免疫荧光原理免疫荧光技术利用荧光团标记的抗体特异性结合靶抗原，在特定波长激发光照射下发射荧光信号与传统免疫组化相比，荧光信号对比度高，分辨率好，可实现多重标记，观察不同蛋白共定位情况，是蛋白定位研究的强大工具抗体选择一级抗体应具备高特异性和适当效价，选择时需考虑来源物种与样本的兼容性二级抗体应特异性识别一抗的种属，并携带适当荧光团，避免与其他一抗交叉反应多重标记时，不同二抗的荧光发射光谱应有足够区分，一抗来源应不同荧光染料特性FITC（绿色，Ex495nm/Em519nm）是常用荧光染料，操作简便但易淬灭；TRITC（红色，Ex547nm/Em572nm）稳定性较好；Alexa系列染料（如Alexa

488、Alexa594）光稳定性高，荧光强度大；DAPI（蓝色，Ex358nm/Em461nm）是常用核染料，特异性结合DNA显微技术荧光显微镜配备不同波长激发光和滤光片组，用于观察不同荧光信号共聚焦显微镜通过点扫描和针孔光阑消除非焦平面信号，提供高分辨三维图像超分辨显微技术如STORM、PALM可突破衍射极限，提供纳米级分辨率，观察蛋白精细分布技术原理与应用ELISA高通量96孔板格式适合大量样品同时检测高灵敏度酶促放大系统可检测pg级别的蛋白质高特异性抗原-抗体特异性结合确保检测准确性多样应用适用于血清学诊断、蛋白质定量等多种场景ELISA（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原-抗体特异性反应和酶催化显色的定量检测技术根据操作方式分为三种主要类型直接法最简单，抗原直接吸附于板表面，用酶标记抗体检测，但特异性和灵敏度较低；间接法先吸附抗原，加入一抗后再用酶标记二抗检测，灵敏度高但背景可能较高；夹心法（双抗体夹心法）最常用，先包被捕获抗体，加入样品后再用酶标记检测抗体检测，特异性和灵敏度最高标准曲线建立是ELISA定量的关键使用已知浓度的标准品（通常5-8个浓度点，覆盖线性范围），与样品同板检测，绘制吸光度与浓度对数的标准曲线，据此计算样品浓度检测灵敏度受抗体亲和力、酶标记效率和底物性质影响，可通过优化抗体浓度、孵育时间和温度提高；特异性则取决于抗体质量和适当的封闭处理，减少非特异性结合实验步骤ELISA包被与封闭夹心ELISA首先在微孔板上包被捕获抗体（通常2-10μg/mL），4°C孵育过夜或37°C孵育2小时PBS-T（含

0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次后，加入封闭液（5%脱脂奶粉或1-3%BSA），室温孵育1-2小时，封闭未结合位点，防止非特异性结合封闭不充分会导致背景高，过度封闭可能掩盖抗原表位样品与抗体孵育加入适当稀释的样品（通常在封闭液中稀释），室温孵育1-2小时或4°C过夜彻底洗涤后（PBS-T，3-5次），加入酶标记检测抗体（直接法）或非标记一抗（间接法），室温孵育1-2小时若使用间接法，再次洗涤后，加入酶标记二抗（通常HRP或AP标记），室温孵育

0.5-1小时样品和抗体浓度需通过预实验优化，确保信号强度与抗原量成正比显色与终止充分洗涤后加入酶底物溶液，对于HRP常用TMB或OPD，AP常用pNPP室温避光孵育适当时间（通常5-30分钟），观察颜色变化当最高浓度标准品显色适中（不过深）时，加入终止液（HRP使用2M H₂SO₄，AP使用3M NaOH）终止后颜色应稳定，便于后续读板底物-酶反应时间是影响灵敏度和线性范围的关键因素基因敲除技术原理同源重组原理系统设计与验证CRISPR-Cas9gRNA传统基因敲除技术基于同源重组原理，CRISPR-Cas9技术源自细菌的获得性免理想的gRNA应靶向基因的早期外显子或利用DNA修复机制将含有相同序列的外疫系统，由两个关键组分组成Cas9核功能域，增加功能丧失的可能性设计源DNA整合到基因组特定位置这种方酸酶和引导RNA（gRNA）gRNA包含时需避免脱靶效应，选择特异性高的靶法需要构建含有靶基因两侧同源臂的载一个与靶序列互补的20个核苷酸区域，点，20nt序列前需有PAM位点体，中间插入选择标记（如抗性基因或引导Cas9蛋白精确结合并切割目标DNA（NGG）软件如CHOPCHOP、荧光蛋白）位点，形成双链断裂CRISPR Design等可辅助gRNA设计，提供脱靶预测同源重组在哺乳动物细胞中自发效率极DNA修复时，非同源末端连接（NHEJ）低（约10⁻⁶），需要筛选大量细胞克机制可能引入插入或缺失突变敲除效率验证方法包括T7E1酶切分析隆，工作量巨大虽然可通过引入双链（indels），导致移码突变和提前终检测杂合DNA；Surveyor核酸酶检测错断裂提高效率，但整体操作仍然繁琐，止，实现基因敲除与传统方法相比，配；高分辨率熔解曲线分析；直接测序限制了其广泛应用CRISPR-Cas9系统简单高效，可同时靶确认突变蛋白水平可通过Western向多个基因，已成为基因编辑首选技blot验证表达丧失，功能水平则需进行术相应的功能测试实验设计CRISPR-Cas9靶点选择设计gRNA选择基因早期外显子或功能域关键区域，确保突变使用设计工具选择特异性高、脱靶少且效率高的导致功能丧失20nt引导序列载体构建细胞转染将gRNA序列克隆至表达载体，同时表达Cas9和转染靶细胞，筛选阳性细胞并验证基因敲除效果3gRNACRISPR-Cas9实验设计的首要步骤是选择合适靶点通过生物信息学分析，确定靶基因结构，优先选择位于早期编码区、共有外显子或关键功能域的靶点gRNA设计时，应确保其5端与PAM序列（NGG）相邻，GC含量40-60%，避免4个以上连续相同碱基，降低脱靶风险对于重要靶点，设计2-3个gRNA提高成功率将设计好的gRNA通过退火和连接克隆至表达载体（如pSpCas9BB-2A-GFP允许同时筛选转染细胞）根据细胞类型选择适合的转染方法（脂质体、电转化或病毒转导），同时考虑表达形式（瞬时或稳定表达）转染后48-72小时收集细胞，通过FACS分选GFP阳性细胞或应用抗生素筛选单克隆扩增后提取基因组DNA，通过T7E1酶切、Sanger测序或NGS确认编辑效果，最后进行蛋白表达和功能验证，确认基因敲除效果细胞培养基础技术无菌操作培养基组成细胞传代与保存细胞计数与活力细胞培养最基本的要求是严格常用培养基包括DMEM、贴壁细胞达70-90%汇合度时精确计数对实验重现性至关重无菌操作所有操作应在超净RPMI-

1640、MEM等，基础需传代先用PBS洗涤去除血要血球计数板法是常用方工作台中进行，工作前紫外灯培养基需添加血清5-20%清，用胰蛋白酶-EDTA消化3-5法细胞悬液与

0.4%台盼蓝等照射30分钟灭菌，使用75%酒FBS提供生长因子和粘附蛋分钟使细胞脱落，加入含血清体积混合（活细胞不着色，死精擦拭所有进入工作台的物白，1%抗生素抗菌素预防污培养基终止消化，1:3至1:10比细胞着蓝色），加入血球计数品操作者应穿戴实验服和手染，1%谷氨酰胺提供额外能例接种新培养瓶长期保存采板，计数四个角方格内细胞套，避免说话和快速移动培源某些特殊细胞需添加特定用冻存法使用10%DMSO作数，取平均值乘以稀释倍数和养试剂打开前应喷洒酒精消生长因子或激素完全培养基冻存保护剂，缓慢降温至-10⁴得到每毫升细胞数活力毒，保持无菌操作链不中断应4°C保存，使用前预热至80°C后转入液氮，可保存数=活细胞数/总细胞37°C防止温度休克年数×100%，应保持在95%以上细胞转染技术脂质体转染脂质体转染是最常用的化学转染方法，基于阳离子脂质与DNA形成复合物，通过与细胞膜融合导入细胞的原理常用试剂包括Lipofectamine系列、FuGENE等优点是操作简便，适用范围广，转染效率中等至高；缺点是对某些原代细胞毒性较大，成本较高影响脂质体转染效率的因素包括细胞密度（通常60-80%融合度最佳）、DNA质量、脂质体与DNA比例及培养基条件等电穿孔法电穿孔法通过短暂电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔隙，使DNA进入细胞质这种方法对难转染细胞（如原代细胞、淋巴细胞）特别有效关键参数包括电场强度、脉冲持续时间和脉冲次数，需针对不同细胞类型优化优点是转染效率高，可转染大分子和多种核酸类型；缺点是设备成本高，可能导致较高细胞死亡率，需要大量细胞病毒转导系统病毒转导利用病毒感染机制将基因导入细胞，常用系统包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒慢病毒可整合入基因组实现稳定表达，适合长期研究；腺病毒不整合基因组，表达暂时但效率高；AAV（腺相关病毒）安全性高，可在体内使用病毒转导效率最高，可接近100%，但制备复杂，安全要求高，需专门的生物安全设施转染效率检测转染效率评估常用方法包括荧光报告基因（如GFP、RFP）直观观察，可通过流式细胞术精确定量；荧光素酶报告系统测定酶活性，灵敏度高；Western blot或RT-qPCR检测目的基因表达水平高效转染通常表现为30-90%的阳性率，取决于细胞类型和转染方法优化转染方案应系统测试细胞密度、核酸量、试剂比例等因素报告基因技术流式细胞技术原理流体动力学聚焦荧光信号检测数据处理与分析流式细胞仪通过流体动力学聚焦原理使细当标记荧光染料的细胞通过激光束时，染流式细胞分析软件将光电信号转换为数字胞呈单列通过检测区域样品被注入快速料被特定波长激光激发产生荧光散射光数据，通过点图、直方图和等高线图直观流动的鞘液中，形成层流，使细胞一个接和荧光信号通过透镜系统和光学滤光片分展示分析通常采用门控策略，先根据一个通过激光束，实现单细胞分析这种离，由不同光电倍增管检测前向散射光FSC/SSC特征框选目标细胞群，再分析该设计确保每次只有一个细胞被激光照射，FSC反映细胞大小，侧向散射光SSC反群体内特定标记的表达情况多参数分析是高通量单细胞分析的基础映细胞内部复杂度，荧光信号则提供特定可同时检测多达18个参数，全面表征细胞分子标记信息亚群流式细胞分选实验流式细胞分选FACS是流式技术的扩展应用，能根据细胞特性将不同细胞群分离分选原理基于带电液滴系统细胞流经分析区后，流体被振动器精确分割成含单个细胞的液滴，并根据分析结果赋予不同电荷，通过电场偏转收集到相应管中单参数分选策略简单直接，如根据GFP表达将细胞分为阳性和阴性；多参数分选则可同时考虑多个标记，如CD4+/CD8-和CD4-/CD8+T细胞亚群的分离分选前需设置合理的门限值，通常基于未标记对照、单染色控制和荧光减色控制理想的分选速度在5,000-20,000个细胞/秒，过快会影响纯度，过慢则降低效率分选纯度通常可达95%以上，可通过二次分选进一步提高常见问题包括样品堵塞（应充分过滤样品）、压力不稳（检查系统气压）和液滴形成不良（调整振动器参数）分选后细胞可直接用于培养、核酸提取或功能实验，但需注意分选过程可能影响细胞活力生物信息学分析工具序列比对工具引物设计软件BLAST（Basic LocalAlignment SearchTool）是最常用的序列相似性搜Primer Premier是综合性引物设计软件，考虑长度、GC含量、Tm值、二级索工具，可在基因组数据库中快速查找同源序列不同BLAST变体适用于不结构等参数；Primer3开源免费，提供网页界面和本地版本，可设置多种约同需求BLASTn用于核酸序列比对，BLASTp用于蛋白质序列比对，束条件；Primer-BLAST结合引物设计和特异性检查，能评估引物可能产生BLASTx将核酸序列翻译后与蛋白质数据库比对多序列比对工具如的非特异性扩增理想引物设计应避免二聚体、发夹结构，避开SNP位点，ClustalW、MUSCLE可同时比对多个序列，展示保守区域，适合进化分析和跨越内含子（可能时）以区分基因组DNA污染引物设计蛋白质分析工具数据库资源蛋白质结构预测工具如SWISS-MODEL、Phyre2通过同源建模预测三维结NCBI提供GenBank核酸数据库、PubMed文献库和多种分析工具；构；ProtParam分析蛋白理化性质如分子量、等电点和氨基酸组成；Ensembl专注真核生物基因组注释；UniProt整合蛋白质序列和功能信息，PSIPRED预测二级结构；TMHMM和SignalP分别预测跨膜区和信号肽这分为SwissProt（人工审核）和TrEMBL（自动注释）；PDB提供蛋白质三维些工具帮助理解蛋白功能和设计实验策略，如确定功能域边界、预测抗原表结构数据有效利用这些资源需掌握检索技巧，如使用布尔运算符、限制特位、评估可溶性等定字段、利用MeSH主题词等，提高数据挖掘效率实验数据分析与统计分子生物学实验总结1核酸研究技术从最基础的DNA/RNA提取到PCR扩增、电泳分析，再到克隆表达和测序分析，这些技术形成完整的核酸研究体系，是分子生物学的中心支柱熟练掌握这些技术对其他所有分子生物学实验的成功至关重要2蛋白质研究方法蛋白质表达、纯化、电泳分析和免疫检测等技术，使研究者能从多个层面理解蛋白质的结构与功能这些方法与核酸技术相结合，可实现从基因到蛋白的完整研究路径，揭示生命活动的分子机制基因编辑与细胞技术CRISPR-Cas9等新型基因编辑工具，结合细胞培养和转染技术，使精确改造生物体基因组成为可能这些前沿技术正推动基础研究向临床应用转化，为精准医疗和基因治疗开辟新途径技术发展趋势分子生物学技术正向高通量、自动化、微型化和集成化方向发展单细胞测序、空间转录组学等新技术不断涌现，基因编辑工具不断优化，生物信息学分析方法日益复杂，共同推动生命科学研究进入新纪元。