《分子生物学方法》课件

分子生物学方法欢迎来到《分子生物学方法》课程本课程专为高等院校生物学相关专业的学生设计，旨在系统介绍现代分子生物学领域的主流实验技术与方法通过本课程，您将全面了解从基础的提取到前沿的基因编辑技DNA/RNA术，掌握分子生物学研究中的核心操作技能与理论基础我们将深入探讨各种技术原理，实验设计思路以及结果分析方法，帮助您建立完整的分子生物学方法体系认知分子生物学简介定义与研究内容发展历程方法学意义分子生物学是研究生物分子（主要是自世纪中叶开始，分子生物学经历分子生物学方法不仅是生命科学研究

20、和蛋白质）结构与功能的学了爆炸性发展从双螺旋结构的的基础工具，也广泛应用于医学诊断、DNA RNA DNA科，探究生命过程的分子机制它聚发现到基因组测序，分子生物学不断农业育种、环境保护等领域，成为现焦于基因的结构、表达及其调控过程，革新我们对生命本质的理解，并提供代生物技术产业的核心支撑揭示生命现象背后的分子基础了操纵生命过程的工具分子生物学的发展历史1年1953沃森和克里克发现双螺旋结构，奠定了分子生物学的基DNA础这一发现揭示了遗传信息存储的分子机制，被认为是生物学史上最重要的突破之一2年1973科恩和博耶尔成功实现了首次基因重组技术应用，标志着基因工程时代的开始这项技术使得科学家能够人为操控基因，创造新的组合DNA3世纪初21高通量组学技术兴起，特别是下一代测序（）技术的出NGS现，极大地加速了基因组、转录组等研究，推动了精准医学和个性化治疗的发展分子生物学研究领域基因结构与功能探索序列特征与生物功能关联DNA蛋白质表达与调控2研究蛋白质合成、修饰及活性控制遗传信息传递与调节揭示细胞内信息流动与调控网络分子生物学通过研究基因的结构特征、功能预测和实验验证，建立序列与生物特性间的关联在蛋白质层面，研究其表达DNA量、修饰状态及相互作用，理解细胞活动的分子机制同时，揭示从到再到蛋白质的遗传信息传递过程，以及复杂的DNA RNA基因表达调控网络绪论小结分子生物学的核心理念主要研究方向围绕中心法则（DNA→RNA→以分子水平理解生命现象，蛋白质）展开研究，包括揭示基因与表型的关系，基因组结构与变异、表达建立微观机制与宏观表现调控、蛋白功能与互作、的联系通过操控生物分信号传导等多个层面的探子实现对生命过程的干预索和应用方法体系更新从传统生化技术到高通量组学分析，分子生物学方法不断革新，计算分析日益重要，多学科交叉趋势明显分子生物学方法总览水平方法水平方法DNA RNA提取与纯化提取与质量控制•DNA•RNA与基因扩增与基因表达分析•PCR•RT-PCR1测序与基因克隆转录组测序•DNA•基因组编辑技术干扰技术••RNA蛋白质水平方法组学与信息学方法蛋白提取与分离•高通量数据分析•3检测•Western Blot基因功能注释•与免疫分析•ELISA生物信息学工具应用•蛋白相互作用研究•实验设计基础明确实验目的针对具体科学问题设计合理实验路径设置对照与重复确保实验结果可靠与统计学意义规范数据管理标准化采集与系统化分析保证结果可靠性良好的分子生物学实验设计需要基于明确的科学问题，设定合理的研究假设，并选择适当的技术路线实验中必须包含阴性和阳性对照，以及足够数量的生物学重复和技术重复，确保结果的可靠性和可重复性数据采集应遵循标准化流程，记录完整的实验参数后续分析需借助合适的统计方法，客观评价结果的显著性，避免过度解读数据良好的实验设计是获得可信结论的基础提取与纯化DNA细胞裂解使用裂解缓冲液破坏细胞膜和核膜，释放核酸蛋白酶处理蛋白酶K消化蛋白质，去除DNA结合蛋白有机溶剂提取酚-氯仿分离核酸与蛋白质乙醇沉淀浓缩并纯化DNA现代DNA提取通常采用商业试剂盒简化操作流程，如硅胶膜柱纯化法提取后需通过琼脂糖凝胶电泳检查完整性，分光光度计（OD260/OD280比值）评估纯度，确保DNA质量满足后续实验要求不同样本类型（如动植物组织、细菌、病毒等）需选择适合的提取方法测序方法概述DNASanger测序Illumina测序•基于链终止原理•基于合成测序原理•准确度高（

99.99%）•通量高，成本低•读长600-1000bp•读长50-300bp•适用于单基因/小片段分析•适用于全基因组分析三代测序•单分子实时测序•超长读长（10kb）•适用于基因组组装•错误率较高DNA测序技术已广泛应用于基因组测序、变异检测、转录组分析等领域现代生物学研究通常结合多种测序策略，如利用二代测序的高通量和三代测序的长读长优势，实现更全面准确的基因组分析分子克隆技术原理切割连接DNA DNA限制性内切酶在特定识别位点切割载连接酶催化载体与目的片段的T4DNA体和目的基因连接筛选克隆转化宿主通过抗性或蓝白斑筛选含有重组载体重组载体导入大肠杆菌等宿主细胞的阳性克隆分子克隆是将外源片段插入到克隆载体中，并在适当宿主细胞内扩增的技术这一过程依赖于分子酶工具（如限制性内切酶和DNA连接酶）的精确作用，以及宿主细胞的复制机制成功构建的重组体可用于基因功能研究、蛋白表达或基因治疗等多种应用DNA载体与宿主选择系列质粒载体大肠杆菌宿主pUC pGEM-T系列是常用的高拷贝克隆载体，含载体专为产物克隆设计，利大肠杆菌是最常用的克隆宿主，如、pUC pGEM-T PCRDH5α有多克隆位点、基因片段用于用末端转移酶加上的尾与载体上的尾等菌株这些菌株通常具有内切MCS lacZA TJM109蓝白斑筛选、氨苄青霉素抗性基因这互补配对该系统克隆效率高，操作简酶缺陷、重组修复缺陷等特性，有利于类载体体积小，复制效率高，在分子克便，特别适合产物的直接克隆，避外源的稳定存在培养条件简单，PCR DNA隆实验中使用广泛免了限制性内切酶消化步骤生长迅速，是分子克隆的理想宿主筛选阳性克隆蓝白斑筛选原理抗性标记筛选基于半乳糖苷酶基因（）的片段互补当外源插质粒载体通常携带抗生素抗性基因（如氨苄青霉素、卡那霉β-lacZαDNA入多克隆位点破坏基因时，转化菌落在含和的素等），使含有质粒的细胞能在含抗生素的培养基上生长lacZ X-gal IPTG平板上呈白色；未插入外源的菌落呈蓝色DNA蓝白斑筛选是分子克隆最常用的直观筛选方法，操作简便，此方法可筛选出含有载体的细胞，但无法区分是否含有目的可靠性高，适用于大多数常规克隆实验插入片段常与其他方法（如菌落、限制性酶切分析）PCR联合使用，以确认阳性克隆（聚合酶链式反应）原理PCR变性（Denaturation）在高温下，双链解旋为单链这一步破坏了链间的氢键，使模95°C DNA DNA板成为单链状态，为引物结合做准备通常需要秒至分钟DNA301退火（Annealing）温度降至，引物与互补模板链特异性结合温度选择取决于引物50-65°C长度和含量，是特异性的关键环节此步骤通常持续秒GC PCR20-40延伸（Extension）温度升至，耐热聚合酶（如酶）从引物端开始合成新72°C DNATaq3链延伸时间取决于目标片段长度，一般按每秒计算kb30-60技术通过上述三步循环，实现了目标片段的指数级扩增，具有高度特异PCR DNA性和灵敏度一般进行个循环，可将极微量扩增至可检测水平，是分子25-35DNA生物学最重要的基础技术之一方法优化与注意事项PCR退火温度优化引物设计原则污染防控退火温度过低会导致非特异性扩引物长度通常为，含对污染极为敏感应严格分18-25bp GCPCR增，过高则降低扩增效率理想量，避免互补序列形成二区操作（试剂准备、样品处理、40-60%温度通常比引物值低级结构，端应避免连续个以产物分析），使用滤芯吸头，设Tm3-5°C33可通过梯度确定最佳退火温上的或使用专业软件（如置阴性对照，必要时在反应体系PCR GC度，或使用策略）辅助设计，提中加入酶防止扩增产物污染touchdown PCRPrimer PremierUNG提高特异性高特异性（实时荧光定量）Real-time PCR PCR技术原理应用领域实时在传统基础上加入荧光检测系统，实时监测扩基因表达分析精确测量转录水平，评估基因表达变PCR PCRmRNA增过程中产物的累积常用的荧光体系包括（非化特别适合微量样品和大量样本的高通量分析SYBR Green特异性结合双链）和探针（序列特异性检测）DNA TaqMan病原体检测高灵敏度使其成为临床检测和疾病诊断的重要通过设定阈值线确定值（阈值循环数），根据值可定量手段，如新冠病毒核酸检测可实现病原体的定性和定量分Ct Ct分析目标序列的起始拷贝数绝对定量需构建标准曲线，相析对定量则采用方法计算相对表达量2^-ΔΔCt分型结合探针或熔解曲线分析，可检测单核苷酸多态SNP性，应用于个体化医疗和法医鉴定电泳技术DNA琼脂糖凝胶制备根据待分离片段大小选择合适浓度（）的琼脂糖凝胶浓度DNA

0.8%-2%越高，分辨率越高，适合分离小片段；浓度越低，适合分离大片段DNA凝胶中加入核酸染料（如溴化乙锭或）用于可视化DNA SYBRSafe分子量标准电泳时加入标准分子量，常用的有和阶梯，用于估DNA Marker100bp1kb算样品片段大小应选择与目标片段大小范围相符的类型，以DNA Marker获得准确的大小判断成像与分析电泳完成后，使用紫外凝胶成像系统或蓝光成像系统观察并记录结果现代系统通常配备分析软件，可对条带强度进行定量分析，评估浓度DNA和纯度核酸杂交技术简介核酸杂交是利用互补碱基配对原理，使标记的核酸探针与目标核酸序列特异性结合的技术雀巢系列杂交包括（检Southern测）、（检测）和（检测蛋白质，非核酸杂交）DNA NorthernRNA Western探针设计是杂交技术的关键，可选择基因特异区域，长度通常为常用标记方式包括放射性同位素（）、非放100-1000bp32P射性标记（地高辛、生物素）及荧光标记杂交条件（温度、盐浓度）严格控制可确保特异性结合，而信号检测方法取决于探针标记类型杂交SouthernDNA酶切限制性内切酶消化基因组DNA凝胶电泳分离不同大小的DNA片段转膜DNA片段从凝胶转移到尼龙膜探针杂交标记探针与互补目标序列结合信号检测放射自显影或化学发光检测杂交信号Southern杂交由英国生物学家Edwin Southern于1975年发明，是检测特定DNA序列的经典方法它能够确定目标序列在基因组中的存在、拷贝数和大小，广泛应用于基因分析、转基因检测和RFLP（限制性片段长度多态性）分析现代研究中，Southern杂交已部分被PCR和测序等更高效的方法取代，但在某些特殊应用（如大片段重排和拷贝数分析）中仍具独特优势杂交NorthernRNA样品制备提取总RNA或富集mRNA变性电泳甲醛变性条件下分离RNA转膜与固定RNA转移至尼龙膜并UV交联探针杂交与检测标记的cDNA或RNA探针与靶mRNA结合Northern杂交是分析特定基因表达水平的经典方法，能同时提供mRNA大小和丰度信息相比RT-PCR，它能直接显示转录本的实际大小，有助于检测可变剪接和多转录本然而，灵敏度较低，需要较多起始材料现代研究中，Northern杂交已大部分被实时定量PCR和RNA-seq等技术取代，但在特定应用（如转录本大小分析和RNA修饰研究）中仍有价值该技术操作要点包括避免RNase污染、优化杂交条件和选择合适的内参基因进行标准化提取与纯化RNA酚/氯仿法试剂盒法•样品匀浆后加TRIzol裂解•硅胶膜柱吸附RNA•酚氯仿分离核酸与蛋白•缓冲液洗脱及纯化•异丙醇沉淀RNA•操作简便，污染少•乙醇洗涤并溶解•回收率高但成本较高•适用于高产量RNA提取•适合常规实验操作RNA质量评估•琼脂糖凝胶电泳检查•测定OD260/OD280比值•生物分析仪测RIN值•RIN7为高质量RNA•确保下游实验可靠性RNA提取是RNA研究的第一步，但RNA极易降解，操作过程中需特别注意使用无RNase环境、戴手套、使用DEPC处理的水、避免反复冻融样品不同组织（如脂肪、纤维或含多酚组织）可能需要特殊的提取方案，应根据样品特性选择合适的方法反转录（）PCR RT-PCRRNA提取反转录获取高质量总或逆转录酶将转化为RNA mRNA RNA cDNA产物分析4PCR扩增电泳检测或实时荧光定量特异引物扩增目标基因片段是研究基因表达的核心技术，将反转录为后进行扩增反转录引物选择影响结果针对，随机引物可转RT-PCR RNAcDNA PCRoligodT mRNA录所有，特异引物仅转录目标RNA RNA一步法在同一管中完成反转录和，操作简便但灵活性低；两步法分别进行两个反应，可保存用于多个反应定量RT-PCRPCRcDNA PCRRT-PCR需使用内参基因（如、）校正，确保结果准确反映基因表达变化GAPDHβ-actin基因芯片（）技术Microarray芯片制作原理基因芯片是在固相载体上按预定位置排列固定大量已知序列的DNA探针，形成高密度阵列制作方法包括原位合成法和点样法现代芯片可包含数万至数十万个基因探针，实现全基因组范围的分析杂交与检测样品RNA提取后反转录为cDNA并标记荧光染料（如Cy

3、Cy5）标记的cDNA与芯片杂交，洗脱非特异结合后，使用激光扫描仪检测每个点的荧光信号强度，反映相应基因的表达水平双通道芯片可同时比较两个样品的表达差异数据分析芯片数据分析流程包括背景校正、归一化、差异表达分析和功能富集分析常用统计方法如t检验、ANOVA等确定差异显著性结果通常以热图、火山图等可视化方式呈现，辅以GO、KEGG等功能注释分析，揭示基因表达模式的生物学意义二代测序（）技术NGS数百万单次读长数大规模并行测序技术一次可产生数百万至数十亿条序列读长

99.9%测序准确率现代NGS平台单碱基准确率高达

99.9%以上小时24测序时间从样品制备到数据获取，完整流程可在1-3天内完成级TB数据产出每次测序可产生数百GB至数TB的原始序列数据NGS技术代表了测序领域的革命性进步，通过大规模并行测序极大提高了测序通量，同时显著降低了测序成本主流平台包括Illumina（基于桥式PCR和可逆终止测序）、Ion Torrent（基于半导体测序）和BGI的DNBSEQ技术NGS已广泛应用于基因组测序、转录组分析（RNA-seq）、表观组学研究（如ChIP-seq、ATAC-seq）、宏基因组学以及临床诊断领域，极大推动了精准医学和个性化治疗的发展杂交芯片原理与应用DNA芯片设计与制备杂交与信号采集应用领域杂交芯片由大量寡核苷酸或样品经片段化、扩增和荧光标记芯片广泛应用于基因分型、检DNA cDNADNADNASNP探针按特定位置固定在载体表面构成后，与芯片上的探针进行杂交杂交测、拷贝数变异分析和微生物分子分探针设计需考虑长度（通常）、反应在严格控制的温度和盐浓度下进型等领域在分子病理学中，芯20-70nt DNA特异性和杂交效率，避免交叉反应行，确保结合特异性杂交后使用专片可用于肿瘤分子分类和预后评估现代芯片制备采用光刻技术或喷墨技用扫描仪读取荧光信号，信号强度反在微生物学中，可快速鉴定病原体种术实现高密度布点，单芯片可容纳数映样品中相应序列的丰度类和耐药基因谱现在，虽部分被十万个探针替代，但在特定筛查和诊断应用NGS中仍具成本优势基因表达谱分析基因编辑技术CRISPR工作原理CRISPR/Cas9系统由两个关键组分组成Cas9核酸酶和单链向导RNA（sgRNA）sgRNA通过碱基互补识别靶位点，引导Cas9蛋白在特定位置切割DNA双链此切割可激活细胞内的DNA修复机制，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因编辑sgRNA设计高效sgRNA设计需考虑靶序列上游PAM（原型邻近基序，通常为NGG）的存在，避免脱靶效应，确保高特异性现代设计使用在线工具（如CHOPCHOP、CRISPRDesign）预测脱靶位点并优化sgRNAsgRNA长度通常为20nt，结构包括识别序列和Cas9结合支架应用范围CRISPR技术实现了从单基因编辑到全基因组筛选的多层次应用应用领域包括基础研究中的基因功能验证、疾病模型构建；医学领域的遗传疾病基因治疗、抗病毒治疗；农业育种中的作物改良和抗性增强；以及合成生物学中的基因线路设计与调控与干扰（）siRNA RNARNAi导入siRNA合成siRNA或表达载体导入细胞RISC复合物形成siRNA与RNA诱导沉默复合物结合靶向识别引导RISC复合物识别互补mRNAmRNA降解切割靶mRNA或抑制其翻译RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默机制，通过小干扰RNA（siRNA）介导靶mRNA的降解siRNA是长度约21-23nt的双链RNA，可通过化学合成、体外酶切或载体表达获得转染方法包括脂质体转染、电穿孔和病毒载体介导等，需根据细胞类型优化条件RNAi广泛用于基因功能研究、药物靶点验证和疾病治疗研究基因沉默效率评估通常通过实时定量PCR和Western blot检测mRNA和蛋白水平变化设计多个siRNA靶向不同位点并包含阴性对照是重要的实验策略，以确认表型变化确实来自目标基因的特异性沉默蛋白质提取与定量样品制备组织样品需液氮研磨或匀浆器处理；细胞样品经收集、洗涤后直接裂解所有操作应在低温环境下进行，减少蛋白质降解根据后续应用选择合适的裂解方法，如超声波细胞破碎适用于提取包含膜蛋白的全蛋白裂解缓冲液选择常用缓冲液（含或等去垢剂）提取大多数可溶性蛋白RIPA NP-40Triton X-100不同实验目的需调整缓冲液组分分析磷酸化蛋白需加入磷酸酶抑制剂；研究蛋白质相互作用则选择温和裂解液保持复合物完整性裂解液中必须添加蛋白酶抑制剂混合物防止降解蛋白质定量法和法是常用的蛋白质定量方法法基于生物素辅酶BCA BradfordBCA A与铜离子反应产生紫色产物，兼容大多数去垢剂；法基于考马Bradford斯亮蓝与蛋白质结合导致吸收峰变化，操作简便但受去垢剂干扰G-250两种方法均需构建标准曲线，确保准确定量BSA电泳SDS-PAGE原理操作流程（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）利用蛋样品制备蛋白质样品与上样缓冲液混合，加SDS-PAGE-SDS95-100°C白质复合物在电场中按分子量大小分离的技术使热分钟变性处理上样缓冲液通常含溴酚蓝指示电泳进程-SDS SDS5蛋白质变性并赋予均一负电荷，使迁移速率主要取决于蛋白质分子量巯基乙醇打破二硫键，进一步确保蛋白质完全β-电泳先低电压（）使样品通过浓缩胶，再提高电压80V变性（）进行分离同时上样分子量标准物判断目标蛋120-150V凝胶由浓缩胶和分离胶组成，浓缩胶，聚丙烯酰胺浓白大小pH

6.8度低，使蛋白质样品浓缩成窄带；分离胶，聚丙烯酰pH

8.8染色考马斯亮蓝是常用染色剂，灵敏度约；R-

2500.1-1μg胺浓度高（一般），实现蛋白质分离小分子量蛋白8-15%银染法灵敏度更高（），但操作繁琐；荧光染料（如1-10ng分析选用高浓度凝胶，大分子量蛋白则选低浓度凝胶）兼具高灵敏度和宽线性范围SYPRO Ruby（免疫印迹）Western BlotSDS-PAGE分离按分子量分离蛋白质混合物转膜蛋白质从凝胶转移至PVDF或硝酸纤维素膜封闭牛奶或BSA封闭非特异结合位点抗体孵育一抗特异识别，二抗带酶或荧光标记信号检测化学发光或荧光成像显示特异性条带Western Blot是检测特定蛋白质表达的金标准技术，结合电泳分离与免疫学检测的优势转膜方式包括半干转（快速但效率较低，适合小分子量蛋白）和湿转（转移效率高，适合大分子量蛋白）转膜缓冲液通常含甲醇提高膜对蛋白的亲和力定量分析需使用内参蛋白（如β-actin、GAPDH）校正样品间差异，通过灰度分析软件计算目标蛋白与内参比值抗体稀释比例、孵育时间和洗涤条件是影响结果特异性和信噪比的关键因素，应针对不同抗体优化条件免疫共沉淀（）Co-IP原理实验流程应用与变式免疫共沉淀是研究蛋白质相互作用的经典方关键步骤包括选择保持蛋白质相互作用的广泛应用于验证蛋白质间相互作用、鉴Co-IP法，基于抗体对特定蛋白质的特异性识别温和裂解条件；使用高特异性抗体避免非特定多蛋白复合物组分、研究动态相互作用变使用靶蛋白抗体和蛋白磁珠或琼脂糖珠，异沉淀；设置适当的阴性对照（如同型化等其变种包括反向免疫共沉淀（验证相A/G IgG从蛋白质混合物中捕获目标蛋白及其相互作或无关抗体）；优化洗涤条件平衡特异性与互作用的方向性）、串联免疫共沉淀（提高用伙伴，形成抗体靶蛋白结合蛋白复合灵敏度沉淀复合物可通过、质纯度）、染色质免疫共沉淀（，研究蛋--Western BlotChIP物谱分析或活性测定等方法进行分析白质与相互作用）和免疫共沉淀DNA RNA（，研究蛋白质与相互作用）RIP RNA技术ELISA包被封闭抗原或抗体包被于固相载体表面封闭非特异结合位点酶标记检测4特异结合酶标记抗体识别并催化底物显色样品中目标分子与包被物特异结合ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay，酶联免疫吸附测定）是一种高特异性、高灵敏度的蛋白质检测技术主要类型包括直接法（抗原直接包被、酶标抗体检测）、间接法（抗原包被、一抗识别、酶标二抗检测）、夹心法（抗体包被捕获抗原、另一酶标抗体检测）和竞争法（样品抗原与标记抗原竞争有限抗体结合位点）夹心ELISA特异性最高，适用于复杂样品中目标蛋白的定量分析关键操作包括抗体对的优化选择、标准曲线制作、严格控制温度和时间等现代ELISA采用96孔或384孔微孔板格式，结合自动化操作系统，实现高通量筛选和精准定量荧光定量蛋白测定荧光标记抗体法流式细胞术检测•抗体直接标记荧光团•单细胞水平蛋白分析•免除酶催化步骤•多参数同时测定•多色标记可同时检测•快速分析大量细胞•适合活细胞成像•可分选特定细胞群体•常用荧光团有FITC、PE等•应用于免疫表型分析荧光显微镜技术•直观观察蛋白定位•研究亚细胞结构•可进行活细胞动态观察•超分辨率技术突破衍射极限•结合定量图像分析软件荧光定量蛋白测定技术结合了荧光标记的高灵敏度和免疫学检测的高特异性，广泛应用于细胞生物学和分子生物学研究相比传统的生化方法，荧光技术具有更高的灵敏度、更好的时空分辨率和多色检测的优势，能够实现活细胞中蛋白质的动态观察新型荧光蛋白标记技术包括荧光蛋白标签（如GFP、mCherry等）基因融合表达、SNAP-tag和HaloTag等自标记蛋白技术，以及近年发展的纳米抗体标记系统，为蛋白质定位和互作研究提供了强大工具细胞转染技术细胞转染是将外源核酸（或）导入真核细胞的过程，是基因功能研究和蛋白表达的基础技术主要转染方法包括化学法（如DNA RNA磷酸钙沉淀法、葡聚糖法）、脂质体法（利用阳离子脂质与核酸形成复合物）、物理法（如电穿孔、基因枪）和病毒介导法（如DEAE-慢病毒、腺病毒系统）稳定转染和瞬时转染是两种不同策略瞬时转染外源基因不整合入基因组，表达水平高但持续时间短（天），适合快速筛选；稳定2-7转染外源基因整合入基因组，表达水平较低但持续稳定，需经抗性标记筛选，适合长期研究转染效率受细胞类型、转染试剂、核酸质量和细胞状态等多因素影响，应针对特定细胞系优化条件原位杂交与定位原位杂交原理荧光原位杂交RNA原位杂交（）是在组织切片或细胞中直接检测特定荧光原位杂交（）是的重要变种，使用荧光标记探RNA ISHFISH ISH分子的技术，基于核酸探针与目标序列的互补配对针直接可视化细胞或组织中的特定核酸序列技术发展RNARNAFISH探针可标记放射性同位素、荧光染料或地高辛等非放射性标出多种高级应用，如多色（同时检测多个靶序列）、FISH记物组织样品需经固定（保持完整性和细胞形态）、（拉伸纤维上进行超高分辨率杂交）和RNA Fiber-FISH DNA透化（增加探针可及性）和杂交（严格控温和盐浓度确保特（染色体异常分析）等技术在染色体异常ChromoFISH FISH异性）等处理步骤诊断、病原体检测和基因表达空间分析中发挥重要作用原位杂交技术独特优势在于可保留组织结构和细胞形态，实现或在原位的精确定位近年发展的和RNADNARNAscope等技术大幅提高了灵敏度和特异性，可检测低丰度转录本单分子技术甚至可实现单分子水平的BaseScopeTM FISHsmFISH可视化，为基因表达异质性研究提供了强大工具RNA基因组编辑的分子检测方法T7E1酶切分析测序分析方法数字PCR技术核酸内切酶识别并切割错配测序可检测主要突变类型，但数字将样品分为数千至数百T7I DNASanger PCRdPCR扩增靶区域，变性再退火形成杂合混合信号难以准确量化；新一代测序万个独立反应，每个反应只含有或PCR01双链，酶切错配位点，电泳检测提供高通量定量分析，精确测定个模板分子，根据阳性反应比例进行T7E1NGS切割产物判断编辑效率简便快速但各类突变比例扩增子深度测序可检绝对定量该技术具有极高灵敏度和灵敏度有限，适合初筛，检测限约测低频突变（），是基因编辑效准确度，可检测的编辑效率，且1-1%

0.1%优点是操作简单、成本低，缺点率和脱靶效应评估的金标准近年发不需要标准曲线特别适合稀有突变2%是无法提供具体突变信息展的和等计算工具可从检测和精确定量分析，成为基因治疗TIDE ICESanger测序图谱中解析编辑效率安全性评估的重要工具分子标记与筛选SSR分子标记SNP分子标记分子标记辅助选择简单序列重复又称单核苷酸多态性是分子标记辅助选择SSR SNPMAS微卫星，是由个核苷序列中单个核苷酸变将分子标记与目标性状1-6DNA酸组成的串联重复序列异，是最丰富的变异紧密连锁，通过检测标DNA多态性来源于重复单类型检测方法包括记间接选择目标基因，SSR SNP元数量变异，通过扩芯片、高分辨率熔解曲大幅提高育种效率PCR MAS增后凝胶电泳分析线分析和测序标记可在早期幼苗阶段进行，SSR SNP标记共显性、多态性高、稳定性高、分布密度大，不受环境影响，特别适分布广泛，广泛应用于适合高密度遗传图谱构合隐性性状和数量性状遗传图谱构建、指纹图建和全基因组关联分析，的选择现代育种中，谱分析和品种鉴别在精准医学和分子育种基因组选择整合全基GS中应用广泛因组标记信息，进一步提高了选择准确性指纹分析DNA单细胞分子分析方法单细胞分离技术微流控、、显微操作等方法分离单个细胞FACS全基因组/转录组扩增、等技术扩增微量核酸MDA MALBAC高通量测序分析

3、等揭示单细胞异质性scRNA-seq scATAC-seq单细胞分子分析技术突破了传统混合细胞群体分析的局限，揭示了细胞间的遗传和表型异质性成功的单细胞分析关键在于高效细胞分离、微量核酸扩增和高灵敏度检测三个环节现代微流控技术可自动化处理数千个单细胞，大幅提高了效率单细胞转录组测序是目前应用最广的单细胞分析方法，已发展出多种技术平台如、、等除转录组scRNA-seq10x GenomicsSmart-seq Drop-seq外，单细胞基因组、表观组和蛋白组学方法也快速发展，多组学整合分析成为前沿趋势这些技术在肿瘤异质性研究、发育生物学和神经科学等领域产生了革命性影响生物信息分析在分子生物学中的应用转录组分析蛋白质组分析•差异表达分析•结构预测与模拟•可变剪接识别•功能域识别•非编码RNA分析•蛋白质互作网络基因组分析多组学数据整合•转录调控网络•翻译后修饰分析•序列组装与比对•多层次数据关联•基因预测与注释•调控网络重建•变异识别与分型•机器学习预测•结构变异分析•系统生物学建模234生物信息学已成为现代分子生物学研究的核心支撑常用分析平台包括商业软件（如CLC GenomicsWorkbench、Geneious）和开源工具（如BLAST、BWA、GATK、DESeq2等）重要数据库包括GenBank、Ensembl（基因组数据）、UniProt（蛋白质数据）和KEGG（代谢通路数据）等药物靶点分子筛选高通量药物筛选靶点功能验证建立特异性的靶点活性检测体系，如酶活性测候选靶点鉴定利用RNAi、反义寡核苷酸或CRISPR基因编辑等定、受体结合测定或细胞表型筛选利用自动通过组学数据挖掘、比较基因组学和文献调研技术抑制或敲除靶基因，观察对疾病相关表型化高通量筛选平台从化合物库中筛选活性分子等方法确定潜在药物靶点理想靶点应在疾病的影响体外细胞模型和体内动物模型均需验筛选结果经二次验证和构效关系分析，确定先中表达异常或功能改变，且在正常生理状态下证，确认靶点干预的有效性和安全性靶点验导化合物，进入药物优化阶段近年来基于结影响较小生物信息学分析可提供靶点优先级证通常结合多种分子生物学和生物化学方法，构的虚拟筛选也成为重要补充手段排序，筛选出最具潜力的候选分子全面评估其作用机制临床分子诊断技术无创产前筛查（）肿瘤分子分型NIPT基于母体外周血中存在的胎儿游离片段，采用高通肿瘤分子分型基于基因突变、表达谱或甲基化模式等分子特NIPT DNA量测序技术分析染色体异常该技术通过提取孕妇外周血浆征，将肿瘤分为不同亚型，指导个体化治疗常用技术包括中的游离，进行文库构建和高深度测序，分析染色体覆靶向测序（检测关键驱动基因突变）、基因表达芯片DNA NGS盖度偏差，可检测三体、三体等常见染色体非整倍体（转录组分型）和甲基化芯片（表观遗传分型）2118典型应用如乳腺癌的分子分型、肺癌的PAM50具有安全无创、准确率高（敏感性）的优势，已成突变检测、结直肠癌的微卫星不稳定性NIPT99%EGFR/ALK/ROS1MSI为临床一线产前筛查手段新一代技术已扩展到检测微测定等分子分型不仅辅助诊断和预后评估，更重要的是指NIPT缺失微重复综合征和单基因病，进一步提高了产前诊断的导靶向药物和免疫治疗的选择，是精准医疗的核心支撑技术/全面性分子生物学前沿技术20nm单分子成像分辨率超分辨率显微技术突破衍射极限，实现纳米级精度观察

0.1Da高分辨质谱精度现代质谱仪可精确测定分子量至小数点后多位100,000+蛋白组学覆盖度最新技术可在单次分析中鉴定上万种蛋白质分钟1实时分析速度新型传感器技术可实现生物分子动态实时监测单分子成像技术如PALM、STORM和STED显微镜打破了光学衍射极限，实现了纳米级分辨率，使观察亚细胞结构和单分子行为成为可能这些技术利用荧光分子的光物理特性，通过时间或空间上分离单个分子的荧光发射，重建超高分辨率图像高分辨质谱已成为蛋白组学的核心技术，最新仪器可同时提供高分辨率、高质量精度和高通量结合先进的分离技术（如多维色谱）和标记策略（如TMT标记），现代蛋白组学可深入研究蛋白质表达、翻译后修饰和相互作用网络，为系统生物学和精准医学提供强大支持分子生物学中的伦理与安全基因编辑伦理问题基因数据安全•人类胚胎基因编辑的伦理边界•个人基因组数据隐私保护•是否允许生殖系编辑传递给后代•基因歧视风险（就业、保险）•设计婴儿与优生学的忧虑•基因数据跨境流动管控•知情同意与公众参与决策•综合识别风险与去识别化•全球监管框架的不一致性•数据共享与保护的平衡生物安全考量•实验室生物安全分级制度•基因修饰生物环境释放风险•新发传染病研究的双重用途•合成生物学带来的未知风险•生物技术军民两用管控基因编辑技术尤其是CRISPR-Cas9的出现，使改变生物遗传密码变得前所未有地简单和精确，引发了严肃的伦理讨论2018年基因编辑婴儿事件后，国际社会加强了对人类胚胎基因编辑研究的监管目前科学界普遍认为，基础研究可在严格条件下进行，但临床应用特别是生殖系编辑尚需更审慎的讨论典型实验设计与案例分析基因功能研究案例通过CRISPR-Cas9技术构建基因敲除小鼠模型，研究特定基因在发育和疾病中的作用实验设计包括sgRNA设计、敲除效率验证、表型分析和分子机制研究结果显示该基因在神经发育中发挥关键作用，敲除导致特定行为异常和神经递质水平变化蛋白质互作研究案例结合免疫共沉淀、酵母双杂交和质谱分析，鉴定转录因子X的相互作用蛋白网络进一步通过体外结合实验和体内功能验证，确认关键互作蛋白Y调控转录因子X的活性实验揭示了一个全新的基因表达调控机制，为相关疾病治疗提供潜在靶点药物靶点验证案例针对新发现的肿瘤特异性代谢酶Z，设计RNAi和小分子抑制剂干预实验通过细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等多维度表型分析，结合代谢组学研究，确认Z酶抑制导致特定癌细胞能量代谢崩溃和细胞死亡，而对正常细胞影响较小，证实其作为抗癌靶点的价值实验室常规与注意事项标准操作流程SOP污染防控措施建立并严格执行标准操作流程，分子生物学实验易受污染影响，确保实验可重复性和数据可靠性特别是PCR和核酸扩增相关实验SOP应包括详细步骤、关键参数、应实行区域分隔（样品制备区、质量控制点和预期结果新方法PCR反应区、产物分析区），使用应经过充分验证并形成文档，所滤芯吸头，定期紫外照射或消毒有操作人员需经培训后方可独立工作台，设置阴性对照监测污染操作实验记录应详细、准确、RNA实验需特别注意RNase污染，及时，保持良好的可追溯性使用DEPC处理水和无RNase试剂，佩戴手套操作生物安全管理根据实验内容确定生物安全级别BSL，遵守相应防护措施使用致病微生物、人源样本或基因修饰生物体时，需遵循国家和机构生物安全规定危险废弃物（如含溴化乙锭凝胶、苯酚氯仿废液）需专门收集并按规定处理定期进行生物安全培训和应急演练，确保实验室安全运行新技术发展趋势合成生物学兴起自动化与高通量系统AI与智能分析系统合成生物学将工程学原理应用于生物系统，实验室自动化程度不断提高，机器人液体处人工智能和机器学习技术正深刻改变分子生旨在设计和构建具有新功能的生物元件、设理系统、自动化提取仪器和高通量筛选平台物学数据分析方式从蛋白质结构预测（如备和系统标准化生物元件库（如大幅提升实验效率微流控芯片技术实现了）到基因调控网络重建，算法展AlphaFold AI）、基因线路设计和全合成基因组微量样品处理和多步骤集成，大幅节省试剂现出强大能力自动化实验设计系统可根据BioBricks等技术快速发展，使从头设计生命成为可和时间这些自动化系统不仅提高了通量，前期结果自主调整实验参数，实现闭环优化能这一领域正推动生物制造、医疗诊断、也减少了人为误差，提升了数据一致性这些智能系统使复杂生物网络的理解和预测环境修复等方向的创新应用成为可能方法整合在科研与产业中的应用农业分子育种医学分子诊断分子标记辅助选择、基因组编辑和基因组选择液体活检、单细胞分析和多组学整合实现精准技术推动精准育种医疗环境监测与治理微生物工程环境DNA技术和工程微生物用于污染检测与修合成生物学与代谢工程创造高效生物催化剂复分子生物学方法在农业领域的整合应用极大提高了作物育种效率从基因组选择加速育种周期，到CRISPR技术精准改良作物性状，如抗病性增强、营养价值提高和环境适应性改善这些技术帮助育种家在面对气候变化和人口增长的背景下，创造更高产、更可持续的农作物品种在医学领域，分子诊断已从单一基因检测发展为多组学整合分析液体活检技术可通过简单血液采样检测循环肿瘤DNA，实现早期诊断和治疗监测单细胞技术揭示疾病异质性，指导精准治疗基因治疗和细胞治疗等前沿治疗手段也依赖先进分子生物学方法的支持复习与思考核心方法掌握1巩固蛋白质分析基础技术DNA/RNA/方法整合能力学会结合多种技术解决复杂问题创新思维培养关注新技术并思考应用可能性分子生物学方法学习不应局限于技术操作层面，更重要的是理解每种方法的原理、优缺点和适用范围在实际研究中，往往需要多种方法相互验证和补充，形成完整的技术路线例如，研究基因功能可能需要结合基因编辑、表达分析、蛋白质互作和表型观察等多种手段当前分子生物学面临的重要挑战包括单细胞与亚细胞水平的精准分析、时空动态变化的实时监测、多组学数据的整合解释、以及从分子机制到生物学意义的跨尺度理解这些挑战也代表着未来方法学创新的重要方向，需要交叉学科思维和新技术应用总结与展望本课程系统介绍了分子生物学的主要实验方法，从经典技术到前沿发展，构建了完整的方法体系认知这些技术不仅是生命科学研究的基础工具，也推动着医学、农业和环境科学等领域的创新发展分子生物学正处于快速发展期，技术革新层出不穷高通量、自动化、智能化是未来发展的主要方向跨学科融合（如与人工智能、纳米技术和材料科学的结合）将进一步扩展方法的边界我们期待这些技术进步能帮助解决全球面临的健康、粮食和环境挑战，推动人类福祉的提升。