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国际标准ISO6579食品和动物饲料的微生物学——沙门氏菌检测的基准方法内容1范围2参考标准3定义4原理
4.1概要
4.2前增菌一一非选择性液体培养基
5.3增菌一一选择性液体培养基
4.4划平板和鉴定
4.5确认5培养基、试剂和血清
5.1概要
5.2培养基和试剂
5.3血清6设备和玻璃器皿7采样8检验样品的制备9程序
5.1试验样品和原始悬浮液
5.2非选择性前增菌
9.3选择性增菌
9.4划平板和鉴定
9.5确认10结果表示11检验报告12质量保证附录A（标准化）程序图表附录B（标准化）培养基和试剂的成份及准备附录C（非标准化）实验室间试验结果参考书目表1生化试验的解释沙门氏菌属试验a伤寒沙门氏菌A型副伤寒沙门B型副伤寒沙门C型副伤寒沙门其它菌属
9.
5.
3.2-
9.
5.7氏菌氏菌氏菌反应%b反应%b反应反应反应%b010c%cTSI葡萄糖产酸100100100TSI葡萄糖产气010092_dTSI乳糖产酸2100一一一1TSI庶糖产酸一00一一一1TSI硫化氢产生971092尿素水解001赖氨酸脱竣酶980958-牛乳糖反应002cV-P反应一0一00口引噪反应001a来源于参考资料
[5]b这些百分率表明并不是所有分离到的沙门氏菌血清型都会显示出+或-的反应结果在食物中毒不同部位间或食物中毒里面所分离出的沙门氏菌血清型，其百分率是可以变化的c这些百分率不能从现有的文献中获得d伤寒沙门氏菌不产气e亚利桑那亚型肠炎沙门氏菌为乳糖阳性或阴性反应，但通常牛乳糖为阳性反应为便于这些菌属的研究，执行补充试验可能很有用处
9.
5.
4.5H-抗原测定将纯的无自凝集的菌落接种于半固体营养琼脂在37℃±1℃孵育24h±3h用此培养物来检测H-抗原，按
9.
5.
4.2步骤操作，但用一滴抗H血清代替生理盐水如果出现凝集，则认为该反应为阳性
9.
5.5生化和血清学反应的解释表2给出的是所用菌落（
9.
5.2）完成确认试验（
9.
5.3和
9.
5.4）的解释表2—确认试验的解释生化反应自凝集血清学反应解释典型的无0-,Vi-或H-抗原阳性考虑是沙门氏菌典型的所有反应为阴性无典型的有未做见
95.42可能是沙门氏菌・・不典型反应无/有0-,Vi-或H-抗原阳性不典型反应无/有所有反应为阴性排除沙门氏菌
9.
5.6最后确认被考虑为沙门氏菌，或可能是沙门氏菌（见表2）的菌落，应送公认的沙门氏菌参比中心做最后的血清型确认送确认时应同时附上关于此菌的所有尽可能多的信息，以及是一次爆发流行还是在食物中结果表达10与解释的结果相一致，揭示X g或x ml测试样品中是否存在沙门氏菌多实验室间的试验所获得的精密数据见附录Co测试报告11测试报告应详细说明——制样方法，如果知道的话；——试验过程中任何增菌液或孵育条件的偏离；——所有非本国际标准指定的操作条件，或者被认为可选择的、和可能影响结果的任何事件的细节；——得到的结果；测试报告也应该声明得到的阳性结果是仅用了划线培养基（
5.
2.4）而不是本国际标准指定的方法质量保证12为检查实验室用本国际标准描述的方法和培养基来检测沙门氏菌的能力，提出参考样品加入含前增菌液的质控瓶中对质控瓶的检测过程与测试样品培养相一致附录A标准化检测程序图室温下缓冲蛋白陈水37℃±1℃孵育
9.218h±2h选择
0.1ml培养物+1ml培养物+性增lOmlRVS肉汤
9.
3.1lOmlMKTTn肉汤
9.
3.1菌
41.5℃±1℃孵育24h±3h37℃±1℃孵育24h±3h在温度下的蛋白豚水缓冲溶液XLD培养基和选择第二种琼脂
9.
4.137℃士FC孵育24h±3h划平板从每块平板上检测一个特征菌落，如果阴性，检测所有明显的菌落
9.
5.2营养琼脂，37℃±1℃孵育24h±3h
9.
5.2血清学确认
9.
5.4生化确认
9.
5.3结果表示条款10附录B（标准化）培养基和试剂的组织和制备
8.1缓冲蛋白陈水
8.
1.1成份酷蛋白消化酶
10.0gNaCl
5.0gNa HPO4*12H O
9.0g22KH2PO
41.5g水1000mlB.
1.2制备将上述成分溶解于水，如需要可以加热如需要，调节pH值，以便在消毒后25℃下pH值为
7.0±
0.2分装培养基于适当容量的烧瓶中，以便满足实验的需要置于高压灭菌锅中121℃灭菌15分钟
8.2RVS肉汤
8.
2.1溶齐l」A大豆消化酶
5.0gNaCl
8.0gKH2PO
41.4gK2HPO
40.2g水1000ml
8.
2.
1.1成份
8.
2.
1.2制备将上述成分溶解于水，如需要可以加热到70℃左右溶液在完全RVS培养基制备时应已经准备就绪
8.
2.2溶齐I」B
8.
2.
2.1成份MgC12*12H O水
2400.0g1000ml
8.
2.
2.2制备将氯化镁溶于水中由于氯化镁容易吸湿，依据相关公式，可取整个的MgCL6H20溶解于新开的容器内例如,250gMgC
1.6H2O加入625ml的水，得到一个总体积为788ml的溶液，MgC
1.6H2O的重量浓度约为
31.7g/100mlo
8.
2.3溶齐I」CB.
2.
3.1成份孔雀绿草酸盐水
0.4g100mlB.
2.
3.2制备将孔雀绿草酸盐溶于水中溶液置于棕色瓶中，室温保存至少8个月
8.
2.4完全培养基
8.
2.
4.1成份溶液A B.
2.11000ml溶液B B.
2.2100ml溶液C B.
2.310ml
8.
2.
4.2制备加入1000ml溶液A、100ml溶液B、10ml溶液Co如需要，调节pH,以便在灭菌后pH值为
5.2±
0.2使用前，用10ml量分装试管置高压灭菌锅中1150c灭菌15分钟已配好的培养基于3℃±2℃保存隔天使用该培养基注最终培养基成分是大豆消化酶，
4.5g/l；氯化钠，
7.2g/l；磷酸二氢钾KH2Po4+K2HPO4,
1.44g/l；MgCb,
13.4g/l或MgCL•12H20,
28.6g/l；孔雀绿草酸盐，
0.036g/lo
8.3MKTTn肉汤⑺
8.
3.1基础培养基
8.
3.
1.1成份肉浸膏
4.3g酷蛋白消化酶
8.6gNaCl
2.6gCaCO
38.7g3Na2s2O372H2O
47.8g细菌学使用的牛胆汁
47.8g亮绿
9.6g水1000ml
8.
3.
1.2制备将脱水的基础成份或基础完全培养基溶解于水中，并煮沸5分钟如需要，调节pH,使其25℃时值为
8.2±
0.2彻底混匀培养基该基础培养基于3℃±2℃可保存4周
8.
3.2口引躲溶液
8.
3.
2.1成份碘
20.0g碘化钾（KI）
25.0g水100mlB.
3.
2.2制备将碘化钾完全溶于10ml水中，再加入碘，然后加入100ml水稀释不需加热在室温下将配制好的溶液置于密闭容器，暗处保存B.
3.3新生霉素溶液B.
3.
3.1成份新生霉素钠盐
0.04g水5mlB.
3.
3.2制备将新生霉素钠盐溶于水中，过滤灭菌3c±2℃保存4周以上B.
3.4完全培养基B.
3.
4.1成份基础培养基（B.
3.1）1000ml碘-化钾溶液（B.
3.2）20ml新生霉素溶液（B.
3.35mlB.
3.
4.2制备无菌条件下,将5ml新生霉素溶液（B.
3.3）加入到1000ml基础培养（B.
3.1）中混匀,然后加入20ml碘-碘化钾溶液（B.
3.2）混匀在无菌条件下，按实验需要量将培养基分装于灭菌好的烧瓶中完全培养基应隔天使用木糖赖氨酸去氧胆酸盐（）琼脂⑺XLDB.
48.
4.1基础培养基
8.
4.
1.1成份酵母浸粉
3.0gNaCl
5.0g
3.75g木糖
7.5g乳糖
7.5g蔗糖
5.0gL-盐酸赖氨酸
6.8gNa2s
30.8g柠檬酸铁（山）镂
0.08g苯酚红
1.0g9g-18g1脱氧胆酸钠琼脂1000ml水B.
4.
1.2制备将脱水的基础成份或基础完全培养基溶解于水中，加热，不停地搅拌，直至培养基开始沸腾避免温度过高如需要，调节pH,以便在灭菌后25℃时pH值为
7.4±
0.2将此培养基适量倒入烧瓶中加热并不断搅拌，直到培养基沸腾，琼脂溶解不要温度过高1）依靠琼脂的凝胶强度B.
4.2琼脂板的制备立即从44℃-47c的水浴（
6.5）取出，搅拌并烧平板直到凝固使用前，在35c到55c的烘箱里小心干燥琼脂板，直到琼脂表面干燥（若把盖子拿掉或琼脂面朝下效果更好）烧好的平板在3c±2℃保存5天以上
8.5营养琼脂
8.
5.1成份肉浸膏
3.0g蛋白陈
5.0g琼脂水9g-18g01000ml
8.
5.2制备将相应组份或脱水完全培养基溶于水，如需要可加热如需要，调节pH,以便在灭菌后25℃时pH值为
7.0±
0.2将培养基转移到适当容量的试管或瓶中高压灭菌锅（
6.1）125°灭菌15分钟
8.
5.3营养琼脂板的制备将约15ml融化的培养基移到灭菌皮氏培养皿中，按B
4.2进行操作
8.6三糖铁琼脂（TSI琼脂）
8.
6.1成份肉浸膏酵母浸液蛋白陈NaCl乳糖蔗糖葡萄糖柠檬酸铁（III）Na2s
3.0g苯酚红琼脂水
33.0g
20.0g
5.0g
8.
6.2制备
10.0g将相应组份或脱水完全培养基溶于水，如需要可加热
10.0g如需要，调节pH,以便在灭菌在25℃时pH值为
7.4±
0.
21.0g将10ml培养基分装于试管或平板中
0.3g高压灭菌锅（
6.1）121℃灭菌15分钟
0.3g
0.024g9g-18g D1000ml置于一个倾斜的位置，使底部的深度
2.5cm到约5cno
8.7尿素琼脂Christensen
8.
7.1基础培养基
8.
7.
1.1成份蛋白陈葡萄糖
1.0gNaCl
1.0g
5.0g苯酚红KH2PO
42.0g琼脂
0.012g9g-18gD1000ml
8.
7.
1.2制备将相应组份或脱水完全培养基溶于水，如需要可加热如需要，调节pH,以便在灭菌在25℃时pH值为
6.8±
0.2高压灭菌锅
6.1121℃灭菌15分钟
8.
7.2尿素溶液
8.
7.
2.1成份尿素400g水，最后定容1000ml
8.
7.
2.2制备将尿素溶于水中，过滤灭菌并确认无菌见ISO721996,
7.
3.2o
8.
7.3完全培养基
8.
7.
3.1成份基础培养基B.
7.1950ml尿素溶液B.
7.250ml
8.
7.
3.2制备在无菌条件下，将尿素溶液加入到先前融化并已冷却到44℃-47c的基础培养基中将10ml完全培养基分装于灭菌管内要求倾斜放置
8.8L-赖氨酸脱竣酶培养基
8.
8.1成份L-一盐酸赖氨酸
5.0g酵母浸液
3.0g葡萄糖
1.0g澳甲酚紫
0.015g水1000mlB.
8.2制备将上述成分溶于水中，需要时可加热如需要，调节pH,以便在灭菌后25℃时pH值为
6.8±
0.2将2ml-5ml培养基转移到具螺旋帽的精密培养管
6.9中高压灭菌锅
6.1121℃灭菌15分钟B.9B-半乳糖昔酶检测试剂
8.
9.1缓冲溶液
8.
9.
1.1成份NaH2P
46.9g10mol/l的NaOH溶液约3ml水，最后定容体积50mlB.
9.
1.2制备将NaH2Po4溶于约450ml水的容量瓶中用氢氧化钠溶液调节pH值至
7.0±
0.225℃O加水至50mloB.
9.2ONPG溶液B.
9.
2.1成份a-硝基苯基-B-D-毗喃半乳糖甘ONPG水
0.08g15mlB.
9.
2.2制备在50℃左右将ONPG溶于水中冷却溶液B.
9.3完全培养基B.
9.
3.1成份缓冲溶液B.
9.15mlONPG溶液B.
9.215mlB.
9.
3.2制备将缓冲溶液加入到ONPG溶液中B.10V-P反应试剂
8.
10.1VP培养基B.
10.
1.1成份蛋白月
7.0g东葡萄
5.0g糖
5.0gK2HPO41000ml水B.
10.
1.2制备将上述成分溶于水中，如需要可加热如需要，调节pH,以便在灭菌后25℃时pH值为
6.9±
0.2将3ml培养基转移到试管中
6.9o高压灭菌锅
6.1121℃灭菌15分钟B.
10.2肌氨酸溶液（N-氨基肌氨酸）B.
10.
2.1成份一水化肌氨酸
0.5g水100mlB.
10.
2.2制备将肌氨酸一水化物溶于水中B.
10.31-奈酚乙醇溶液B.
10.
3.1成份1-蔡酚6g96%乙醇（体积比）100mlB.
10.
3.2制备将1-奈酚溶于乙醇溶液B.
10.4氢氧化钾溶液B.
10.
4.1成份氢氧化钾40g水100mlB.
10.
4.2制备将氢氧化钾溶于水中B.11口引噪反应试剂B.
11.1胰蛋白月东/色氨酸培养基B.
11.
1.1成份胰蛋白陈10gNaCl DL-色5g lg氨酸水1000mlB.ll.
1.2制备将上述成分溶于沸腾的水中如需要，调节pH,以便在灭菌后25℃时pH值为
7.5±
0.2每管加5ml培养基，进行分装高压灭菌锅（
6.1）1210c灭菌15分钟B.
11.2Kovacs试剂B.
11.
2.1成份4-二甲氨基苯甲醛5g，P25ml盐酸=
1.18g/ml〜
1.19g/ml75ml2-甲基正丁醛-2-ol前-ize—3^3ISO（国际标准化组织）是国际标准化团体的全世界同盟通常由ISO技术委员会来执行国际标准的制订工作（ISO成员体）通常由ISO技术委员会来完成国际标准的准备工作在委员会中，若对建立的技术委员会有兴趣的话，每个成员体有权作为代表国际组织、政府或非政府组织，通过ISO联系，也可以参加这项工作在所有电工标准方面，ISO与国际电工委员会（IEC）紧密合作国际标准按照ISO/IEC指南第三章所列的规则草拟技术委员会的主要任务是准备国际标准被技术委员会采用的国际标准草案以投票方式在成员体内运行至少要75%成员体的投票赞成，才能作为一个国际标准发布要引起注意的可能性是:本国际标准的一些要素可能是专利权主体ISO不应承担鉴定部分或全部的这种专利权IS06579是由食品IS0/TC34技术委员会、微生物SC9分委员会所准备的第四版删除或更换了第三版（IS065791993）,并已作了技术性修订附录A和附录B形成了本国际标准的标准化部分附录C仅为资料
8.
11.
2.2制备混合上述成分
8.12半固体营养琼脂
8.
12.1成份肉浸膏
3.0g蛋白月
5.0g东琼脂4g〜9gl水1000ml
8.
12.2制备将上述成分溶于水中，需要时可加热如需要，调节pH,以便在灭菌后25℃时pH值为
7.0±
0.2将培养基转移到适量的烧瓶中高压灭菌锅（
6.1）121℃灭菌15分钟
8.
12.3琼脂板的制备
8.13生理盐水溶液
8.
13.1成份NaCl
8.5g水1000ml
8.
13.2制备将氯化钠溶于水中如需要，调节pH,以便在灭菌后25℃时pH值为
7.0±
0.2分装上述溶液于烧瓶或试管（
6.9）中，使得它们灭菌后的体积为90ml-100mL高压灭菌锅（
6.1）121℃灭菌15分钟附录c（非标准化）多个实验室研究结果年，在欧洲计戈的框架下，欧洲和2000ij SMTCT962098
[6]AFSSAPloufragan美国生化控制系统组织了一次国际协作的测试这次测试包含了欧洲个国家的911个实验室和美国的个实验室，选用新鲜干酪凝块干酪凝块、干蛋粉、生禽肉和10一个参考物质进行每测试食品样本含有两个不同污染水平，并有一个阴性质控品从表到中，显示出从这些协作中得到每种类型样品的工作特性的价值C.1C.4仅以清晰识别技术原因（偏离协议）为基础，仔细分析，一些实验室所得数据被排除在外表新鲜干酪凝块样本得到的数据分析结果C.1——新鲜干酪凝块（空白）新鲜干酪凝块（低水平污新鲜干酪凝块（高水平污染）染）反馈结果的实验室数232323每个实验室的样本数555拒绝接受的实验室数222排队后留下的实验室数212121接受样本数105105105准确性（特异性），%100准确性（敏感性）
74.
383.8一致性，%
10083.
895.2和谐性，%
10060.
571.7表干蛋粉样本得到的数据分析结果C.2——新鲜干酪凝块（空白）新鲜干酪凝块（低水平污新鲜干酪凝块（高水平污染）染）反馈结果的实验室数262626每个实验室的样本数555拒绝接受的实验室数555排队后留下的实验室数212121接受样本数105105105准确性（特异性），%100准确性（敏感性）
98.199一致性，%
10096.
298.1和谐性，%
10096.
298.1表生禽肉样本得到的数据分析结果C.2——新鲜干酪凝块（低水平污新鲜干酪凝块（高水平污新鲜干酪凝块（空白）染）染）反馈结果的实验室数252525每个实验室的样本数555拒绝接受的实验室数555排队后留下的实验室数202020接受样本数10099100准确性（特异性），%100准确性（敏感性）98100一致性，%
10096.9100和谐性，%10096100表参考物质得到的数据分析结果C.2——参考物质（每瓶含5cfu的肠炎沙门氏菌）反馈结果的实验室数26每个实验室的样本数5拒绝接受的实验室数1排队后留下的实验室数25接受样本数125准确性（特异性），%准确性（敏感性）
94.4一致性，%
88.8和谐性，%
89.1参考书目
[1]ISO6887-2,Microbiology offood andanimal feedingstuffs一Preparation oftest sampies,initial suspensionand decimaldilutions formicrobiologicalexamination-----------------Part2:Specific rulesfor thepreparationof meatproducts
[2]ISO6887-3,Microbiology offood andanimal feedingstuffs一Preparation oftest sampies,initial suspensionand decimaldilutions formicrobiologicalexamination-----------------Part3:Specific rulesfor thepreparationof fishand fisheryproducts
[3]ISO6887-4,Microbiology offood andanimal feedingstuffs—Preparation oftest sampies,initial suspensionand decimaldilutions formicrobiologicalexamination-----------------Part4:Specific rulesfor thepreparationof productsother thanmilk andmilk products,meat andmeatproducts,and fishand fisheryproducts
[4]ISO/TR11133-1,Microbiology offood andanimal feedingstuffs一Guidelines onpreparation andproduction ofculture media--------Part1:General guidelineson qualityassurance forthe preparationof culturemediain thelaboratory
[5]EWING,W.H.and BALL,M.M.The biochemicalreactions ofthe genusSalmonella.National Centerfor DiseaseControl andPrevention,Atlanta,Georgia,USA,1996
[6]FELDSINE,P,et al.Recovery ofsalmonella inSelected Foodsby theIS06579Salmonella CultureProcedure andthe AOACInternational OfficialMethod ofAnalysis:Collaborative Study.J.AOAC int.,2001
[7]Culture Mediafor FoodMicrobiology.In:Progress inIndustrialMicrobiology.Vol.
34.Eds.Corry,J.E.L.,Curtis,G.D.W.andBaird,R.M..Elsevier,Amsterdam,1995介绍因为有大量的不同种类的食品和饲料产品，本基准方法可能对某些产品并不完全适用，而另一些产品可能得用到其他方法既然这样，如果为论证技术上的原因而绝对需要时，那么就可使用这些产品指定的不同方法不过，应尽可能地使用本基准方法在下一次审查这个国际标准时，我们会考虑所有有用关于这些指标所涉及的范围内以及个别产品不遵照这些指标的原因的信息（产品的）检测方法无法在短时间内达到统一,而且,对于某些产品，可能已经有与本基准方法不符的国际标准/或国家标准存在但是我们希望，在以后审查这些标准时能进行修改使其同本国际标准保持一致，以保证除了因技术原因确实需要外不会发生背离本基准方法的情况.微生物学一一检测沙门氏菌方法的通用指南警告一一为了保护实验室工作人员的身体健康，在适当装备的实验室、在熟练的微生物学家的控制下检测沙门氏菌、特别是伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌，这是非常关键的另外最要关注的是所有培养物的处置范围1本国际标准详述了沙门氏菌的基准方法，包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌在绪论中受讨论的局限性，本国际标准适用于——供人类消费或动物饲养所使用的产品——在食物生产和处理范围内的环境样品警告一一本方法并不包括所有的伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌标准的参考资料2通过本文中的参考目录，下列标准化文件包含组成本国际标规定的条款对后来更正或修订的陈旧参考资料，这些条款并不适用然而，鼓励那些基于赞同本国际标准的成员，去调查下面提到的大多数新版标准化文件应用的可能性对更新的参考资料，最新版的标准化文件作了参考应用ISO和IEC的成员保持对现行有效国际标准的注册IS06887-1,食品和动物饲料的微生物学一一微生物检验中测试样品、原始悬浮液及十倍稀释液的制备一一第一章原始悬浮液和十倍稀释液制备的通用规则ISO72181996,食品和动物饲料的微生物学——微生物检验的通用规则ISO8261,牛奶及奶制品一一微生物检验中测试样品、原始悬浮液及十倍稀释液制备的通用指南术语和定义3应用下列定义来表达本国际标准的用途
3.1沙门氏菌在选择性培养基上形成典型或少典型的菌落，当依照本国际标准进行试验时，它们表现出特有的生化反应和血清学特征的微生物
3.2沙门氏菌检测当依照本国际标准进行试验时，在一定重量或体积的产品中，测定这些沙门氏菌的存在与否原理4概要
4.1沙门氏菌检测需四个连续阶段（也可以见附录A）注沙门氏菌可能少量存在，并经常伴随着相当数量的其它肠杆菌属或其它菌属因此，选择性增菌是必需的；此外，为尽可能地检测到受伤沙门氏菌，经常需要进行前增菌
4.2前增菌一一非选择性液体培养基将试验部分接种于缓冲蛋白陈水，在37℃±1℃培养18h±2h对于某些食品，则需利用其它的前增菌程序，见
9.
1.2数量比较庞大时，在接种测试样品前应将缓冲蛋白陈水加热到37℃±l℃o
4.3增菌一一选择性液体培养基将
4.2得到的培养物接种到RVS肉汤和MKTTn肉汤RVS肉汤在
41.5℃±1℃孵育24h±3h,MKTTn肉汤在37℃土1℃孵育24h±3h
4.4划平板和鉴别从
4.3中获得的培养物接种于两种选择性固体培养基上——木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD琼脂）——对XLD琼脂的任何其它补充性的选择性培养基，特别是适合于分离乳糖阳性的沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌的培养基，实验室可以选择使用XLD琼脂在37c±1℃孵育，在24h±3h后检查结果第二种选择性琼脂按照厂家说明书进行孵育注作为资料，亮绿琼脂、亚硫酸铀琼脂等，可用作第二种平板划线培养基
4.5确认挑选可疑沙门氏菌的菌落进行次培养，再按
4.4所描述的划线分离，通过适当的生化试验和血清学试验加以证实培养基、试剂和血清
55.1概要供常规实验室使用，见ISO7218o
5.2培养基和试剂注由于培养基和试剂的数量庞大，为了表述清晰，我们认为将它们的组成和配制在附录B中列出更适当
5.
1.1非选择性前增菌液缓冲蛋白陈水见B.
15.
1.2第一种选择性增菌液RVS肉汤见B.
25.
1.3第二种选择性增菌液MKTTn肉汤见B.
35.
2.4固体选择性平板培养基
5.
2.
4.1第一种培养基木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂（XLD琼脂）见B.
46.
2.
4.2第二种培养基第二种培养基的选择是留给检测实验室自定在它的准备使用时应准备按厂家说明书准确执行
7.
2.5营养琼脂见B.
55.
2.6三糖/铁琼脂（TSI琼脂）见B.
65.
2.7尿素琼脂（Christensen）见B.
75.
2.8L-赖氨酸脱竣酶培养基见B.
85.
2.9半乳糖甘酶检测试剂（或依照厂商说明书使用的比色盘）见B.
95.
2.10V-P反应试剂见B.
105.
2.11口引口朵反应试剂见B.
115.
2.
11.1半固体营养琼脂见B.
125.
2.13生理盐水溶液见B.
135.3血清含有一种或多种0抗原的多价血清型可由商品化获得，也就是包含一个或更多个0群抗血清（称单价或多价抗0血清），抗Vi血清和含有一个或多个H因子的抗血清（称单价或多价抗菌素H血清）应确保所用的抗血清足以检测所有的沙门氏菌血清型设备和玻璃器皿6如果操作规范，对于可重复使用的玻璃器皿，重复使用是可以接受的通常或特殊情况下微生物实验室设备（见ISO7218）如下
6.1干灭菌（烘箱）或湿灭菌（高压灭菌器）设备见ISO
72186.2干燥柜或烘箱，通过对流通风，能在37℃±1℃和55c±1℃之间调节温度
6.3培养箱，能调节温度至35c±1℃或37℃±1℃
6.4水浴，能调节温度至
41.5℃±1℃,或孵育，能调节温度至
41.5℃±1℃
6.5水浴，能在44℃-47℃间调节温度
6.6水浴，能调节温度至37℃±1℃由于沙门氏菌的低传染性，推荐使用含有抗菌剂的水浴锅（
6.
4.
6.5和
6.6）
6.7灭菌环，直径约为3mni或10u1的灭菌吸管
6.8pH计，要求在20℃-25℃时精确校准到±
0.1单位
6.9适当容量的试管或烧瓶可以使用带无毒金属或塑料螺旋帽的试管或烧瓶
6.10分别以
0.5ml和
0.1ml间隔标示，容量为10ml和1ml的刻度吸管或自动吸管
6.11小规格（直径为90mm-100mm）和/或大规格（直径为140mm）的皮氏培养皿7制样实验室收到具有代表性的，且在运输或贮存过程中没有损坏或改变的样品是非常重要的制样不是本国际标准指定方法的一部分可参见处理相关产品的特定国际标准如果没有特定国际标准，可推荐这一方面已被公认的相关部分测试样品的制备8根据处理相关产品的特定国际标准来制备测试样品如果没有特定国际标准，可推荐这一方面已被公认的相关部分程序（见图附录A）
99.1测试样品和原始悬浮液
9.
1.1概要特定的国际标准处理相关的产品，见ISO6887-1牛奶及奶制品见ISO8261o准备原始悬浮液，通常用
5.
2.1和
4.2（缓冲蛋白陈水）指定的前增菌培养基作为稀释液如果指定测试样品的重量超过25g,则需用一定量的前增菌液做约110稀释为减少检测工作量，当检测指定食品中超过25g样品时，或有证据表明混合物（将测试样品堆聚）不会影响到特殊食品的检测结果时，则样品可以混合测定例如，如果要测定10份25g的样品，则各取10份样品混合形成一个250g混合测试样品，加入2250ml前增菌肉汤另外，还可从10份单独测试样品（
9.
3.1）的前增菌液中取
0.1ml（lOmlRVS肉汤）和1ml（lOmlMKTTn肉汤）混合加入到100ml选择性增菌液中进行增菌培养
9.
1.2某些产品原始悬浮液的特殊制备注下列特殊的制备仅涉及沙门氏菌的情况在ISO6887-
2、ISO6887-
3、ISO6887-4和ISO8261中描述了适用于其它病原微生物检测的特殊制备
9.2非选择性前增菌液将原始悬浮液（
9.1）于37℃±1℃孵育18h±2h
9.3选择性增菌液
9.
3.1将
9.2获得的培养物
0.1ml接种到含有lOmlRVS肉汤（
5.
2.2）的试管中；另取
9.2获得的培养液1ml接种到含有lOmlMKTTn肉汤（
5.
2.3）试管中
9.
3.2接种的RVS肉汤（
9.
3.1）于
41.5℃±1℃孵育24h±3h；接种的MKTTn肉汤于37℃±1℃孵育24h±3ho引起注意的是不得超过最高允许的孵育温度（
42.5℃）
9.4划线和鉴定
9.
4.1在孵育24h±2h后，取RVS肉汤（
9.
3.2）培养物一环（
6.7）接种于含有第一种选择性平板培养基（XLD平板，见
5.
2.
4.1）的大规格皮氏培养皿表面，以便获得好的单个菌落若缺少大的培养皿，则可采用两个小的培养皿，用相同的接种环一个接着一个地划平板用消毒过的接种环和皮氏培养皿象上面一样按相同的步骤接种于第二种选择性平板培养基（
5.
2.
4.2）
9.
4.2在孵育24h±3h后，用MKTTn肉汤（
9.
3.2）培养物，重复
9.
4.1描述的步骤接种于两种选择性平板培养基上
9.
4.3倒置培养皿（
9.
4.1和
9.
4.2）使底部在最上面，将第一种选择性培养基（
5.
2.1）放在设定为37℃的培养箱内第二种选择性培养基（
5.
2.4）则按照生产厂家的说明书执行
9.
4.4在孵育24h±3h后，检查平板（
9.
4.3）上存在的沙门氏菌的典型菌落或可能是沙门氏菌非典型菌落（见注）在培养皿的底部标示它们的位置在XLD平板生长的沙门氏菌典型菌落是中心一个黑点，周围由于指示剂颜色的改变而出现淡红色的轻微透明带注H2s阴性的变种沙门氏菌在XLD平板上长成粉红色菌落，中间是暗红色在适当的温度下培养第二种选择性平板培养基，经过适当的时间，通过它们的特征，检查并核对被认为可疑沙门氏菌菌落的存在
9.5确认
9.
5.1概要如果显示是可靠的，那么，可以使用商业化的可供沙门氏菌生化试验用的鉴别试剂盒鉴别试剂盒的使用关系到菌落的生化确认这些试剂盒应在生产厂商的说明书指导下使用注辨认沙门氏菌菌落，在很大程度上依靠经验，它们外表各有不同，不仅是种与种之间，每批培养基之间也有不同
9.
5.2确认菌落的选择为了确认，从每个选择性培养基的第个培养皿上挑取至少一个被认为典型的中可疑的菌落，如果第一种选择培养基为阴性，则需挑选4个菌落以上在流行病学研究的情况下，建议至少有五个菌落需被鉴别如果一个培养皿上少于五个典型的或可疑的菌落，则取所有典型的或可疑的菌落做确认用一种便于好的单个菌落形成的方式在预先干燥的营养琼脂平板表面上划经挑选的菌落将接种的平板（
9.
4.3）在37℃土VC孵育24h±3h用纯培养物进行生化试验和血清学确认
9.
5.3生化确认
9.
5.
3.1概要用接种针，将
9.
5.2所选菌落的每个培养物接种于
9.
5.
3.2至
9.
5.
3.7指定培养基
9.
5.
3.2TSI琼脂
5.
2.6先在琼脂斜面上划线，再于底层穿刺在37c±1℃孵育24h±3h在培TSL养基上颜色变化的解释如下a）底部黄色葡萄糖阳性（葡萄糖被利用）------红色或未变葡萄糖阴性（葡萄糖未被利用）——黑色硫化氢形成——气泡或裂缝葡萄糖产气b）斜面乳糖和/或蔗糖阳性（乳糖和/或蔗糖被利用）------黄色乳糖和/或蔗糖阴性（乳糖和蔗糖均不被利用）------红色或不变色典型的沙门氏菌培养物显示碱性（红色）斜面和酸性（黄色）底部，伴随着产气（气泡）和（约90%情况下）硫化氢产生（琼脂变黑）（
953.8）当分离到乳糖阳性的沙门氏菌时，TSI的斜面是黄色的因此，沙门氏菌培养物的初步确认并不能仅仅根据TSI琼脂试验的结果
9.
5.
3.3尿素琼脂（
5.
2.7）在琼脂斜面上划线在37c±1℃孵育24h±3h,间隔一定时间检查如果反应是阳性，尿素裂解释放氨，其颜色由酚红变成玫瑰红，最后变成深樱红色反应通常在2h-4h后可见
9.
5.
3.4L-赖氨酸脱竣酶培养基（
5.
2.8）接种于液体培养基表面以下，在37℃±1℃孵育24h±3ho培养后出现混浊及出现紫色表明为阳性反应黄色表明阴性反应
9.
5.
3.5B-牛乳糖试验取满环可疑菌落放于含有
0.25ml生理盐水的试管中加1滴甲笨并摇匀把试管放入37℃水浴（
6.6）,保持几分钟（约5分钟）加
0.25ml检测B-牛乳糖的试剂，混匀再将试管放入37c水浴，保持24h±3h,间隔一定时间检查试管黄色表明为阳性反应反应通常在20分钟后可见如果用准备好的纸片
（529）,则按照生产厂商的说明书操作
9.
5.
3.6V-P反应培养基取满环可疑菌落放于含有3mlVP培养基的灭菌试管中在37℃±1℃孵育24h±3h孵育后，加入2滴肌氨酸溶液，3滴1-蔡酚-乙醇液，随后加入2滴氢氧化钾溶液；每种试剂加完后要摇匀15分钟内颜色由粉红变为鲜红表明阳性反应
9.
5.
3.7口弓I跺反应培养基将可疑菌落接种于含有5ml的胰蛋白陈/色氨酸培养基的试管中在37℃±1℃孵育24h±3h孵育后，加lml Kovacs试剂出现红色环表明阳性反应黄褐色环表明阴性反应
9.
5.
3.8生化试验的解释常见沙门氏菌出现的反应结果见表lo
9.
5.4血清学确认和血清型
9.
5.
4.1概要在消除自凝现象后，用适当的血清通过玻片凝集试验对纯菌落（
9.
5.2）检测沙门氏菌抗原、Vi抗原和H抗原的存在如果与以下描述有差异的话，则按照产品说明书使用抗血清
9.
5.
4.2自凝现象的消除放一滴生理盐水（
5.
2.13）于仔细清洁过的玻片上用接种环挑取部分被测菌落并将水滴打散，以获得均一混浊的悬浮液注将部分被测菌在一滴水打散，然后用一滴生理盐水（
5.
2.13）与它混匀，这也是可能的轻轻摇动玻片30s-60s在暗背景下观察结果，用放大镜更好如果细菌凝集成或多或少的明显块状，则可认为是自凝集，那么按照下列方法进行沙门氏菌的抗原测定是不可行的
9.
5.
4.30-抗原测定用一个无自凝集的纯菌落，用一滴抗0血清（
5.3）代替生理盐水（
5.
2.13）,按
9.
5.
4.2步骤操作如果出现凝集，则认为该反应为阳性用多价和单位血清接连凝集
9.
5.
4.4Vi-抗原测定按
9.
5.
4.2步骤操作，但用一滴抗Vi血清代替生理盐水如果出现凝集，则认为该反应为阳性。
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