《生物分离工程概论》课件

生物分离工程概论生物分离工程是生物工程专业的必修专业课程，在生物制造过程中扮演着至关重要的角色作为连接发酵工程与产品应用的下游工程技术，它专注于各种生物活性物质的分离、纯化与精制过程本课程注重理论与实践的紧密结合，旨在培养学生掌握先进的分离技术原理与方法，为未来从事生物工程研发与生产奠定坚实基础通过系统学习，学生将能够理解各种分离单元操作的原理，掌握工艺路线设计方法，并能针对不同生物产品选择合适的分离策略在生物技术产业蓬勃发展的今天，熟练掌握生物分离工程知识，将为您打开生物制造领域的广阔大门课程目标掌握理论知识系统学习生物分离工程的基本理论、基本知识和技术原理，建立完整的知识体系，为后续专业课程和实际工作打下坚实基础培养实践能力通过实验教学和案例分析，培养学生的实验设计能力、工艺方案优化能力以及处理实际分离问题的综合技能发展思维方法训练学生分析问题和解决问题的思维方法，培养工程思维和创新能力，适应生物技术产业发展的需要塑造职业素养建立敬业、严谨、创新的职业道德和工匠精神，培养团队协作精神和终身学习的意识与能力课程内容概览产品精制模块结晶与干燥技术高级分离模块沉淀、膜分离、萃取、色谱初级分离模块发酵液预处理、细胞分离与破碎背景知识模块基础理论与历史发展本课程内容设计遵循从基础到应用、从简单到复杂的教学原则，层层递进首先介绍基础理论，建立知识框架；然后讲解初级分离技术，包括发酵液的预处理和细胞破碎方法；接着深入探讨高级分离技术，如沉淀、膜分离、萃取和色谱等；最后介绍产品精制技术，完成整个生物分离工艺流程每个模块既相对独立又紧密关联，构成一个完整的生物分离工程知识体系，使学生能够系统掌握从发酵产物到最终产品的全过程分离技术课程在专业中的地位基础课程生物化学、微生物学、细胞生物学等课程为生物分离工程提供理论基础上游课程发酵工程作为直接的前序课程，提供生物分离工程所需处理的原料核心课程生物分离工程作为生物工程专业的核心课程，对应个重要的毕业要求指标点3后续课程为《现代生物制药工艺学》《酶工程》等应用性课程奠定技术基础生物分离工程处于生物工程专业课程体系的核心位置，它是连接基础理论与产业应用的桥梁通过本课程的学习，学生能够将前期所学的基础知识转化为实际的工程应用能力，同时为后续的专业课程和毕业设计提供必要的技术支持在生物技术产业链中，分离纯化环节往往决定着最终产品的质量和成本，是生物技术转化为生产力的关键环节，因此本课程在培养学生的专业核心竞争力方面具有不可替代的作用第一章生物分离工程概述学科定义与范围介绍生物分离工程的基本概念、研究对象及技术体系，明确其在生物工程领域的重要地位发展历史与趋势回顾生物分离技术的发展历程，分析当前研究热点与未来发展方向工程特点与原理讲解生物分离工程的特殊性和技术原理，为后续各章节内容奠定基础工艺路线设计介绍生物分离工艺路线设计的一般方法和评价体系，培养工程思维本章作为整个课程的导论部分，旨在帮助学生建立对生物分离工程的整体认知通过对基本概念、发展历史、技术特点和工艺设计原则的系统介绍，使学生对所要学习的内容有一个清晰的认识和全面的把握掌握这一章的内容，将有助于学生理解后续各种具体分离技术的地位和作用，形成科学的知识体系和方法论，为深入学习打下坚实基础生物分离工程的定义与范围

1.1核心概念学科地位生物分离工程是研究和应用各种物理、化学作为生物工程的重要分支，生物分离工程处和生物学原理与方法，从复杂生物体系中分于产业链的中游环节，直接决定着产品的质离、纯化和精制目标产物的科学与技术它量与成本在现代生物产业中，分离纯化成是连接上游发酵与下游产品开发的桥梁，也本通常占总生产成本的，是技术60%-80%是生物产品商业化生产的关键环节难度最高、投入最大的环节之一交叉关系生物分离工程与化学工程、生物化学、材料科学等多学科密切相关它借鉴了化工分离的基本原理，结合生物大分子的特殊性质，发展出一系列适用于生物产品的专门技术和方法生物分离工程的研究范围包括从微生物发酵液、植物与动物组织中分离各类生物活性物质，如酶、蛋白质、多糖、核酸、生物碱等随着生物技术的快速发展，其应用领域不断扩大，从传统的食品、医药行业扩展到能源、环保、材料等新兴领域了解生物分离工程的定义与范围，有助于我们把握这门学科的整体框架，认识其在生物工程中的核心地位，为后续学习奠定认知基础生物分离工程的特点

1.2分离对象复杂多样产品敏感性高生物分离工程所处理的对象包括蛋白质、核生物产品对温度、、剪切力等物理化学因pH酸、多糖、小分子活性物质等，成分复杂，素高度敏感，易变性失活，分离过程必须在性质各异，要求分离方法具有高度的选择性温和条件下进行，保持产品的生物活性和适应性工艺路线重要性多技术组合应用合理设计工艺路线对提高分离效率、降低成单一分离技术难以达到理想效果，通常需要本至关重要，需要综合考虑产品特性、技术多种技术的组合应用，形成完整的工艺流程，经济指标和工业化条件实现产品的逐级纯化与传统化工分离不同，生物分离工程面临的挑战更加复杂生物大分子结构精细、功能特异，对外界环境变化敏感；分离介质中杂质种类繁多，浓度差异大；同时还要考虑生物安全性和环境友好性理解生物分离工程的这些特点，有助于我们在学习具体技术方法时把握其应用的条件与限制，为工艺路线的合理设计和优化提供思路与依据生物技术发展史

1.31第一代生物技术年代1860-1940以传统发酵技术为代表，主要用于食品、酒精和有机酸生产路易巴斯德的研究奠定了现代生·物技术的基础，促进了微生物发酵的工业化应用2第二代生物技术抗生素时代始于年代，青霉素的工业化生产标志着抗生素时代的到来分离纯化技术得到迅速发展，1940微生物代谢产物的提取与纯化成为研究热点3第三代生物技术基因工程时代年代基因重组技术的出现引领生物技术革命重组蛋白、单克隆抗体等新型生物产品对分1970离纯化技术提出更高要求，促进了高分辨率色谱、膜分离等技术的发展4现代生物技术随着组学技术、合成生物学的发展，生物产品种类日益丰富，分离技术向高效、精准、绿色方向发展，新材料、新方法不断涌现纵观生物技术的发展历程，我们可以看到分离纯化技术与上游发酵技术、下游应用紧密互动、相互促进随着上游技术进步，产物浓度和复杂度不断提高，对分离纯化提出新挑战；而分离纯化技术的突破，又为新型生物产品的商业化铺平了道路了解生物技术的发展历史，有助于我们把握技术演进的脉络，理解当前分离工程面临的挑战和机遇，为未来发展趋势做出判断生物分离过程与单元操作

1.4分离基本原理常见单元操作工程放大与应用生物分离过程基于物质在物理性质、化学性生物分离工程中的单元操作可分为以下几类从实验室到工业生产的放大过程需要考虑多质或生物特性上的差异，如大小、形状、密种因素度、电荷、疏水性、生物亲和性等通过放固液分离过滤、离心、沉降设备尺寸与材质选择••大这些差异，实现目标产物的选择性分离细胞破碎物理破碎、化学裂解操作参数优化与控制••分子分离沉淀、萃取、吸附能耗与成本平衡••物理分离基于物理性质差异•高分辨分离各类色谱技术合规性与质量控制••GMP化学分离利用化学反应或相互作用•浓缩与纯化膜分离、结晶、干燥环境因素与安全评估••生物分离基于生物特异性识别•在完整的生物分离工艺中，各单元操作并非孤立存在，而是相互关联、层层递进上一步操作的效果直接影响下一步的效率，因此需要从整体角度考虑工艺路线的设计与优化，实现全局最优熟悉各种单元操作的原理、特点及适用条件，是掌握生物分离工程的基础通过系统学习，我们将能够针对不同的分离对象，选择合适的单元操作组合，设计出高效、经济的分离工艺生物分离工艺路线设计

1.5目标产物分析确定产物物理化学性质、稳定性条件、纯度要求和价值，分析原料成分特点和主要杂质性质，为工艺设计提供基础数据候选路线构建基于分离原理和单元操作选择适合的技术组合，构建多个可行的工艺路线方案，考虑技术兼容性和顺序合理性实验验证与优化通过小试实验验证各路线的可行性，优化关键工艺参数，评估产品收率、纯度和活性，筛选最佳工艺路线技术经济评价综合考虑工艺技术指标和经济指标，包括产品收率、纯度、活性，以及设备投资、原材料成本、能耗、操作难度等因素，确定最终工艺路线生物分离工艺路线设计是一个系统工程，需要综合考虑多种因素除了技术可行性和经济性外，还需关注工艺的稳定性、可靠性、安全性和环境友好性在实际工业生产中，往往需要在多个目标之间寻求最佳平衡点随着计算机技术的发展，工艺模拟和优化软件在分离工艺设计中发挥着越来越重要的作用通过数据分析和模型预测，可以减少实验工作量，加速工艺开发进程，提高设计的科学性和准确性第二章发酵液的预处理发酵液特性分析了解不同发酵液的组成特点和物理化学性质固液分离技术掌握过滤、沉降和离心等基本分离方法絮凝与澄清应用絮凝技术提高固液分离效率工艺优化设计针对不同产品设计最优预处理方案发酵液预处理是整个生物分离工艺的第一步，也是至关重要的一步发酵液通常含有各种细胞、细胞碎片、未消耗的培养基成分以及细胞代谢产物，组成极为复杂高效、合理的预处理不仅可以提高目标产物的分离效率，还能显著延长后续分离设备的使用寿命，降低整体生产成本本章将系统介绍发酵液的常见特性和预处理原理，详细讲解固液分离、絮凝澄清等核心技术，并通过实际案例分析，帮助学生掌握发酵液预处理的工艺设计方法和操作要点，为后续的分离纯化奠定基础发酵液的特性

2.1发酵类型主要成分物理特性预处理难点细菌发酵液细菌菌体、胞外蛋白、浑浊度高、黏度适中菌体小、数量多、沉多糖、小分子代谢物降性差真菌发酵液菌丝体、孢子、酶类、黏度高、存在菌丝团滤饼压缩性强、易堵有机酸塞滤材酵母发酵液酵母菌体、胞内外蛋密度较大、沉降性好菌体与可溶性产物分白、糖类离动物细胞培养液细胞、重组蛋白、生透明度高、颗粒少细胞易破碎、产物浓长因子、血清成分度低发酵液的特性直接影响预处理方法的选择和效果不同微生物的发酵液在组成和物理化学性质上存在显著差异以细菌发酵液为例，由于细菌个体小（通常为），数量多，沉降性差，通常需要采用高

0.5-5μm速离心或添加絮凝剂辅助分离；而丝状真菌的发酵液由于存在菌丝网络结构，黏度较高，过滤时容易形成压缩性滤饼，降低过滤效率此外，发酵液的值、盐浓度、表面活性物质含量等因素也会影响预处理效果例如，某些菌株产生的pH表面活性物质会导致发酵液起泡严重，影响固液分离；而高盐浓度可能改变蛋白质的溶解度，导致非特异性沉淀了解这些特性，对于选择合适的预处理方法和优化工艺参数至关重要固液分离技术

2.2过滤技术利用多孔材料截留固体颗粒，常见设备包括板框过滤器、转鼓过滤器、叶片过滤器等适用于固体颗粒较大，液体黏度较低的发酵液，如酵母菌体分离沉降技术利用重力作用使密度大于液体的固体颗粒下沉，适用于固体含量低、颗粒密度大的体系具有设备简单、能耗低的优点，但分离效率有限，常用于预澄清离心分离通过离心力加速固液分离过程，设备包括管式离心机、碟片式离心机和螺旋卸料离心机等适用于细菌、酵母等微生物菌体的分离，效率高但能耗较大固液分离技术的选择需要综合考虑发酵液的特性、目标产物的位置（胞内或胞外）、处理量、分离效率和成本等因素对于产物在胞外的情况，如酶制剂生产，主要目的是去除菌体，可选用过滤或离心方法；对于胞内产物，如某些重组蛋白，则需要首先回收菌体，再进行破碎处理在实际工业生产中，往往需要结合使用多种固液分离技术，如先通过沉降或粗过滤降低悬浮物含量，再进行精密过滤或高效离心，以达到最佳分离效果同时，还需注意过程控制，防止剪切力、温度升高等因素导致产物变性或活性损失絮凝技术

2.3絮凝机理絮凝剂类型絮凝是通过添加絮凝剂，中和或减弱颗粒表面电荷，降低颗粒间排根据化学性质，絮凝剂可分为无机絮凝剂和有机絮凝剂两大类斥力，使微小颗粒聚集形成较大絮体的过程絮凝可显著提高后续无机絮凝剂铝盐、铁盐、钙盐等•固液分离的效率，是发酵液预处理的重要手段有机絮凝剂聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺等•电荷中和降低颗粒表面电位•复合絮凝剂多种絮凝剂的组合•架桥作用高分子链连接多个颗粒•生物絮凝剂壳聚糖、微生物产生的多糖等•网捕效应形成三维网状结构•絮凝技术的应用需要优化多个工艺参数，包括絮凝剂的选择、添加量、加入方式、反应值、搅拌强度和时间等在生物产品分离中，需pH特别注意絮凝剂的生物相容性和对后续纯化步骤的影响例如，某些金属离子可能导致蛋白质变性或抑制酶活性，应避免使用近年来，随着环保要求的提高，生物可降解絮凝剂得到越来越多的关注这些絮凝剂来源于天然产物，如壳聚糖、海藻酸盐，或微生物发酵产物，具有低毒性、可生物降解的特点，适合用于食品、医药等领域的生物产品分离然而，其絮凝效率和成本仍需进一步优化，是当前研究的热点方向之一预处理工艺实例

2.4抗生素发酵液预处理酶制剂发酵液预处理以青霉素发酵液为例，典型工艺路线包括以工业淀粉酶生产为例，常用工艺包括添加助滤剂（珍珠岩或硅藻土）添加聚丙烯酰胺絮凝剂

1.

1.离心或转鼓真空过滤去除菌丝体板框过滤分离菌体

2.

2.调节至酸性条件下萃取分离硫酸铵盐析浓缩粗酶

3.pH

3.碳处理脱色与吸附杂质低温保存，防止酶活损失

4.

4.微生物菌体预处理以单细胞蛋白生产为例，工艺步骤为连续离心收集菌体

1.清水洗涤去除培养基残留

2.热处理或化学处理降解核酸

3.喷雾干燥制成终产品

4.不同类型的生物产品，由于其物理化学性质和应用要求的差异，预处理工艺也各不相同预处理效果的评价通常包括清液的透光率、固体回收率、目标产物的回收率和活性保留率等指标通过这些指标的综合分析，可以优化预处理工艺，提高整体分离效率需要注意的是，预处理工艺的选择不仅要考虑分离效果，还需兼顾经济性和可行性例如，虽然离心分离效率高，但设备投资和能耗较大，适用于高附加值产品；而对于普通产品，可能需要考虑采用成本较低的过滤或絮凝沉降技术此外，预处理过程中添加的助剂是否会影响产品质量和后续分离步骤，也是工艺设计时必须考虑的因素第三章细胞的分离菌体特性分析离心分离技术1了解微生物细胞的大小、形态和表面特性掌握各类离心设备的原理和应用工艺设计与优化过滤分离方法综合考虑技术与经济因素选择最佳方案学习不同过滤技术及其适用条件细胞分离是生物分离工程中的关键环节，无论是回收产物位于细胞内的微生物菌体，还是去除发酵液中的细胞以获取胞外产物，都需要高效的细胞分离技术本章将系统介绍细胞分离的基本原理和主要方法，帮助学生掌握离心分离和过滤分离两大核心技术通过学习这一章节，学生将了解不同类型细胞的分离特点，掌握各种分离设备的工作原理和操作要点，能够根据具体应用场景选择合适的分离方法，并优化工艺参数以提高分离效率同时，还将通过案例分析，深入理解细胞分离在生物制药、食品工业、环境工程等领域的实际应用，培养解决实际工程问题的能力菌体回收技术

3.

10.5-5μm5-10μm细菌尺寸酵母尺寸细菌细胞直径一般在之间，形态多样，包括球形、杆状和螺旋形等酵母细胞通常比细菌大，直径在左右，多为椭圆形或球形

0.5-5μm5-10μm20-50μm10-25μm真菌尺寸动物细胞丝状真菌可形成直径达的菌丝团，形态不规则，结构复杂动物细胞直径一般在之间，无细胞壁，结构脆弱，易受剪切力破坏20-50μm10-25μm菌体回收技术的选择主要基于微生物的大小、形态、密度以及发酵液的体积和特性对于细菌等小型微生物，通常采用高速离心法；对于丝状真菌，则更适合使用过滤方法；而酵母细胞由于密度较大，既可以采用离心法也可以用过滤法在工业生产中，还需考虑设备投资、运行成本和处理能力等因素影响菌体回收效率的关键参数包括离心力场强度（值）、离心时间、过滤介质孔径、过滤压差、过滤助剂类型及添加量等对于产物在胞内的发酵工艺，菌体回收率直接影响最终产品的得率；而对G于胞外产物，则需要关注分离后清液的澄清度和产物的回收率通过优化这些参数，可以显著提高分离效率，降低生产成本连续离心分离

3.2连续离心分离原理常用连续离心设备连续离心分离是利用离心力场使密度不同的物质分层或分离的技术工业上常用的连续离心机主要有以下几种类型在旋转的离心筒中，密度较大的固体颗粒（如微生物细胞）在离心力管式离心机结构简单，适用于低固体含量、颗粒较大的发酵液•作用下向外移动，聚集在转鼓壁上，而密度较小的液体则保持在内层，碟片式离心机分离效率高，广泛用于各类微生物分离通过不同的出口分别排出•螺旋卸料离心机可连续排出固体，适用于高固体含量物料•连续离心的工作效率由分离因数决定，它与转鼓直径、转速和有效Σ多室式离心机适合需要多次洗涤的菌体回收•沉降面积有关提高转速是增加分离效率的有效手段，但同时也会增加能耗和设备要求连续离心技术在生物分离工程中应用广泛，特别适合大规模生产线的微生物菌体回收以碟片式离心机为例，它通过叠放多层锥形碟片，大大增加了有效沉降面积，提高了分离效率现代碟片式离心机转速可达，处理能力可达，广泛应用于酵母、细6000-8000rpm10-100m³/h菌等微生物分离在操作连续离心机时，需要注意控制进料速率和温度，避免卡机或菌体破碎同时，由于离心过程中存在较强的剪切力，对某些敏感性产物可能造成损伤，如某些重组蛋白或易破碎的动物细胞，因此需要选择合适的转速和操作方式，平衡分离效率与产物稳定性此外，离心过程产生的热量也需要通过冷却系统进行控制，防止产物变性过滤设备与技术

3.3板框过滤器真空转鼓过滤机精密过滤技术由多层滤板和滤框交替叠放组成，中间夹有滤布具利用真空负压使液体通过滤布而固体被截留在滤布表使用孔径均匀的膜材料，如聚丙烯、聚醚砜膜等，可有结构简单、操作方便、适应性强等优点，适用于固面特点是连续操作，适用于大批量生产，但设备复实现微米级甚至亚微米级的分离广泛用于菌液澄清、体含量较高的物料缺点是操作间歇性，劳动强度大，杂，滤饼洗涤效果较差广泛应用于抗生素菌丝体、除菌过滤和生物制品的终端过滤，确保产品的无菌性现代自动化水平逐渐提高淀粉、纤维素等物料的分离和安全性过滤技术的选择需要考虑多种因素，包括物料性质、处理量、过滤介质特性等例如，对于丝状真菌发酵液，由于菌丝形成的滤饼具有一定的多孔性，适合采用深层过滤技术；而对于细菌发酵液，由于颗粒小且密集，采用表面过滤更为合适在过滤工艺设计中，需要注意控制压差的变化和滤饼的形成过程过高的压差可能导致滤饼压实，降低过滤速率；而添加助滤剂如硅藻土、珍珠岩等，可以形成疏松多孔的滤饼结构，提高过滤效率此外，现代过滤技术越来越注重自动化和连续化，如交替使用的双联过滤系统、连续转盘过滤机等，可以显著提高生产效率细胞分离工艺案例

3.4动物细胞分离酵母菌分离重组蛋白生产中的细胞分离，采用低速离心（）避免细酿酒酵母的回收利用连续离心技术，转速控制在，可达CHO1000-2000G4000-5000rpm胞破碎，配合微滤膜澄清，实现细胞与产物的高效分离，保持蛋白活性以上的回收率，分离后的酵母可直接回用于发酵过程，提高生产效率95%细菌分离藻类细胞分离乳酸菌制品生产中，采用碟片式离心机（）加微滤相结合的螺旋藻等微藻生物质收获采用多级分离工艺先通过絮凝浓缩，再使用板框6000-8000G方法，实现高密度菌体的高效回收，保证菌体活性和产品品质过滤，最后经喷雾干燥，实现高效率、低能耗的生物质回收不同类型的细胞由于其特性差异，分离工艺也各不相同例如，动物细胞由于缺乏细胞壁，结构脆弱，分离过程需要特别注意控制剪切力和温度；而丝状真菌由于形成菌丝网络，过滤效果往往优于离心工艺选择需要综合考虑细胞特性、产物位置、分离效率和成本等多重因素现代细胞分离技术正朝着高效、连续、自动化方向发展例如，膜过滤与离心技术的结合、切向流过滤技术的应用、基于密度梯度的细胞分选等，不断提高分离效率和产品质量同时，随着一次性技术的发展，一次性离心袋、一次性过滤系统等也在生物制药领域得到广泛应用，简化操作流程，降低交叉污染风险第四章细胞的破碎1细胞结构与破碎原理了解不同微生物细胞壁的组成特点和破碎机制物理破碎方法掌握各种物理破碎技术的原理、设备和应用化学与生物破碎研究利用化学试剂和酶解方法实现细胞温和破碎工艺优化与放大探索实验室技术向工业化生产的转化方法细胞破碎是获取胞内产物的关键步骤，其目的是在最大限度保持目标产物活性的前提下，高效释放胞内物质不同类型的微生物细胞壁结构差异很大，导致其破碎难度和适用方法也不同例如，革兰氏阴性菌的细胞壁相对较薄，易于破碎；而革兰氏阳性菌则含有较厚的肽聚糖层，破碎难度更大本章将系统介绍细胞破碎的基本原理和主要方法，包括物理、化学和生物三大类破碎技术通过学习，学生将能够根据不同微生物的特点和产物性质，选择合适的破碎方法，优化破碎工艺参数，并解决从实验室到工业化放大过程中的技术难题，为后续的分离纯化奠定基础细胞结构与破碎原理

4.1革兰氏阳性菌细胞壁主要由多层肽聚糖组成，厚度在，结构致密，破碎难度大典型代表包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等常需要高强度的物理破碎方法或特异性的酶切降解才能有效破壁20-80nm革兰氏阴性菌细胞壁由薄层肽聚糖和外膜组成，厚度约，结构相对脆弱典型代表有大肠杆菌、假单胞菌等可采用相对温和的物理方法或化学试剂破碎，易于释放胞内物质2-10nm酵母真菌细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和几丁质组成，厚度，韧性强，弹性好酵母和部分单细胞真菌属于此类通常需要结合机械力和酶解方法才能高效破碎100-200nm细胞破碎的效率评价主要通过以下指标破碎率（通过显微镜计数或比浊法测定）、蛋白释放率（通过测定上清液中蛋白含量计算）、目标产物释放率（通过特定的活性测定方法）理想的破碎方法应当在高破碎率的同时，保持目标产物的活性和结构完整性破碎方法的选择需要综合考虑多种因素细胞类型和壁结构特点、目标产物的性质和稳定性、破碎规模和设备可获得性、下游分离纯化工艺等例如，对于热敏感性蛋白，应避免产生过多热量的破碎方法；对于易氧化的产物，应在厌氧或还原条件下进行破碎；对于易受蛋白酶降解的产品，破碎过程可能需要添加蛋白酶抑制剂或在低温条件下进行物理破碎方法

4.2超声波破碎利用声波在液体中产生的空化效应破碎细胞特点是操作简便，适用于小规模处理和实验室研究破碎过程中产生热量大，需要冰浴冷却；处理量有限，功率随体积增加而衰减，不易放大高压均质破碎通过高压泵将细胞悬浮液加压到，然后通过窄小的喷嘴释放，产生强烈的剪切力和冲击力广泛50-150MPa应用于工业化生产，效率高，易于放大，但能耗大，设备投资高机械研磨破碎借助珠磨机、砂磨机等设备，利用填料（如玻璃珠、氧化锆珠）与细胞的摩擦和剪切作用实现破碎适用于高密度细胞悬浮液，效率高，但填料磨损可能引入杂质冻融破碎通过反复冻结和融化，使细胞内形成冰晶，导致细胞膜和细胞壁破裂方法温和，适用于易变性产物，但效率低，主要用于实验室小规模处理或辅助其他破碎方法物理破碎方法中，高压均质和珠磨破碎是工业规模下最常用的两种技术高压均质破碎对革兰氏阴性菌如大肠杆菌效果显著，通常次通过可达到以上的破碎率；珠磨破碎则特别适合酵母等真菌的破壁，在正确的操作条件下，破碎1-380%率可达以上95%物理破碎过程中需要控制的关键参数包括悬浮液浓度、破碎强度（如压力、功率）、破碎时间、温度控制等过高的细胞浓度可能降低破碎效率；过长的处理时间或过高的强度虽然提高破碎率，但也可能导致产物变性失活；温度控制不当则可能加速产物降解因此，需要根据具体产物特性和稳定性条件，优化破碎参数，平衡破碎效率与产物活性保留化学与生物破碎方法

4.3碱处理破壁酶解破壁表面活性剂溶解利用碱性条件（通常）使细胞壁成分水利用特定的水解酶（如溶菌酶、纤维素酶、几使用离子型或非离子型表面活性剂（如、pH11SDS解或溶解，细胞膜磷脂发生皂化反应主要用丁质酶等）选择性降解细胞壁组分，导致细胞）溶解细胞膜脂质结构，释放Triton X-100于蛋白质提取，特别是对碱稳定的蛋白裂解胞内物质优点操作简单，成本低，易于放大优点条件温和，选择性高，产物活性保优点操作简便，效果确定，适用多种细•••留好胞缺点条件苛刻，可能导致产物变性•缺点成本高，处理时间长，放大困难缺点可能干扰后续分离，影响某些蛋白应用常用于质粒提取或碱稳定酶的•••DNA活性分离应用实验室研究和高值产品小规模生产•应用广泛用于蛋白质和核酸提取•化学与生物破碎方法相比物理方法，通常条件更为温和，能耗更低，适合处理敏感性产物但这些方法也存在一定局限性，如破碎时间长、成本高、引入额外杂质等为克服这些缺点，实际应用中常将化学或生物方法与物理方法结合使用，如先酶解削弱细胞壁，再进行温和的物理破碎，既提高效率又保护产物活性特别值得注意的是渗透破碎技术，它利用细胞内外渗透压差导致细胞破裂，常用于原生质体制备和某些敏感蛋白的温和提取例如，通过在等渗条件下培养细胞，然后突然转入低渗环境，使细胞吸水膨胀破裂这种方法虽然效率不高，但对产物活性保护最好，适合实验室研究和特殊产品的小规模制备破碎工艺优化与放大

4.4实验室破碎评价在小规模条件下测试不同破碎方法的效果，确定最适合的破碎原理和初步参数评价指标包括破碎率、产物释放率、活性保留率、杂质生成情况等中试参数优化将实验室方法放大到中试规模，优化关键工艺参数对于高压均质，需优化压力、通过次数和悬浮液浓度；对于珠磨，需确定珠子规格、填充率、转速和停留时间工业化实施考虑设备投资、运行成本、操作便利性和安全性等因素，确定最终工业化方案解决连续化生产、在线监测、清洗验证等实际问题，确保工艺稳定可靠从实验室到工业化的破碎工艺放大面临诸多挑战首先是热效应控制，大规模破碎产生的热量远超实验室水平，需要设计高效的冷却系统；其次是剪切力分布，大型设备中的流体动力学特性与小型设备差异明显，需要调整操作参数；此外，连续运行状态下的稳定性、清洗方便性和设备密封性等工程问题也需要解决破碎度的评价方法随规模变化也需要调整实验室常用的显微镜计数在工业化生产中难以实施，通常采用在线浊度测量、蛋白快速定量或目标产物活性测定等方法进行过程监控同时，还需考虑蛋白质氧化和蛋白酶降解等问题，通过添加还原剂、蛋白酶抑制剂或调整值等措施，最大限度保护目标产物现代生pH物分离工程正致力于开发更高效、更温和、更易于放大的破碎技术，并结合自动化控制和在线监测，提高工艺的可控性和重现性第五章沉淀分离沉淀基本原理掌握溶解度与沉淀形成的物理化学基础等电点沉淀了解蛋白质等电点及其调控技术pH盐析沉淀研究盐离子浓度对蛋白溶解度的影响有机溶剂沉淀掌握醇类等有机试剂的沉淀作用原理沉淀分离是生物分离工程中应用最广泛的技术之一，具有操作简单、处理量大、成本低廉的优点，常用作蛋白质和其他生物大分子初步分离和富集的手段通过改变溶液环境，如值、盐浓度或有机溶剂比例，使目标物质的溶解度降低而沉淀出来，从而实现与杂质的初步分离pH本章将系统介绍沉淀分离的理论基础，重点讲解等电点沉淀、盐析沉淀和有机溶剂沉淀三种主要方法通过学习，学生将理解影响蛋白质和其他生物分子溶解度的关键因素，掌握各种沉淀技术的原理和应用条件，能够针对不同类型的生物分子，设计合理的沉淀分离工艺，为后续的高分辨率分离奠定基础沉淀原理

5.1溶解度与结晶原理沉淀过程动力学溶解度是指物质在特定条件下能够溶解的最大量沉淀过程包括成核和生长两个阶段成核是沉淀当溶液中溶质浓度超过其溶解度时，体系处于过形成的起始步骤，需要克服一定的能垒；生长则饱和状态，溶质会以结晶或非晶体沉淀形式析出是已形成核心不断聚集溶质分子的过程沉淀的生物大分子如蛋白质的溶解度受多种因素影响，速率、形态和性质与成核速率和生长速率的相对包括温度、值、离子强度、有机溶剂含量等关系密切相关快速成核往往形成非晶态沉淀，pH而慢速成核和适当生长则有利于形成结晶沉淀沉淀在分离中的应用沉淀技术在生物分离中主要用于以下几个方面初步分离和富集目标产物，去除大部分杂质；调节产品浓度，便于后续处理；稳定易变性产物，延长保存时间；制备特定形态的终产品，如晶体酶制剂通过选择合适的沉淀条件，可以实现选择性沉淀，提高分离效率影响生物大分子沉淀的关键因素包括分子表面电荷分布（与相关）、分子表面疏水性（与离子强度和有pH机溶剂相关）、分子间相互作用（如氢键、疏水作用、静电作用）以及环境条件（温度、搅拌等）理解这些因素的作用机制，是设计有效沉淀工艺的基础在实际应用中，沉淀过程的操作参数控制至关重要例如，沉淀剂的添加速率影响核形成速率，进而影响沉淀的结构和性能；搅拌强度影响局部浓度梯度和颗粒碰撞频率；温度则影响溶解度和分子运动速率通过优化这些参数，可以提高沉淀的选择性和回收率，改善沉淀物的物理性质，便于后续的固液分离和处理等电点沉淀

5.2盐析沉淀

5.3盐析是基于盐离子浓度增加导致蛋白质溶解度降低的现象，被广泛应用于蛋白质初步分离其机理可用盐析出理论解释高浓度盐离子与水分子结合，减少可用于水合蛋白质分子的水，同时增加溶液疏水性，促使蛋白质暴露的疏水区域相互作用，形成聚集体而沉淀硫酸铵是最常用的盐析试剂，具有溶解度高、密度大、稳定性好等优点在工业应用中，常采用分级盐析技术，即逐步增加盐浓度，依次沉淀出不同蛋白质例如，在抗体纯化中，饱和度硫酸铵可沉淀大部分杂蛋白，而饱和度则可回收目标抗体盐析操作中需控制30-40%50-70%盐的添加速率、温度和值，确保沉淀的选择性和回收率沉淀后的蛋白质通常保持活性，但需通过透析或凝胶过滤去除高浓度盐离子近年pH来，氯化钠、磷酸盐等其他盐类也在特定应用中得到使用，以满足不同蛋白质的分离需求有机溶剂沉淀

5.4有机溶剂类型沉淀机理与影响因素常用的有机溶剂包括有机溶剂降低溶液介电常数，减弱水对蛋白质的水合作用，同时增强蛋白质分子间的静电相互作用，促使蛋白质聚集沉淀影响沉淀效果的主要因乙醇应用最广泛，价格适中•素包括丙酮挥发性强，易回收•溶剂浓度通常•20-50%v/v甲醇成本低但毒性较高•温度低温（℃）有利于保持活性•0-5异丙醇对某些蛋白质选择性好•值通常在等电点附近效果最佳•pH不同溶剂的介电常数、疏水性和氢键形成能力不同，导致沉淀效果存在差离子强度适当的盐浓度可增强效果•异蛋白质浓度高浓度有利于沉淀形成•有机溶剂沉淀在工业生产中应用广泛，特别是在血浆蛋白分离、酶制剂生产等领域例如，分级沉淀法使用不同浓度的乙醇在不同和温度条件下，Cohn pH依次分离出白蛋白、球蛋白等多种血浆蛋白，是血液制品工业的基础工艺然而，有机溶剂可能导致某些蛋白质变性，特别是在室温条件下，因此操作中需严格控制温度，通常在℃以下进行0在安全与环保方面，有机溶剂的易燃性、毒性及挥发性需要特别关注工业生产中应采取密闭操作、防爆设备、溶剂回收等措施，降低安全风险和环境影响随着绿色化学理念的发展，生物可降解溶剂和超临界流体等新型沉淀介质正在研究中，以期替代传统有机溶剂，提高生物分离过程的安全性和环境友好性第六章膜分离技术膜分离基础掌握膜分离的基本原理和分类微滤与超滤了解微滤和超滤技术的特点与应用纳滤与反渗透研究高压膜分离技术的原理与工艺新型膜技术探索膜分离领域的创新技术与发展膜分离技术是现代生物分离工程中应用最广泛的技术之一，它利用半透膜作为选择性屏障，在外力驱动下实现不同组分的分离、纯化和浓缩与传统分离方法相比，膜分离具有能耗低、条件温和、操作简便、易于放大等显著优势，特别适合生物活性物质的分离处理本章将系统介绍膜分离技术的基础理论和应用实践，从微滤、超滤等基础技术到纳滤、反渗透等高级应用，再到膜生物反应器、电渗析等新型技术，全面展示膜分离在生物工程领域的应用前景通过学习，学生将掌握不同膜分离技术的特点和适用条件，了解膜污染及其控制方法，能够针对具体分离对象选择合适的膜分离技术，并设计优化工艺参数膜分离基本原理

6.1微滤孔径

10.1-10μm超滤2孔径1-100nm纳滤孔径

0.5-5nm反渗透孔径

0.5nm膜分离技术基于膜对不同组分的选择透过性，根据膜孔径大小和分离机制可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透等类型微滤主要用于分离细菌、酵母等微生物和大颗粒悬浮物；超滤可截留蛋白质、多糖等大分子，允许盐类和小分子通过；纳滤能够分离二价离子和分子量的有机物；反渗透则可拦截几乎所有溶质，只允许水分子通过300-1000Da膜分离的驱动力通常是压力差，但也包括浓度差（渗透）、电位差（电渗析）等膜材料种类丰富，包括聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素等有机膜，以及陶瓷、金属等无机膜不同材料具有不同的物理化学性质，如机械强度、耐热性、耐化学性和生物相容性等，应根据分离对象和工艺条件选择合适的膜材料膜组件的结构形式主要有平板式、卷式、管式和中空纤维式四种，各有优缺点，适用于不同的分离场景微滤与超滤

6.2微滤技术超滤技术微滤是利用孔径为的微孔膜，在压力差（通常）驱动超滤使用孔径为的膜，在较高压力（通常）下分离

0.1-10μm2bar1-100nm2-10bar下分离微粒、细菌等悬浮物的过程微滤膜通常采用对称结构，主要通过大分子物质，如蛋白质、多糖等超滤膜多采用非对称结构，具有较高的筛分效应进行分离渗透通量微滤的主要应用包括超滤的主要应用包括发酵液澄清与菌体分离蛋白质溶液的浓缩与纯化••生物制品的除菌过滤酶制剂的分离与精制••环境样品的微生物检测血液制品的分馏与纯化••饮用水与饮料的澄清处理发酵产物的收集与浓缩••微滤和超滤过程中的关键操作参数包括膜材料选择、跨膜压差、流速、温度和值等这些参数直接影响分离效率、通量和膜寿命例如，在蛋白质pH超滤中，需要选择适当的截留分子量，确保目标蛋白被截留而杂质通过；同时控制压差防止蛋白质在膜表面过度浓缩形成凝胶层；调整值和MWCO pH离子强度避免蛋白质沉淀或吸附膜组件的设计也至关重要工业上常用的膜组件包括平板式（结构简单，易于清洗，但密度低）；卷式（密度高，但易堵塞）；中空纤维（密度最高，造价低，但不耐高压）；管式（抗污染能力强，但造价高）应根据物料特性和工艺要求选择合适的膜组件此外，流动方式也影响分离效果，传统的死端过滤易造成膜污染，而错流过滤（切向流过滤）通过高速流动减少浓差极化和膜污染，提高分离效率，是现代生物分离的首选方式纳滤与反渗透

6.3纳滤技术特点反渗透原理与应用纳滤是介于超滤和反渗透之间的膜分离技术，反渗透是使用孔径小于的致密膜，

0.5nm孔径通常在之间，可截留分子量在高于渗透压的压力驱动下（通常

0.5-5nm20-为的溶质纳滤膜具有电荷），逆转自然渗透过程，实现溶剂200-1000Da100bar选择性，能有效分离一价和二价离子，被称（通常是水）与溶质的分离广泛应用于海为软化膜操作压力一般为，水淡化、纯水制备、废水处理和生物制品浓5-20bar低于反渗透但高于超滤缩等领域膜污染与控制膜污染是纳滤和反渗透过程中的主要挑战，包括无机垢、有机污染、生物污染和颗粒污染控制方法包括预处理（过滤、加药）、优化操作条件（错流速度、压力）、定期清洗（化学清洗、物理冲洗）和膜表面改性等纳滤和反渗透在生物分离中具有独特优势例如，在抗生素生产中，纳滤可用于去除发酵液中的盐类和小分子杂质，同时保留目标抗生素；在生物制药行业，反渗透常用于小分子药物的浓缩和盐类脱除与传统蒸发浓缩相比，膜分离能耗低、条件温和，特别适合热敏感性生物产品工业应用中，纳滤和反渗透通常采用卷式膜组件，由于其紧凑性和高膜面积体积比系统设计需考虑预/处理单元、高压泵、膜组件、能量回收装置和清洗系统等近年来，抗污染膜材料、低能耗膜工艺和智能控制系统等新技术不断涌现，进一步提高了纳滤和反渗透的分离效率和经济性例如，复合薄膜技术通过在多孔支撑层上涂覆超薄分离层，兼具高通量和高选择性；而能量回收装置可回收高压浓缩液中的压力能，显著降低能耗膜分离新技术

6.4膜生物反应器膜生物反应器结合了生物降解和膜分离技术，通过膜组件替代传统二沉池，实现生物处理单元与固液分离的一体化它可以保持高浓度活性污泥，提高处理效率，减少占地面积在生物制药、酶催化反应和MBR环境工程领域应用广泛电渗析技术电渗析利用离子交换膜在电场驱动下实现离子的选择性分离它由阳离子交换膜和阴离子交换膜交替排列，形成多个隔室在电位差作用下，正负离子向相反方向迁移，被相应的离子交换膜阻挡，从而实现脱盐或浓缩广泛应用于氨基酸、有机酸等离子型生物产品的分离纯化液膜技术液膜是一种含有载体的液态膜，可在两个不混溶的水相之间实现目标物质的选择性运输根据构型可分为体积液膜、乳液液膜和支撑液膜液膜技术具有高选择性、高富集系数和能耗低等优点，被用于金属离子、稀有元素和生物活性物质的选择性提取和富集除上述技术外，膜分离领域还出现了许多创新发展渗透蒸发结合膜分离和蒸发原理，可实现难分离混合物的高效分离；膜蒸馏利用膜两侧温度差产生的蒸气压差，实现水和有机物的分离；催化膜反应器将催化反应与分离过程结合，提高转化率和选择性这些新技术极大拓展了膜分离的应用范围未来膜分离技术的发展趋势包括新型膜材料的开发，如纳米复合膜、生物功能膜、仿生膜等；智能膜分离系统，结合传感器和人工智能技术实现实时监控和优化；绿色膜分离工艺，降低能耗和化学品使用，提高可持续性随着这些技术的不断成熟，膜分离将在生物医药、食品工业、环境保护等领域发挥越来越重要的作用，成为生物分离工程的核心技术之一第七章萃取分离萃取基本原理液液萃取超临界流体萃取-掌握分配系数与萃取效率的关系，学习经典液液萃取技术的设备与研究超临界等流体的特性，-CO2理解萃取过程的热力学与动力学基工艺，了解多级萃取与逆流萃取原掌握高效、环保的萃取新技术础理水相两相萃取探索水相两相系统的形成机制，应用于生物大分子的温和分离萃取分离技术是基于物质在两个不相互混溶的相之间分配系数差异而实现分离的方法与沉淀和膜分离相比，萃取具有选择性高、分离因子大、易于连续操作等优点，在生物分离工程中占有重要地位传统的液液萃取、-现代的超临界流体萃取和水相两相萃取等技术，为不同类型生物产品的分离提供了多种选择本章将系统介绍萃取分离的基本原理和主要技术，重点讲解萃取剂选择、萃取设备、工艺优化等关键问题通过学习，学生将掌握不同萃取技术的特点和适用条件，能够针对特定分离对象设计合理的萃取工艺，并解决实际应用中的技术难题特别是对生物活性物质分离中的温和、高效、环保萃取方法，将有深入了解，为后续实际工作打下基础萃取原理

7.1分配系数与萃取效率萃取剂选择与设备萃取分离基于物质在两相间的不同分配行为分配系数定义为物质在萃取相与原理想的萃取剂应具备以下特性K料相中平衡浓度之比萃取相原料相萃取效率表示单次萃取中被提取K=C/Cη对目标物有高选择性和分配系数•物质的百分比×，其中为萃取到萃取相中的物质量，η=mE/m0100%mE与原料相形成明显相界面为原料相中初始物质量•m0化学稳定性好，不与组分反应•影响分配系数的因素包括易于回收和再生•物质的化学性质（极性、解离状态）•无毒、不燃、环保、成本低•溶剂的性质（极性、氢键能力）•常见萃取设备类型温度（通常升高温度降低分配系数）•混合沉降器结构简单，适合相分离快的体系值（影响解离状态）•-•pH喷雾塔连续操作，设备简单，效率中等盐效应（改变水相活度）••填料塔提高相接触面积，增大传质效率•离心萃取器高效，相分离快，适合乳化体系•萃取过程的设计需考虑热力学和动力学因素从热力学角度，需选择具有高分配系数和选择性的萃取剂；从动力学角度，需考虑传质速率、相接触方式和停留时间等多级萃取可显著提高萃取效率理论上，次等量萃取的效率可表示为，其中为萃取相与原料相的体积比nη=1-1/1+EK^n E在生物分离中，由于生物活性物质的敏感性，萃取过程需特别注意控制温度、和界面剪切力等，防止产物变性失活同时，萃取剂的生物相容性和产品安全性也是重要pH考虑因素现代萃取技术越来越注重绿色、可持续理念，开发无毒、可生物降解的萃取剂，减少有机溶剂使用，降低环境影响液液萃取

7.2-单级萃取多级交叉萃取1原料相与萃取相混合到达平衡后分离，简单但效率有用新鲜萃取剂对初次萃取后的原料相进行再次萃取，限提高总回收率多级逆流萃取多级并流萃取原料相与萃取相逆向流动，实现最高萃取效率和最低原料相与萃取相同向流动，在多个萃取级中进行接触溶剂消耗和分离液液萃取是最传统也是应用最广泛的萃取技术，其核心是选择合适的萃取剂和优化萃取工艺以抗生素萃取为例，青霉素常采用正丁醇或异丁醇作萃取剂，在的条件下-pH2-3进行，此时青霉素以非解离形式存在，易溶于有机相；而四环素则可使用氯仿、乙酸丁酯等萃取，通过控制调节其在有机相和水相间的分配比pH工业规模的液液萃取通常采用连续多级逆流萃取，以提高效率和降低溶剂消耗常用设备包括喷雾塔、筛板塔、脉冲塔和离心萃取器等对于易形成乳状液的体系，如蛋白质溶-液的萃取，离心萃取器具有明显优势，可在高剪切力下实现快速相分离现代液液萃取技术越来越注重过程控制和自动化，通过在线监测和智能调控，实现萃取过程的精确控制，-提高产品质量的一致性同时，热力学模型和计算流体动力学模拟也被广泛应用于萃取工艺的优化设计，减少实验工作量，加速工艺开发进程超临界流体萃取

7.3℃31临界温度CO2超临界为最常用的超临界流体萃取介质，临界温度低，适合热敏感物质CO

27.38MPa临界压力CO2超过该压力且温度高于℃时，进入超临界状态，兼具气体扩散性和液体溶解能力31CO

20.40-

0.90密度范围g/cm³通过调节温度和压力可在此范围内改变超临界密度，控制溶解力和选择性CO2300-500bar典型操作压力生物活性物质萃取通常在此压力范围操作，平衡萃取效率和设备成本超临界流体萃取是利用超临界状态流体作为萃取剂的现代分离技术超临界流体具有接近液体的密度和溶解能力，同时保持接近气体的低黏度和高扩散系数，萃SFE取效率高尤其是超临界，具有无毒、不燃、化学惰性、临界条件温和等优点，被广泛应用于天然产物、生物活性成分的提取CO2工艺的关键参数包括压力、温度、流速和共溶剂添加压力增加会提高超临界流体密度和溶解能力；温度升高虽然降低密度，但可能增加溶质蒸气压，两者效应SFE相互竞争；添加少量极性共溶剂（如乙醇、水）可显著改变超临界的溶解特性，提高对极性物质的萃取能力在多种生物产品分离中表现优异，如天然香料CO2SFE提取、药用植物有效成分分离、高值脂质纯化等与传统溶剂萃取相比，产品纯度高、无溶剂残留、环境友好，符合绿色化学理念，是未来生物分离工程的重要SFE发展方向水相两相萃取

7.4水相两相系统组成盐体系萃取PEG-水相两相系统由两种水溶性聚合物聚乙二醇盐类系统是最常用的ATPS PEG-（如和葡聚糖）或一种聚合物和无机盐，具有成本低、相分离快的优点典PEG ATPS（如和磷酸盐）在水中达到一定浓度时型组成包括与磷酸盐、PEG PEG1000-8000自发形成的两个互不相溶的水相组成两相硫酸盐或柠檬酸盐等上相富含，下相PEG虽然都含有的水，但物理化学性富含盐蛋白质等生物分子会根据其表面性80-90%质差异显著，可用于生物分子分离质优先分配到某一相中分配规律与影响因素生物分子在中的分配受多种因素影响分子大小、表面电荷、疏水性；系统组成（聚合物类ATPS型和分子量、盐类型和浓度）；操作条件（值、温度、离子强度）通过调节这些参数可优化pH分离效果水相两相萃取的最大优势在于提供了一个全水环境，避免了有机溶剂可能导致的生物分子变性同时，由于两相界面张力低，剪切力小，特别适合分离敏感性蛋白质、酶、细胞器和细胞等在工业应用中，已成功用于重组蛋白的初步分离、多种酶制剂的纯化和细胞分选等领域ATPS近年来，水相两相萃取技术不断创新功能化通过在聚合物上连接特异性配体，提高目标分子的分ATPS配选择性；温度响应性聚合物系统可通过简单的温度调节实现相形成和相消失，便于产物回收；离子液体基结合了离子液体和的优点，拓展了分离应用范围这些新技术使水相两相萃取在生物分离ATPS ATPS领域的应用前景更加广阔然而，工艺放大和聚合物回收仍是需要解决的技术难题，影响其大规模ATPS工业应用第八章色谱分离色谱基本原理离子交换色谱分子排阻色谱了解色谱分离的基础理论和共性特点，掌握研究带电荷生物分子的分离方法，掌握阳离学习基于分子大小的分离技术，了解不同填色谱过程中的关键参数和评价指标，为后续子和阴离子交换色谱的原理与应用，了解梯料类型和选择标准，掌握操作条件优化和实各类色谱技术学习奠定基础度洗脱技术和工艺优化方法际应用要点亲和色谱工业色谱技术探索利用生物特异性识别的高选择性分离方法，研究配基设计和选择了解现代工业色谱技术的最新发展，包括模拟移动床技术、连续色谱原则，掌握洗脱条件优化和高纯度分离应用技术分离等，掌握从实验室到工业规模的放大设计方法色谱分离技术是生物分离工程中分辨率最高的方法，能够实现结构和性质极为相似的生物分子的有效分离它基于混合物中各组分在固定相和流动相之间分配系数的差异，通过多次分配平衡过程实现组分的分离在生物制药、蛋白质组学、基因组学等领域，色谱技术已成为不可或缺的核心分离手段本章将系统介绍色谱分离的基本原理和主要技术，包括离子交换、分子排阻、亲和色谱等经典方法，以及模拟移动床、连续色谱等现代工业技术通过学习，学生将掌握不同色谱技术的特点和应用范围，能够针对特定分离对象选择合适的色谱方法，优化分离条件，实现高效、高纯度的产品分离，为高附加值生物产品的制备奠定技术基础色谱分离基本原理

8.1色谱分离机理色谱分离分类色谱分离是基于混合物中各组分在固定相和流动相之间分配系数差根据分离机理，色谱可分为以下几类K异而实现分离的技术分配系数定义为组分在固定相和流动相中浓度之吸附色谱基于分子对固定相表面的吸附力差异•比组分沿色谱柱的迁移速度与其分配系数成反比，从K=Cs/Cm分配色谱基于分子在两个不混溶相中的溶解度差异而实现分离•离子交换色谱基于离子与离子交换剂的静电作用•分离效果通常用理论塔板数和分离度表示N Rs排阻色谱基于分子大小差异导致的扩散路径差异•，其中为保留时间，为峰宽•N=16tR/W²tR W亲和色谱基于分子间的特异性生物识别•，表示基线分离•Rs=2tR2-tR1/W1+W2Rs

1.5疏水作用色谱基于分子表面疏水性差异•色谱技术在生物分离中的地位不断提升，已成为高附加值生物产品分离纯化的核心技术相比其他分离方法，色谱具有分辨率高、选择性好、可操作性强等优点，能够实现结构极为相似的生物分子的分离，如单一氨基酸差异的蛋白质变体、序列差异仅一个碱基的寡核苷酸等DNA色谱填料是色谱分离的关键材料，其性能直接决定分离效果现代色谱填料主要包括硅胶基质和聚合物基质两大类，前者机械强度高，后者适应pH范围广根据粒径可分为常规填料、高效填料和超高效填料色谱设备从简单的重力柱到复杂的全自动高效液10-100μm3-10μm3μm相色谱仪，适应不同规模和精度要求的分离任务工业规模的色谱设备需考虑流动相分配均匀性、床层压力降、热效应控制等因素，确保分离效果的放大一致性离子交换色谱

8.2样品加载1调节样品和离子强度，使目标蛋白带有适当电荷，与离子交换基团结合，而部分杂质直接流出pH洗涤使用低离子强度缓冲液洗去弱结合的杂质，保留强结合的目标蛋白梯度洗脱逐渐增加盐浓度或改变值，使结合蛋白按结合强度顺序依次洗脱pH再生使用高盐或极端溶液洗脱所有结合物质，恢复树脂活性，准备下一次分离pH离子交换色谱是基于带电荷分子与相反电荷的固定相之间静电作用的分离技术，广泛应用于蛋白质、核酸、多肽等生物大分子的分离纯化根据固定相带电性质，可分为阳离子交换色谱吸附正电荷分子和阴离子交换色谱吸附IEX负电荷分子常用的阳离子交换基团包括磺酸基、羧基等；阴离子交换基团则包括季铵基、胺基等-SO3--COO--N+CH33-NH2的分离选择性主要受值影响，应根据目标蛋白的等电点选择合适的条件通常，在时带负电，适合阴离子交换实际操作中，常选择与相差个单位，既保证足够的结合强度，又避免蛋白变性梯度洗IEX pHpI pHpHpI pHpI

0.5-

1.5脱是的核心技术，可采用连续梯度或阶梯梯度，盐浓度通常从逐渐增加到左右离子强度增加会减弱静电作用，促使蛋白按结合强度顺序洗脱现代已广泛应用于单克隆抗体、重组蛋白、工业酶制剂等高值生物产品的纯IEX01M IEX化工艺中，已成为生物制药工业不可缺少的关键技术分子排阻色谱

8.3分子筛分原理填料类型与选择应用实例分子排阻色谱基于不同大小分子在多孔介质中扩散能填料主要包括葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等亲水性材广泛应用于蛋白质的纯化、多聚体与单体的分离、蛋白SEC SEC SEC力的差异进行分离大分子因无法进入填料孔隙而沿柱床空料，以及聚苯乙烯等疏水性材料选择填料时需考虑分离范复合物的分析、病毒纯化等领域例如，在单克隆抗-DNA隙快速流过，小分子则能进入填料孔隙，流动路径延长，滞围分子量排阻限、分辨率、化学稳定性和样品相容性不体纯化中，常用于去除聚集体和低分子杂质；在蛋白质SEC后流出因此，中组分按分子大小从大到小顺序洗脱，同填料具有不同的分离范围，如适合组学研究中，用于复杂混合物的预分级；在药物开发中，用SEC SephadexG-251-是唯一大分子先于小分子洗脱的色谱技术，适合分子量范围的分于评估蛋白质制剂的均一性和稳定性5kDa Superdex20010-600kDa离与其他色谱方法相比，具有条件温和、样品回收率高的优点，适合处理易变性的生物分子然而，由于其分离机理的限制，分辨率通常低于其他色谱方法，且样品浓度和体积对分离SEC效果有较大影响为获得最佳分离效果，样品体积通常应控制在柱床体积的以内2-5%在工业应用中，常作为精制步骤，用于去除聚集体、低分子杂质或实现缓冲液交换由于其稀释效应，工业规模通常需要后续浓缩步骤近年来，超高效技术通过使用小粒SECSECSEC径填料和高压系统，大幅提高了分离效率；而多维色谱技术则将与其他色谱方法联用，克服了单一方法的局限性，显著提高了复杂生物样品的分离能力随着生物制药工业的发展，SEC技术也在不断创新，朝着高分辨率、高通量和自动化方向发展SEC亲和色谱

8.4特异性识别原理配基设计与选择亲和色谱基于生物分子间特异性相互作用，如抗原配基是决定亲和色谱选择性的关键理想配基应具-抗体、酶抑制剂、受体配体等通过将特异性配有高特异性、适度亲和力、化学稳定性和可再生性--基偶联到固定相表面，可选择性捕获目标分子，实常用配基包括蛋白、抗体、金属螯合物、糖类、A/G现高纯度分离等DNA应用与发展洗脱条件优化亲和色谱广泛应用于抗体、酶、生长因子等高纯度洗脱通常通过改变、离子强度、加入竞争剂或变pH分离新型亲和技术如可控亲和介质、磁性亲和颗性剂等方式破坏特异性相互作用洗脱条件优化需粒等不断发展，提高了分离效率和便捷性平衡产物回收率和活性保留率亲和色谱是生物分离技术中选择性最高的方法，在单步操作中可实现数百至数千倍的纯化倍数蛋白亲和色谱是抗体纯化的黄金标准，可一步将抗体纯度从培养基中的A提高到而金属螯合亲和色谱则广泛用于带组氨酸标签的重组蛋白纯化，具有容量大、成本低的优势1%95%IMAC尽管亲和色谱选择性极高，但也面临一些挑战高成本限制了其大规模应用；生物配基的稳定性和寿命有限；非特异性吸附可能降低产品纯度；极端洗脱条件可能影响产物活性针对这些问题，研究人员开发了多种改进策略理性设计合成配基，提高稳定性和选择性；优化载体材料，减少非特异吸附；发展温和洗脱技术，如梯度和竞争pH性洗脱；使用可重复使用的亲和标签，降低成本随着生物制药产业的发展，亲和色谱技术将继续创新，为高纯度生物产品的制备提供更高效、更经济的解决方案工业色谱技术

8.5倍10-100放大比例从实验室到工业规模的典型放大比例，需考虑床层均匀性和流动分布100-500L工业色谱柱体积大型生物制药企业常用的单柱体积范围，单批次可处理千克级产品批天3-5/连续色谱生产率模拟移动床技术典型日处理批次，显著提高生产效率和设备利用率65-80%色谱技术成本占比在单抗等生物制药下游工艺中，色谱步骤占总分离成本的比例模拟移动床技术是现代工业色谱的代表性技术，通过多柱循环切换模拟固定相与流动相的相对运动，实现连续进样、连续出料，大幅提高生产效率和溶剂利用SMB率最初用于糖类分离，如葡萄糖果糖分离，现已扩展到手性药物、生物制品等高附加值产品分离多柱连续色谱是专为生物大分子设计的工业色谱技SMB MCSGP术，通过多柱循环操作，可回收传统批处理中丢失的肩峰部分，提高产品收率20-40%工业色谱的放大设计需考虑多种因素流动相分布系统设计至关重要，应确保大直径柱床中流动均匀性；床层压实和压力控制需防止填料压缩和床层破坏；温度控制系统需应对放大后热效应增强的挑战；监测和控制系统则需确保工艺稳定可靠此外，工业色谱还需关注验证和合规性要求，建立适当的清洁验证和再生策略，确保产品批次间无交叉污染随着一次性技术的发展，预装填一次性色谱柱逐渐应用于中小规模生产，简化了操作流程，提高了灵活性同时，连续生产理念的兴起也促进了工业色谱向连续、高效、稳健方向发展，为生物制药产业提供更经济、更环保的分离解决方案第九章结晶与干燥结晶技术干燥技术结晶是通过控制溶液环境，使溶质从溶液中以晶体形式析出的过程干燥是去除生物产品中水分或溶剂的最终处理步骤，直接影响产品的在生物分离工程中，结晶不仅是一种高效纯化手段，还是制备高稳定稳定性、保质期和商业价值根据所处理的生物产品特性，可选择不性终产品的重要方法通过控制过饱和度、温度、等参数，可获同的干燥方法，如喷雾干燥、流化床干燥、冷冻干燥等pH得高纯度、定义结构的晶体产品干燥基本原理与动力学•溶解度与过饱和度原理•常用干燥设备特点•成核与晶体生长机制•冷冻干燥技术与应用•结晶过程控制与优化•干燥工艺参数优化•结晶设备与工艺设计•结晶与干燥技术处于生物分离工程的最后阶段，直接决定最终产品的品质和稳定性良好的结晶过程不仅能提高产品纯度，还能显著改善其贮存稳定性和溶解特性；而恰当的干燥工艺则能在保持生物活性的同时，延长产品保质期，便于运输和储存本章将系统介绍结晶和干燥的基本原理和工艺技术，重点讨论这些技术在生物活性物质分离中的特殊考量和应用案例通过学习，学生将掌握结晶条件的选择和控制方法，了解不同干燥技术的特点和适用范围，能够为特定生物产品设计合适的结晶和干燥工艺，确保产品质量和生物活性的最大化保留结晶基本原理

9.1干燥技术

9.2冷冻干燥技术冷冻干燥冻干是最温和的干燥方法，通过在低温下将冻结状态的水直接升华去除主要步骤包括冻结通常℃以-40下、一次干燥升华冰晶和二次干燥去除吸附水特别适合热敏感性生物产品如疫苗、蛋白质和微生物制剂，但能耗高、周期长，主要用于高附加值产品喷雾干燥技术喷雾干燥通过将液体雾化成微小液滴，在热空气流中快速蒸发水分过程虽然使用高温℃，但由于蒸发冷150-200却效应和极短停留时间秒级，产品实际温度较低，适合部分耐热性生物产品具有生产效率高、连续操作等优势，广泛用于酶制剂、发酵产物的干燥流化床干燥流化床干燥利用上升热空气使固体颗粒处于流化状态，增大气固接触面积，提高传热传质效率通常用于颗粒状或粒径较大的生物产品，如微生物菌体、颗粒酶制剂等过程控制灵活，干燥均匀，但不适合粉末状物料工艺参数优化干燥工艺优化的核心是保持生物活性的同时实现高效脱水关键参数包括温度曲线、压力控制、干燥时间和保护剂添加等常用保护剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇等，通过替代水分子与生物分子形成氢键，防止变性在干燥过程中，生物产品面临多种潜在损伤因素，包括热变性、变化、浓度效应和界面变性等针对不同生物产品的特性，pH需选择合适的干燥方法和保护策略例如，对于抗体类药物，通常采用冷冻干燥并添加蔗糖等保护剂；而对于某些工业酶制剂，可采用喷雾干燥并添加盐类稳定剂和防尘剂现代干燥技术正朝着智能化和绿色化方向发展计算机建模和过程分析技术的应用，使干燥过程可实时监控和精确控制；PAT干燥与其他单元操作的集成，如喷雾冷冻干燥、流化床造粒干燥等，提高了工艺效率；而新型干燥介质如超临界干燥、微CO2波辅助干燥等，则降低了能耗和环境影响这些进展为生物产品干燥提供了更多选择，帮助生产者在保证产品质量的同时，提高经济效益和环保性能课程总结与展望生物分离工程正经历前所未有的发展变革随着生物技术产业的蓬勃发展，分离技术面临着处理更复杂样品、提供更高纯度产品和降低环境影响的多重挑战未来发展趋势主要体现在以下几个方面一是智能化和自动化技术的广泛应用，如人工智能辅助工艺设计、过程分析技术实时监控和自动化控制系统；二是连续生产理念的推广，从传统批次操作向连续集成操作转变，提高效率和一致性；三是绿色分离技术的发展，减少溶剂使用，降低能耗和废弃物产生多学科交叉融合将是生物分离工程创新的重要驱动力材料科学为分离介质提供新型功能材料；微流控技术实现微型化和高通量分离；生物信息学辅助复杂混合物分析；人工智能加速工艺开发和优化随着这些技术的进步，未来的生物分离工程将更加高效、精准、环保和经济，为人类健康、环境保护和可持续发展提供强有力的技术支撑作为生物工程专业的学生，需要不断学习新知识、掌握新技术，以适应这一快速发展的领域，开创生物分离工程的美好未来。