《实验操作指南：培养基配制教程》课件

实验操作指南培养基配制教程本课程为微生物实验基础技能培训的重要组成部分，将系统介绍培养基配制的全过程与关键技术培养基作为微生物生长的人工营养基质，其配制质量直接影响微生物培养的成功与否通过本课程，学员将了解影响微生物培养结果的关键因素，掌握标准操作规范与质量控制要点，建立科学严谨的实验操作习惯本教程适合初学微生物学的学生以及需要提升实验技能的技术人员使用课程概述培养基基础知识与分类了解培养基的定义、作用及分类体系培养基配制流程与关键步骤掌握培养基配制的标准流程和技术要点常见培养基配方与应用场景学习各类培养基的特点及适用范围灭菌与质量控制方法掌握确保培养基质量的关键技术常见问题及解决方案学会识别和解决培养基配制中的常见问题培养基的定义与作用基本定义主要功能培养基是微生物生长的人工营养提供微生物生长所需的碳源、氮基质，为微生物提供生存所需的源、无机盐和生长因子等基本营各种营养物质和适宜的生长环养成分，支持微生物的新陈代谢境它通过模拟微生物在自然环和繁殖，是微生物能否成功培养境中的生长条件，满足其生命活的关键因素动的需求应用价值作为检测、分离和培养微生物的基础工具，培养基在微生物学研究、疾病诊断、药物筛选、食品安全检测等领域有着广泛应用，是微生物学研究与应用的重要工具培养基的基本组成碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等碳水化合物，为微生物提供能量和碳骨架，是构成细胞物质的基本成分不同微生物对碳源的利用能力各异氮源蛋白胨、酵母提取物、肉汤等含氮有机物，为微生物提供氨基酸和蛋白质合成所需的氮元素，支持细胞结构的形成无机盐与生长因子、、、、、等无机离子以及维生素、氨基Na+K+Mg2+Ca2+Cl-PO43-酸、核苷酸等生长因子，参与细胞代谢调节和酶的活化，保证微生物正常生长固化剂琼脂、明胶等聚合物，用于制备固体或半固体培养基，为微生物提供固定的生长环境，便于菌落形成和观察培养基的分类

（一）按物理状态液体培养基半固体培养基固体培养基不含固化剂的培养基，如肉汤、蛋白胨水含琼脂的培养基，具有一定含琼脂的培养基，完全凝固

0.5%~

0.7%

1.5%~

2.0%等适用于微生物的富集培养、发酵研究流动性主要用于微生物的运动性检测和成固态用于微生物的分离与纯化，便于和大量培养，便于观察浊度变化、沉淀形厌氧培养，可观察细菌的游动扩散模式和观察单个菌落的形态特征和计数，是微生成和菌膜生长等现象生长分布状况物分类鉴定的重要基础培养基的分类

（二）按化学成分合成培养基由成分明确的化学物质配制而成半合成培养基部分成分为复杂有机物天然培养基以天然物质为主要成分配制而成合成培养基成分明确，具有良好的重复性和可控性，适合代谢研究和生化实验，但营养价值有限半合成培养基兼具成分可控和营养丰富的优点，被广泛应用于实验室常规培养天然培养基营养全面但成分复杂不确定，主要用于特殊微生物的培养和临床诊断培养基的分类

（三）按用途通用培养基选择性培养基适合多种微生物生长的培养基含有抑制特定微生物的成分计数培养基鉴别培养基用于微生物的定量检测可区分不同微生物的代谢特性通用培养基如营养琼脂，适合大多数非苛养型微生物生长；选择性培养基通过添加抑制物质限制某些微生物生长，便于目标菌的分离；鉴别培养基含特殊成分可显示微生物的生化特性，帮助鉴定；计数培养基则专用于微生物数量的精确测定，如平板计数琼脂培养基配制前准备工作环境准备个人防护器材准备实验室环境清洁与消毒，穿着实验服，佩戴一次性玻璃器皿清洁与干燥，确使用酒精擦拭工作台手套和口罩，长发应束保无洗涤剂残留，必要时75%面，必要时使用紫外灯照起，避免携带个人物品进进行灭菌处理；精密天平射分钟进行空气消毒，入操作区，减少交叉污染和计校准，确保测量准30pH降低污染风险可能性确性材料准备试剂和材料提前准备并检查质量，确认有效期，避免使用变质或过期材料；计算所需试剂量，准备适量去离子水培养基配制的基本流程配方计算与材料准备根据所需培养基类型和体积，计算各组分用量，确保材料充足且质量合格称量各组分使用校准的精密天平准确称量各成分，避免交叉污染溶解与混合加入适量水，使用磁力搅拌器充分溶解所有成分，必要时加热促进溶解pH调节与测定使用pH计测量并用酸碱溶液调节至目标pH值，通常为

6.8-

7.2分装将配制好的培养基分装至预先准备的容器中，避免污染灭菌通常采用121℃高压蒸汽灭菌15-20分钟，特殊成分可采用过滤除菌质量检查与储存检查灭菌后培养基外观，确认无污染后适当储存培养基配制的常用工具配制培养基需要使用多种专业仪器设备精密天平（±

0.01g）用于准确称量各组分；pH计测量和调整培养基酸碱度；磁力搅拌器帮助均匀溶解成分；水浴锅或电炉提供加热条件；高压蒸汽灭菌锅进行灭菌处理；移液器用于添加少量液体试剂；分装器具则用于培养基的定量分装这些工具的正确使用和维护是确保培养基质量的重要条件玻璃器皿的准备与标记清洁与干燥使用专用洗涤剂彻底清洗玻璃器皿，用清水充分冲洗，确保无洗涤剂残留，然后在烘箱中干燥或自然晾干容器必须清洁干燥，以避免污60℃染和稀释效应标签制作与粘贴准备标签，使用铅笔（而非水笔或记号笔）书写培养基名称、班级、组别和配制日期等信息铅笔书写的优势在于高温灭菌时字迹不会模糊标签应粘贴在离管口管身处的位置1/3分类存放与防污染按用途分类放置器皿，避免交叉污染对于需要灭菌的器皿，可以提前包装并灭菌处理使用过程中应避免触碰器皿内部和口部，保持无菌状态常用培养基配制

（一）LB组分用量（）功能1L胰蛋白胨（）提供氨基酸和小肽Tryptone10g酵母提取物（提供维生素和微量元素Yeast5g）Extract氯化钠（）调节渗透压NaCl10g琼脂（，固体培养作为固化剂Agar15g基需加）去离子水至溶剂1L（）培养基是微生物实验中最常用的通用培养基之一，适用于大多数LB Luria-Bertani非苛养型细菌的培养，特别是大肠杆菌等模式微生物其组成简单，制备方便，且成本较低，是分子生物学和微生物学实验室的基础培养基常用培养基配制

（二）LB称量与溶解准确称量胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，置于烧杯中，加入10g5g10g1L约去离子水，使用磁力搅拌器充分搅拌溶解800mlpH调节使用校准好的计测量培养基值，用或调节至pH pH1mol/L NaOHHCl，这是大多数细菌生长的最适范围

7.0±

0.2pH定容与加琼脂将培养基转移至量筒或容量瓶中，加去离子水至刻度线若需制备固体1L培养基，此时加入琼脂，轻轻搅拌均匀15g灭菌处理将培养基转移至适当容器，密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，灭菌121℃15-分钟灭菌后，液体培养基可直接冷却保存，固体培养基需在适当温度20下分装或铺板培养基配制NZYM培养基组成（1L）配制步骤胺准确称量各组分，置于烧杯•NZ10g•2L中氯化钠（）•NaCl5g加入约去离子水，充分硫酸镁七水（）•800ml•MgSO₄•7H₂O搅拌溶解2g调节至酵母提取物（）•pH

7.0-

7.5•Yeast Extract定容至5g•1L琼脂（固体培养基）高压灭菌分钟•15g•121℃15-20去离子水至•1L应用特点培养基富含镁离子，适用于噬菌体培养和提取胺提供丰富氮NZYM DNANZ源，镁离子有助于稳定核酸和某些蛋白质结构，促进酶活性该培养基常用于分子生物学实验中的噬菌体和质粒扩增培养基配制NZM培养基组成（）配制特点与应用NZM1L胺培养基的配制步骤与基本相同，包括称量、溶解、•NZ10g NZM NZYM调节、定容和灭菌等环节由于不含酵母提取物，该培养基氯化钠（）pH•NaCl5g提供的族维生素和生长因子较少，适用于一些对酵母提取物中B硫酸镁七水（）•MgSO₄•7H₂O2g某些成分敏感的微生物培养琼脂（固体培养基）•15g在某些特殊的分子生物学实验中，如特定噬菌体的增殖或某些重去离子水至•1L组蛋白的表达，培养基可能比表现出更好的效果，NZM NZYM培养基除不含酵母提取物外，其他成分与培养基相NZMNZYM需根据具体实验目的选择使用同这种配方变化使得培养基的营养来源更为单一，在特定应用中可能更有优势平板培养基配制LB/Amp/X-Gal/IPTG平板制备热敏成分添加充分混匀后，在无菌环境中向直径培养皿90mm基础培养基准备在无菌条件下，向冷却的培养基中加入以下热不中倾注培养基待培养基凝固后（约30-35ml按照LB培养基配方准备液体培养基，加入琼脂稳定物质氨苄青霉素（Amp）至终浓度15-20分钟），将平板倒置，避免水汽凝结在表15g/L（铺制平板）或7g/L（配制顶层琼脂）100μg/ml；X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-面标记平板信息并在4℃保存将培养基在121℃下高压灭菌15-20分钟，然后半乳糖苷）至终浓度40μg/ml；IPTG（异丙基-在水浴中冷却至50-60℃β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度

0.5mM该培养基广泛用于分子克隆中的蓝白斑筛选，可鉴别含有重组质粒的转化菌落含有插入片段的克隆通常表现为白色菌落，而自连接的空载体则表现为蓝色菌落培养基中的固化剂琼脂（Agar）琼脂糖（Agarose）明胶（Gelatin）最常用的固化剂，由红琼脂的纯化组分，具有由动物胶原蛋白水解得藻等海藻提取的多糖，更高的纯度和更均一的到的混合物，可在特殊具有良好的凝胶性能结构在分子生物学研培养基中作为固化剂铺制平板通常使用究中更常用，特别是在明胶的凝固温度较低

1.5-浓度（），电泳和某些特殊培（约），且易

2.0%15g/L DNA20-25℃配制顶层琼脂则使用较养基中用量与琼脂类被某些微生物降解，因低浓度（）似，但价格较高，不适此主要用于特定微生物

0.7%7g/L琼脂在左右完全合常规大量培养基配的培养和某些微生物液100℃溶解，冷却至左右制化明胶能力的检测45℃凝固选择合适的固化剂对培养基的物理性质和实验效果有重要影响在大多数常规应用中，琼脂是首选固化剂；对于需要高纯度或特殊应用场景，可考虑使用琼脂糖；明胶则主要用于特殊目的的培养基称量注意事项天平校准使用前确保精密天平已校准，处于水平位置，并在稳定环境中操作避免天平周围气流干扰和振动，确保称量精度2防止交叉污染每种试剂使用专用药匙，称取一种试剂后清洗擦干药匙再取另一种试剂瓶开启后尽快盖好，避免盖错导致交叉污染，影响试剂纯度精确计量严格按照配方比例称量，特别是关键成分如选择性药剂、指示剂等小体积培养基配制时，按比例精确计算各组分用量，确保浓度一致环境与试剂保护避免在高湿环境下长时间暴露吸湿性试剂，如蛋白胨、酵母提取物等尽量减少试剂暴露在空气中的时间，防止吸湿、氧化或污染溶解与混合技巧分步溶解法搅拌与加热控制先加少量水溶解固体成分，形成浓使用磁力搅拌器进行持续、均匀搅溶液后再慢慢添加余量水至最终体拌，必要时配合适度加热（通常不积这种方法有助于难溶性成分的超过，除非溶解琼脂）避免60℃溶解，避免结块现象，提高溶解效过度加热导致成分降解，特别是含率对于含多种成分的复杂培养基糖量高的培养基，防止美拉德反应尤为适用导致变色特殊成分处理热敏成分（如抗生素、某些维生素）应在培养基主体冷却后再添加难溶性成分可预先在小体积溶剂中溶解，再添加到主体培养基中脂溶性成分可先溶于少量乙醇或再添加DMSO良好的溶解与混合是配制高质量培养基的关键步骤恰当的操作可以确保各组分均匀分布，避免沉淀或分层现象，保证培养基性能的一致性和可靠性的测定与调整pH的重要性测定与调整方法pH pH培养基的值是影响微生物生长的关键因素大多数细菌适宜测定应使用经过校准的计进行，确保测量准确性调整pH pH pH在中性或弱碱性环境（）生长，而真菌则偏好略酸时，使用溶液（）调高，使用溶液pH

6.8-

7.2NaOH1mol/L pHHCl性环境（）不适宜的会抑制微生物生长，甚至（）调低调整过程应缓慢进行，边加边测，避免过pH

5.0-

6.0pH1mol/L pH导致死亡度调整导致值剧烈波动pH此外，还会影响培养基中某些成分的溶解度、稳定性和活为维持稳定性，许多培养基中添加缓冲系统，如磷酸盐缓冲pH pH性，影响选择性培养基和鉴别培养基的功能发挥因此，精确控液这些缓冲系统能够在微生物代谢产酸或产碱时，维持培养环制培养基是配制过程中的重要环节境的相对稳定，有利于微生物生长pH应注意，某些指示剂会受影响而变色，因此先调整，再加pH pH入指示剂，避免干扰的测定pH培养基的分装5-10ml试管液体培养基适用于小体积培养和实验，便于观察浊度变化1/3三角瓶分装比例确保充分通气和混合，防止培养过程中溢出5-7ml试管斜面分装量保证足够表面积供微生物生长，便于观察和保存25-30ml标准平板分装量90mm培养皿的理想分装量，确保适当厚度和均匀性培养基分装是确保实验一致性的重要步骤分装时应避免培养基沾在容器口部，以防污染和影响密封效果分装后应立即加盖或加塞，必要时用皮筋包扎以防松动对于大批量分装，可使用分装器提高效率和一致性培养基的灭菌

（一）高压蒸汽灭菌原理与条件高压蒸汽灭菌是最常用的培养基灭菌方法，利用高温高压蒸汽破坏微生物细胞结构和蛋白质功能，达到彻底灭菌效果标准条件为，分钟，这足以杀121℃15-20死大多数微生物包括孢子灭菌时间从高压锅达到工作压力（通常为或103kPa）时开始计算15psi适用范围与注意事项高压蒸汽灭菌适用于大多数常规培养基，但不适合含热敏成分的培养基根据培养基体积和容器大小，灭菌时间需要适当调整体积越大，需要的灭菌时——间越长，以确保培养基内部也能达到灭菌温度过度灭菌的危害过度灭菌会导致培养基中氨基酸、糖类等成分降解，产生有毒物质或引起美拉德反应导致培养基变色（通常变为棕黄色）这不仅影响培养基的营养价值，还可能抑制某些敏感微生物的生长因此，应严格控制灭菌时间和温度，避免不必要的延长灭菌培养基的灭菌

（二）间歇灭菌法1第一天将培养基在100℃水浴中加热30分钟，杀死绝大多数营养细胞，而保留孢子室温冷却后，置于37℃培养箱过夜2第二天孢子在适宜温度下萌发成为营养细胞再次进行100℃水浴加热30分钟，杀死新生的营养细胞室温冷却后再次培养过夜3第三天进行第三次100℃水浴加热30分钟，彻底杀死所有微生物此时培养基已完成灭菌，可以安全使用间歇灭菌法也称为巴氏灭菌法或分馏灭菌法，主要用于含热敏成分的培养基，如含高浓度糖类的培养基这种方法避免了高温导致的成分降解和美拉德反应，保持培养基的原有性质和营养价值该方法特别适用于含糖量高（2%）的培养基，如PDA培养基或甜菜碱培养基，以及一些特殊用途的诊断培养基缺点是操作周期长，需要连续三天处理，工作量较大培养基的灭菌

（三）过滤除菌法适用范围过滤除菌法主要用于热敏性成分的灭菌，如抗生素、维生素、血清、生长因子等这些物质在高温下容易失活或降解，无法使用常规高压灭菌方法处理此外，小体积的培养基添加物也常采用过滤除菌法处理2原理与设备该方法利用物理过滤原理，通过足够小的滤膜孔径（通常为

0.22μm）阻留微生物细胞，而允许溶液通过常用设备包括注射器过滤器、真空过滤装置或离心过滤管等滤膜材质多为聚醚砜、聚偏氟乙烯或醋酸纤维素等操作要点过滤除菌操作应在无菌环境下进行，如超净工作台内过滤前应确保滤器已灭菌，且收集容器也处于无菌状态过滤时压力要适中，避免过大压力导致滤膜破裂或细菌穿透对于黏度较高的溶液，可适当稀释或预先过大孔径滤膜与主体培养基的结合热敏性成分经过滤除菌后，应在主体培养基冷却至60℃以下时添加，以防高温破坏这些成分添加后应迅速但轻柔地混合均匀，避免产生气泡，然后立即分装使用琼脂培养基的制备技巧琼脂的充分溶解倾倒前的温度控制琼脂需在的高温下才能完全溶解未完全溶解的琼脂琼脂培养基溶解后，需冷却至适当温度再添加热敏成分或倾倒平90-100℃会导致培养基浑浊不清，影响后续观察常用方法包括水浴加板一般建议冷却至，此时琼脂尚未凝固但温度已不50-60℃热法、微波炉加热法和高压蒸汽灭菌法无论采用哪种方法，都会破坏热敏性成分若温度过高，可能会导致培养皿变形或热敏应确保琼脂完全溶解至透明状态成分失活；温度过低则琼脂开始凝固，难以均匀分装重要提示加热过程中应不断搅拌，避免琼脂沉底烧焦微波炉冷却方法可将培养基置于水浴中保温，或室温下自45-50℃加热时应分多次短时间加热，中间停止并搅拌，防止溢出然冷却但需定期检查温度使用温度计或手感（培养基瓶壁温度可以长时间手触但略有热感）判断倾倒平板时动作要快而准确，避免琼脂在倾倒过程中过度冷却导致不均匀凝固同时，轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布，避免气泡形成平板培养基的制备培养皿准备使用经过灭菌处理的塑料或玻璃培养皿如使用玻璃培养皿，应确保完全干燥，避免残留水分稀释培养基或影响凝固操作环境应洁净，减少空气中微粒污染培养基的机会推荐在超净工作台内操作，若无条件，至少应关闭门窗，减少气流扰动培养基倾倒培养基冷却至时开始倾倒平板每个标准培养皿加入约45-50℃90mm30-培养基，厚度约为倾倒时避免培养基接触培养皿盖内侧，防止35ml4-5mm盖上的冷凝水滴回培养基造成污染倾倒后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，必要时可在平整表面上轻叩培养皿侧面，帮助气泡上浮消除凝固与存放倾倒后让培养基在室温下自然凝固，时间约分钟凝固期间培养皿15-20盖子应保持半开状态，避免盖内水汽凝结滴落到培养基表面确认完全凝固后将培养皿倒置（盖子在下，培养基在上），防止冷凝水污染培养基表面标记相关信息后，用塑料袋密封，在冰箱中倒置保存，避免培养4℃基表面干燥开裂热不稳定成分的添加抗生素抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素等在高温下容易失活通常制备高浓度（100×）的储备液，经

0.22μm滤膜过滤除菌后，-20℃保存使用时取出解冻，按1:100比例添加到冷却至50℃以下的培养基中指示剂与诱导剂X-Gal作为蓝白斑筛选的显色底物，IPTG作为诱导剂，均易受热破坏通常溶于二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）配制储备液，避光-20℃保存，使用前添加到冷却的培养基中维生素与生长因子许多维生素和生长因子对热敏感，如维生素C、B族维生素等这些成分通常单独配制，经过滤除菌后再加入主体培养基添加时应轻柔混匀，避免过度搅拌产生气泡影响培养基质量热不稳定成分的添加是培养基制备中的关键环节，直接影响培养基的选择性和特定功能添加时要确保无菌操作，避免污染；同时注意温度控制，防止高温导致这些成分失活常用抗生素的使用浓度抗生素名称工作浓度储备液浓度溶剂储存条件氨苄青霉素50-100μg/ml100mg/ml水或50%乙醇-20℃，避光（Ampicillin）卡那霉素50μg/ml50mg/ml水-20℃（Kanamycin）氯霉素25-35μg/ml34mg/ml无水乙醇-20℃，避光（Chloramphenicol）四环素10-15μg/ml15mg/ml50%乙醇-20℃，避光（Tetracycline）链霉素50μg/ml50mg/ml水-20℃（Streptomycin）抗生素在选择性培养基中起关键作用，用于抑制非目标微生物生长使用前应考虑实验目的和目标微生物的抗性特征储备液应使用高纯度试剂制备，通过

0.22μm滤膜过滤除菌，分装后冷冻保存大多数抗生素储备液在-20℃可保存3-6个月，避免反复冻融影响活性培养基制备过程中的安全注意事项个人防护配制培养基时应穿着实验服，戴手套操作，防止高温液体烫伤和化学品接触皮肤处理高温培养基时可使用隔热手套若有飞溅风险，应佩戴护目镜保护眼睛处理某些有毒成分时，应在通风橱内操作或佩戴合适的呼吸防护装置热源使用安全使用电炉或加热板时，注意防止液体溢出导致短路或火灾热培养基沸腾时要小心观察，防止突沸溢出造成烫伤使用高压灭菌锅时，应确保安全阀功能正常，避免超压造成爆炸风险不要在无人看管的情况下使用加热设备化学品处理某些培养基成分具有潜在危害，如胆盐（刺激性）、结晶紫（染色风险）等处理这些物质时应格外小心，避免吸入粉尘或接触皮肤有毒试剂的防护措施包括使用通风橱、佩戴防尘口罩，并做好标签警示使用后的废弃物应按规定处理，避免环境污染微生物安全培养基灭菌前可能含有微生物污染，处理时应假设其具有生物危害灭菌后的培养基若发现污染，应进行适当消毒后处理针对高风险微生物的专用培养基，应在相应生物安全等级的实验室中配制和使用，严格遵循安全操作规程培养基的储存液体培养基1避光保存，有效期个月4℃1-3固体平板倒置密封保存，有效期周4℃2-4含抗生素平板保存，有效期周4℃1-2培养基储存对维持其质量至关重要储存前应确认培养基已完全冷却，并标记清晰的制备日期和成分信息液体培养基应拧紧瓶盖防止蒸发和污染；固体平板应倒置储存，防止冷凝水滴落表面；最好用塑料袋密封保存，减少水分蒸发导致培养基干裂应避免培养基反复冻融，这会导致成分析出和性能下降在实验室工作计划中，应合理安排培养基配制量，避免浪费使用前应检查培养基外观，确认无污染或变质迹象过期培养基不应使用，应进行适当消毒后处理培养基变质的判断外观变化pH变化微生物污染正常培养基通常澄清透明或呈特定颜含pH指示剂的培养基会随pH变化而肉眼可见的菌落、霉点或其他微生物色变质的液体培养基可能出现浑改变颜色如果培养基颜色异常，可生长痕迹是最明显的变质标志这种浊、异常沉淀、颜色改变或表面膜状能是pH发生变化的信号例如，含污染可能来自灭菌不彻底、操作不当物质琼脂培养基可能出现裂缝、异溴甲酚紫的培养基从紫色变为黄色表或储存过程中的二次污染不同类型常收缩或表面污染斑点若培养基原明环境变酸；含酚红的培养基从红色的污染有不同特征，如细菌通常形成本应透明而变得混浊，很可能是微生变为黄色也指示酸化这些变化通常圆形小菌落，而霉菌则表现为蓬松的物污染所致是微生物污染后代谢活动的结果菌丝体气味异常许多微生物代谢过程会产生特殊气味若培养基出现异常气味，如酸臭味、氨味或腐败味，通常表明存在微生物污染和变质但应注意，嗅闻培养基需谨慎，避免吸入潜在有害物质，特别是可能含有病原微生物的培养基一旦发现培养基变质，应立即废弃并记录相关信息，分析可能原因，避免类似问题再次发生变质培养基使用前应进行适当消毒处理，防止污染扩散选择性培养基的配制原理选择性培养基的基本原理常用选择性因子选择性培养基通过添加特定抑制剂，抑制非目标微生物生长，同抗生素是最常用的选择性因子，如氨苄青霉素（抑制不含内酰β-时允许目标微生物正常繁殖这种选择性基于不同微生物对特定胺酶的细菌）、环丙沙星（抑制细菌但不影响真菌）胆盐能抑化学物质的敏感性差异，利用目标菌的抗性特征来实现分离目制革兰氏阳性菌而允许肠道菌（革兰氏阴性菌）生长，常用于肠的道病原菌检测选择性培养基在临床诊断、食品安全检测和环境微生物分析中有某些染料如结晶紫和美蓝具有选择性抑菌作用，主要抑制革兰氏广泛应用，可以从复杂样品中快速分离和培养特定微生物，提高阳性菌高盐浓度（如）可抑制大多数微生物，而

7.5%NaCl检测效率和准确性耐盐菌如金黄色葡萄球菌则能生长极端值也可用作选择因pH素，如的培养基有利于乳酸菌和真菌生长，而抑制多数pH

4.0其他细菌配制选择性培养基时，抑制成分的浓度控制至关重要浓度过——高可能抑制目标微生物，过低则选择性不足某些敏感微生物可能需要在加入选择性成分前先进行富集培养鉴别培养基的配制原理鉴别培养基基本原理pH指示剂应用鉴别培养基通过添加特定指示剂或底物，许多微生物发酵糖类产酸或分解蛋白质产显示微生物的代谢特性，从而区分不同菌碱，可通过pH指示剂显示这些变化常用种当微生物在培养基上生长时，其代谢指示剂包括溴麝香草酚蓝（酸性环境变活动会产生特定产物或消耗特定成分，导黄，碱性环境变蓝）、中性红（酸性环境致培养基颜色变化或其他可见反应，使不变红，碱性环境变黄）和酚红（酸性环境同微生物形成的菌落具有区别性特征变黄，碱性环境变红）等这些指示剂直接添加到培养基中，浓度通常为

0.001%-

0.01%特殊底物反应通过添加特定底物检测微生物的酶活性，如乳糖用于检测乳糖发酵能力（麦康凯琼脂），柠檬酸盐用于检测柠檬酸盐利用能力（西蒙柠檬酸盐琼脂）一些鉴别培养基还利用金属离子沉淀反应，如硫化铁沉淀（TSI琼脂）或磷酸锰沉淀（曼尼托盐琼脂）来显示特定生化反应配制鉴别培养基时，指示物的浓度和培养基pH值需精确控制，以确保明显的鉴别效果某些指示剂对热敏感，应在主体培养基冷却后添加使用鉴别培养基时，需严格遵循标准操作程序和判读标准，确保结果可靠性培养基配制记录管理基本信息记录详细记录培养基名称和类型、配制日期和操作人员包括各成分物质的确切含量、试剂级别、制造商和批号信息记录最终pH值以及是否添加了特殊成分（如抗生素、指示剂等）这些基本信息是追溯培养基来源和判断问题的基础资料处理过程记录记录灭菌方式（高压、过滤或间歇灭菌）、温度、压力和时间参数对于特殊处理步骤，如pH调整过程、添加热敏成分的温度条件等，也应详细记录若出现异常情况，如溶解不完全、颜色异常等，应记录并说明采取的措施质量控制记录记录培养基外观、无菌检查结果以及性能测试数据（如适用）包括样品留存信息、保存条件和有效期应设置唯一批号，便于追踪和引用记录应保存至少比培养基有效期长一年，以备查阅和质量追溯良好的记录管理是实验室质量管理的重要组成部分建议采用标准化的记录表格，确保信息完整一致电子记录系统可提高管理效率，但需有适当的数据备份和安全措施培养基记录应与实验数据关联，便于分析培养基质量与实验结果的关系培养基配制PDA基本成分（1L）应用特点•马铃薯（去皮切片）200g PDA培养基pH值较低（约

5.6），有利于抑制细菌生长而促进真菌繁殖其丰富的•葡萄糖（Dextrose）20g碳水化合物来源促进真菌产孢，有助于形•琼脂（Agar）15-20g态学鉴定常用于食品和环境真菌的分离•蒸馏水至1L培养，也适用于植物病原真菌的培养和保PDA（Potato DextroseAgar，马铃薯葡存萄糖琼脂）培养基是真菌培养的常用培养基，富含马铃薯中的淀粉、维生素和矿物质，适合大多数丝状真菌和酵母菌生长变种与改良可添加抗生素（如氯霉素50-100mg/L）制成CPDA，进一步抑制细菌污染若需降低真菌产孢，可减少葡萄糖量至5-10g/L商业化的PDA干粉培养基可直接按说明书配制，方便快捷，但自制PDA可根据需要调整成分比例，更具灵活性PDA培养基也是许多特殊用途培养基的基础，通过添加不同选择性或鉴别性成分，可开发出针对特定真菌的专用培养基马铃薯葡萄糖琼脂（）培养基制备步骤PDA马铃薯处理选择新鲜健康的马铃薯，彻底清洗，去皮后切成约1cm³的小块准确称取200g处理好的马铃薯块煮沸提取将马铃薯块放入装有500ml蒸馏水的锅中，煮沸15-30分钟，直至马铃薯块变软透明确保充分提取马铃薯中的可溶性成分过滤获取浸出液用4层纱布或滤纸过滤，收集马铃薯浸出液轻压马铃薯残渣，确保充分提取液体通常可获得约400-450ml浸出液添加其他成分向浸出液中加入20g葡萄糖和15-20g琼脂，充分搅拌溶解如有必要，加热促进溶解，但避免过度加热导致成分变性5定容与pH调节加入蒸馏水至1L最终体积使用pH计测量培养基pH值，用稀NaOH或HCl溶液调节pH至

5.6±

0.2，这是真菌生长的适宜酸度灭菌与分装将培养基分装至合适容器，121℃高压灭菌15-20分钟冷却至约50℃后，在无菌条件下分装至平板或试管中血琼脂培养基制备基础培养基配方（1L）制备步骤与注意事项胰蛋白胨（）首先配制基础培养基并完成高压灭菌将灭菌后的培养基在水浴中•Tryptone15g冷却至，此温度既不会导致血液中蛋白质变性，又能保大豆胨（）45-50℃•Soya peptone5g持琼脂液态状态氯化钠（）•NaCl5g琼脂（）在超净工作台内，向培养基中无菌添加经脱纤维处理的血液（通常•Agar15g为灭菌脱纤维绵羊血）添加量为培养基体积的，如培5-10%1L血琼脂培养基是临床微生物学中最常用的培养基之一，用于分离和养基添加血液轻轻混匀但避免产生气泡，气泡会影响50-100ml鉴定多种病原菌，特别是溶血性细菌基础培养基通常采用胰蛋白平板质量和后续观察胨大豆琼脂（）或营养琼脂，提供基本营养需求TSA混合均匀后，立即将培养基倾注入无菌培养皿中，每皿约15-血液添加量通常为，根据实验目的可调整常用血源包括5-10%待琼脂凝固后，可在培养箱中放置过夜进行无菌检20ml37℃绵羊血、牛血、兔血或人血，其中绵羊血最为常用，可检测多种溶查，确认无污染后保存4℃血模式注意事项血液必须是新鲜的脱纤维血液，避免使用含抗凝剂的血液培养基温度过高会导致血红蛋白变性，出现巧克力化现象；温度过低则会导致琼脂过早凝固，血液分布不均麦康凯琼脂培养基（）MacConkey Agar基础营养成分发酵底物胰蛋白胨，提供氨基酸和肽类乳糖，用于检测乳糖发酵能力17g10g指示剂系统选择性成分中性红和结晶紫胆盐，抑制革兰氏阳性菌生长

0.03g

0.001g

1.5g麦康凯琼脂培养基是常用的选择性和鉴别培养基，主要用于肠道菌的分离和初步鉴定胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌的生长，允许肠杆菌科细菌生长乳糖和中性红形成指示系统，能够区分乳糖发酵菌和非乳糖发酵菌乳糖发酵菌（如大肠杆菌）在该培养基上形成粉红色至红色菌落，菌落周围可见沉淀环；非乳糖发酵菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）则形成无色透明菌落这种颜色差异源于乳糖发酵产酸，导致降低，使中性红变为红色pH培养基质量控制的关键指标外观特性颜色、透明度、均质性物理性质2pH值、固化程度、保水性微生物控制无菌性、生长支持能力选择性能力抑制非目标微生物的效果鉴别能力5对目标微生物的区分度培养基质量控制是确保微生物实验可靠性的关键环节外观检查是最基本的质控手段，包括观察培养基的颜色、透明度、均质性和表面状况，确保无异常颗粒、沉淀或分层现象物理性质检测包括精确测量pH值（确保在规定范围内）、评估固体培养基的固化程度和表面平整度、检查保水性以防过度干燥微生物控制是核心质控项目，包括无菌性检查（确保灭菌有效）和生长支持力测试（验证培养基能否支持目标微生物生长）针对选择性培养基，需额外测试其选择性能力，即是否能有效抑制非目标微生物；对于鉴别培养基，则需评估其区分不同微生物的能力，确保显色或其他鉴别反应明确可辨培养基性能测试方法无菌测试将培养基样品置于37℃培养箱中培养24-48小时，观察是否出现浑浊（液体培养基）或菌落（固体培养基）任何微生物生长迹象都表明灭菌失败或二次污染，该批培养基应予废弃对于特殊用途培养基，可能需要延长培养时间至7天生长支持力测试使用标准菌株（如ATCC菌株）接种培养基，观察生长情况对照组应使用已验证的培养基评估标准包括生长速度、菌落大小和形态特征等生长支持力不足可能由营养成分降解、pH不适或抑制物存在等因素导致选择性测试将目标菌和非目标菌混合接种于选择性培养基上，验证其是否能有效抑制非目标菌而允许目标菌生长通常使用定量接种法，计算各类菌株的回收率，确保选择性达到预期水平选择性不足或过强都会影响培养基的实用性pH稳定性测试记录培养基灭菌前后的pH值变化，确保其在允许范围内（通常±

0.2单位）某些培养基在高温灭菌后pH会显著下降，需要预先调整至较高值对含糖量高的培养基尤其重要，因糖类在高温下分解产酸，可显著改变培养基pH值培养基性能测试结果应详细记录并定期审核，确保质量稳定性对于关键实验使用的培养基，建议保留对照样品以备验证若发现批次间差异，应分析原因并采取纠正措施培养基配制常见问题

（一）琼脂不完全溶解常见原因包括加热不充分、搅拌不均匀或琼脂质量问题琼脂需要在90-100℃高温下完全溶解，观察液体应透明无颗粒解决方法是确保充分加热至完全透明，同时不断搅拌避免局部过热可选用水浴加热法代替直接加热，提供更均匀的温度分布培养基变色培养基变为棕黄色通常是由过度加热或美拉德反应（糖与氨基酸反应）导致这种变色不仅影响外观，还可能产生有毒物质抑制微生物生长解决方法是严格控制加热时间和温度，避免过度灭菌对于含高糖分的培养基，考虑使用间歇灭菌法或分开灭菌再合并的方法培养基出现沉淀沉淀可能由培养基成分间的化学反应、pH不适或保存不当导致这些沉淀可能影响营养成分的可利用性解决方法包括检查配方兼容性，确保正确的pH值，以及优化溶解顺序（先溶解易沉淀组分）某些情况下，微量沉淀不影响培养效果，属于正常现象遇到培养基问题时，应记录详细情况并尝试分析原因，避免在后续配制中重复出现对于重要实验，建议提前进行小规模试配，验证方法可行性，再进行大批量制备培养基配制常见问题

（二）平板表面凹凸不平平板表面有水珠平板干裂或收缩原因培养基倾倒温度不当、操作台不平或培养原因培养基冷却过程中水汽冷凝在培养皿盖内原因培养基水分蒸发过多，通常发生在长期保基中存在气泡表面不平会影响菌落观察和计侧，后滴落到培养基表面这些水珠会导致菌落存或在低湿度环境中未密封保存的平板干裂的数，在某些情况下还会导致培养物扩散不均匀扩散，产生水流状生长，影响单个菌落的形态培养基不仅影响微生物生长，也可能导致培养基观察成分浓度变化解决方法确保培养基在适当温度（45-50℃）解决方法平板凝固时保持培养皿盖子微开，减解决方法使用塑料袋或封口膜密封平板，减少倾倒，这时琼脂尚未开始凝固但又不会过热；使少水汽在盖内侧凝结；确保培养基充分冷却并凝水分蒸发；在保存容器中放置湿润的纸巾保持湿用水平调节的操作台；倾倒前轻轻摇晃培养基去固后再盖紧盖子；平板应倒置保存（培养基面朝度；减少培养基在超净工作台等气流环境中的暴除气泡；倾倒后轻轻摇动培养皿使表面均匀上，盖子朝下），避免冷凝水滴落到培养基表露时间；配制平板时确保使用足够体积的培养基面；需要时可在培养皿内放置少量吸水纸吸收多（通常为3-4mm厚）余水分培养基配制常见问题

（三）培养基污染问题不稳定问题pH培养基污染是最常见也是最严重的问题之一，会直接导致实验结不稳定表现为灭菌前后值变化过大，或储存过程中漂pHpHpH果不可信污染来源多样，可能是原材料携带微生物、灭菌不彻移这通常是由缓冲系统不足或组分在高温下分解所致异pH底、无菌操作不当或储存过程中的二次污染常会直接影响微生物生长状态及选择性培养基的功能解决策略加强无菌操作技术，包括工作区域消毒、使用无菌器解决方法添加适当缓冲剂（如磷酸盐缓冲系统）增强稳定pH具和避免不必要的暴露；确保灭菌条件充分，大体积培养基可适性；优化灭菌条件，避免不必要的长时间高温处理；考虑成分分当延长灭菌时间；定期检查灭菌设备性能；培养基冷却至手可触开灭菌再合并的方法，特别是对含糖量高的培养基；对敏感pH摸温度前，避免打开容器；原材料选择可靠来源，必要时进行预的培养基，可在灭菌后重新调整（使用无菌酸碱溶液）pH灭菌处理某些培养基配方本身存在不稳定问题，可考虑修改配方，如pH对于频繁出现污染问题的实验室，建议系统检查全流程，找出薄减少易降解成分或增加缓冲能力对于商业化培养基，应仔细阅弱环节，可能需要改进灭菌流程、加强人员培训或更新设备读说明书了解可能的变化范围pH培养基配制常见问题

（四）琼脂过早凝固温度降低过快导致倾倒困难培养基支持力差2成分降解或配比不当影响生长批次间差异大缺乏标准化操作流程琼脂过早凝固是配制固体培养基时的常见问题，尤其在冬季或空调环境下更易发生解决方法包括使用预热的容器进行分装；维持适当的室温；备好所有需要的容器再开始倾倒；必要时使用恒温水浴保持培养基温度；加快操作速度，避免不必要的等待培养基支持力差表现为微生物生长缓慢、菌落小或未形成典型形态可能原因包括原料质量问题，特别是复杂提取物如酵母提取物、蛋白胨等批次间差异；成分在高温下降解；配比不当导致营养不平衡；或pH值不适解决方法检查原料质量及有效期；优化灭菌条件减少成分降解；严格按配方比例配制；必要时进行生长支持力测试调整配方批次间差异大主要源于缺乏标准化流程建立详细的标准操作程序（SOP），明确每个步骤的参数要求；使用校准的仪器设备；优先选择稳定可靠的原料来源；建立内部参考标准；定期对关键环节进行验证和调整培养基使用中的注意事项使用前检查每次使用培养基前，应仔细观察外观是否正常，检查有无污染迹象（如浑浊、异常菌落或霉点）、干裂、过度水合或颜色异常等问题对含指示剂的培养基，确认颜色在正常范围内可取少量培养基进行无菌测试，特别是对关键实验使用的培养基温度处理冷藏保存的培养基使用前应恢复至室温，尤其是平板培养基温度过低会导致微生物接种时受到冷休克，影响生长；同时冷平板表面易产生冷凝水，干扰菌落形成液体培养基应预热至适宜温度，通常为微生物最适生长温度（如细菌37℃，酵母30℃）接种与培养条件接种操作应在无菌环境中进行，如超净工作台内或酒精灯火焰附近使用灭菌接种工具，避免交叉污染平板培养应倒置（培养基面朝上）以防冷凝水污染培养面根据微生物特性选择适当培养温度和气体环境（如需氧、微需氧或厌氧条件）密封与保存平板边缘可用封口膜或石蜡膜封口，防止污染和干燥培养过程中若需长期观察，可在培养箱内放置盛水容器增加湿度使用后的培养基应在废弃前进行适当灭活处理，特别是含病原微生物的培养物记录使用的培养基批号，便于结果追溯商品化脱水培养基的使用优势与特点使用要点商品化脱水培养基是经过精确配方设计和严格质量控制的预混合严格按供应商说明书配制，包括配比、范围和处理方法注pH粉末，具有操作简便、成分稳定和批次间差异小等优势这类产意重量和体积测量的准确性，避免随意调整配方比例记录批品通常经过广泛测试验证，确保性能可靠，特别适合需要标准化号、有效期等信息，便于质量追溯避免反复开盖，防止吸湿导结果的检测实验室致成分变化，开封后应密封保存在低温干燥环境中常见形式包括完全脱水粉末（只需加水即可）和半成品基础培养商品化培养基通常有详细的性能指标和期望结果描述，应参照这基（需另外添加某些成分如血液或选择性试剂）某些特殊用途些标准评估培养结果某些培养基可能需要添加补充成分以发挥培养基几乎只有商业化产品可用，如复杂的临床诊断培养基最佳性能，如血液、血清或特定生长因子对于关键应用，建议进行性能验证测试，确认其满足特定实验要求长期使用同一品牌产品有助于维持实验结果的一致性若更换品牌或批次，应考虑进行对比测试，评估潜在影响特殊培养基配制厌氧培养基还原剂添加厌氧指示剂1硫代硫酸钠或硫化钠等还原剂降低氧化还原电位甲烯蓝或不碱素等显示氧化还原状态2厌氧环境除氧处理使用厌氧罐或厌氧袋创造无氧条件煮沸或通氮气驱除溶解氧气厌氧培养基是培养偏厌氧或专性厌氧微生物的特殊培养基，其配制需要特别注意排除氧气和维持低氧化还原电位常用还原剂包括硫代硫酸钠（

0.1-

0.2%）和硫化钠（

0.05%），它们能快速结合溶解氧并降低氧化还原电位厌氧指示剂如甲烯蓝在氧化状态下呈蓝色，还原状态下无色，便于直观判断培养基的厌氧状态配制过程中应减少氧气接触，可通过煮沸排除溶解氧或使用通氮气装置置换空气高压灭菌前瓶口应松开以防爆炸，灭菌后立即拧紧防止氧气进入厌氧培养基应尽快使用，避免长时间暴露在空气中使用时需配合厌氧培养环境，如厌氧罐或厌氧袋，确保微生物在完全无氧条件下生长部分厌氧菌对氧毒性极为敏感，需使用预还原培养基并在无氧手套箱中操作培养基配制的标准操作规程（）SOPSOP的建立与内容培养基配制标准操作规程是实验室质量管理的重要组成部分，应包含详细的操作流程文档，明确每个步骤的具体要求和操作标准完整的SOP通常包括目的与适用范围、所需设备与材料、详细操作步骤、质量控制指标、注意事项与异常处理、相关记录表格等SOP应由专业人员编写，经过验证并定期更新，确保与最新技术和要求保持一致关键点控制与检查识别培养基配制过程中的关键控制点，如原料质量、称量准确性、pH值、灭菌参数等，并设置明确的检查点和验收标准建立检查记录表格，确保每个批次的培养基都经过系统检查对特别重要的步骤，如灭菌和添加热敏成分，可实施双人核查机制，提高操作可靠性设定明确的合格标准，不合格产品应有明确的标识和处理流程培训与能力评估所有参与培养基配制的人员应接受系统培训，了解SOP内容及科学原理培训应包括理论学习和实践操作，并通过考核验证能力建立定期再培训和能力评估机制，确保操作技能始终符合要求新技术或新方法引入时，应及时更新培训内容，确保团队掌握最新知识培训记录应妥善保存，作为质量管理体系的重要文件标准操作规程不仅是操作指南，也是质量保证的基础通过严格执行SOP，可显著减少人为差错，提高培养基质量的一致性和可靠性，最终确保实验结果的科学性和可重复性培养基配制技能进阶特殊需求培养基设计了解微生物生理生化特性，针对特定研究目的设计优化培养条件影响机制研究深入理解培养基成分对微生物代谢和基因表达的调控作用工业化技术应用掌握大规模培养基制备的设备和工艺控制方法质量管理体系建设建立符合国际标准的培养基生产和检测质量管理体系随着微生物学研究的深入和应用领域拓展，培养基配制技术也在不断发展进阶阶段不仅要掌握基本操作技能，还需了解培养基成分对微生物生长的影响机制，包括碳源利用、氮代谢调控、微量元素作用以及生长因子对细胞分化的影响等特殊需求培养基的设计需要考虑研究目标微生物的生理特性、营养需求和生长条件，如极端环境微生物培养基、诱导特定代谢产物的培养基或模拟特定自然环境的培养基等这些设计需要综合运用微生物学、生物化学和分子生物学知识工业化大规模制备技术与实验室操作有显著差异，需掌握自动化设备操作、过程参数监控和批次一致性控制等技能同时，建立科学的质量管理体系对确保稳定可靠的培养基至关重要，包括原材料管理、生产过程控制、成品检验和持续改进机制总结与展望基础技能持续学习培养基配制是微生物学实验的基本功，掌握精确配方和严微生物培养技术不断革新，需要通过学习和实践不断提高格操作流程确保结果可靠专业技能1标准与个性化技术创新4标准化与个性化相结合满足多样化需求，既确保基本质量培养媒介技术创新促进微生物学研究发展，推动新型培养又能适应特定实验目的基和培养方法出现培养基配制技术是微生物学研究和应用的基础，其质量直接关系到实验结果的可靠性和再现性本课程系统介绍了培养基配制的原理、方法和技巧，旨在帮助学习者建立科学严谨的实验操作习惯随着科技发展，培养基技术也在不断创新新型培养系统如微流体培养芯片、三维培养基、生物打印培养基等不断涌现，为微生物研究提供了新工具同时，对难培养微生物的研究推动了模拟自然环境培养基的发展，拓展了可培养微生物的范围未来培养基技术将更加注重环保和可持续发展，减少资源消耗和废物产生；自动化和智能化程度提高，实现培养过程的精确控制；个性化定制培养基满足特定研究需求期待学习者在掌握基本技能的基础上，积极探索创新，为微生物学研究和应用贡献力量。