《生物化学实验》教学课件

《生物化学实验》教学课件欢迎来到《生物化学实验》课程！本课件包含张幻灯片，全面介绍生50物化学实验的核心内容、操作规范与应用实例我们将深入探讨各种关键实验的原理、详细步骤和科学意义，帮助医学和生物科学本科生掌握必备的实验技能通过本课程，你将学习从基础的蛋白质定量分析到复杂的操作技术，DNA掌握现代生物化学研究的实验方法每个实验都配有详细的操作指南和数据分析方法，确保你能够独立完成实验并正确解释结果让我们一起踏上探索生命奥秘的实验之旅！课程概述课程目标实验安排评分标准通过本课程学习，学生将掌握生本课程包含个核心实验和多个学生成绩由实验操作技能10物化学实验的基本原理和技术操补充实验，涵盖蛋白质、酶、核（）、实验报告质量40%作，能够独立完成蛋白质分析、酸、代谢等生物化学主要领域，（）、实验态度（）和30%15%酶学研究、核酸提取等核心实验，每个实验都配有详细的原理解析期末考试（）综合评定，鼓15%培养严谨的科学态度和实验思维和操作指南励独立思考和科学探究实验室安全须知危险源识别掌握常见化学和生物危险源防护措施正确使用个人防护装备废弃物处理严格遵循化学和生物废弃物处理流程应急处理熟悉紧急情况应对预案实验室安全是生化实验的首要前提在操作过程中，必须时刻保持警惕，正确佩戴实验服、手套、护目镜等防护装备对于危险试剂，如强酸强碱、有机溶剂和生物样本，必须按规定操作和存放一旦发生意外，立即按照应急预案处理并报告实验室管理人员实验基本技能精确移液溶液配制仪器使用移液器是生化实验中最常用的工具之溶液配制要求准确计算用量，使用分分光光度计使用前应预热分钟，并30一使用时，应选择合适量程的移液析天平称重固体试剂，选择适当的溶用空白校准离心机需平衡放置样品，器，垂直吸取，缓慢释放，避免气泡剂完全溶解对于缓冲液，需使用逐步提升转速所有精密仪器使用完pH和交叉污染对于有机溶剂和粘稠液计准确调节值，并定期校准计毕后应及时清洁并做好使用记录pH pH体，需采用正置或反置技术正确的移液技术是保证实验精确度的所有溶液配制完成后应贴上标签，注数据记录应使用实验记录本及时记录关键，建议新手通过称重法验证移液明名称、浓度、、配制日期和使用原始数据，不得随意修改，确保数据pH准确性，误差应控制在±以内期限，以确保实验的可追溯性和安全真实可靠分析处理时应选择合适的2%性统计方法，必要时进行重复验证实验一蛋白质含量测定原理理解掌握蛋白质定量的比色法原理标准曲线制作蛋白标准曲线BSA样品测定对未知样品进行蛋白质含量测定数据分析计算并分析蛋白质浓度结果蛋白质含量测定是生物化学实验中最基础也是最重要的技术之一通过比色法，我们可以快速准确地测定溶液中的蛋白质浓度，为后续实验提供基础数据比色法原理基于蛋白质与特定染料或试剂结合后，产生的颜色变化与蛋白质浓度成正比，通过分光光度计测量吸光度，再与标准曲线对照，即可计算出未知样品的蛋白质含量实验一蛋白质含量测定（续）考马斯亮蓝法双缩脲反应法法与法G-250Lowry BCA原理考马斯亮蓝在酸性溶液中与原理蛋白质中的肽键在碱性条件下与法结合双缩脲反应和酚试剂，G-250Lowry Folin蛋白质结合后，最大吸收峰从移⁺形成紫色络合物，在灵敏度介于考马斯法和双缩脲法之间465nm Cu²540-560nm至，吸光度变化与蛋白质浓度呈波长处有最大吸收595nm正比特点特异性好，受干扰少，但灵敏度较法与⁺形BCA BicinChoninicAcid Cu特点灵敏度高，操作简便，反应速度快，低适用范围成紫色复合物，灵敏度高，兼容性好适

0.5-10mg/ml但易受干扰物质影响适用范围用范围1-20-2000μg/ml100μg/ml实验一蛋白质含量测定（续）实验准备准备标准蛋白（）、考马斯亮蓝试剂、未知样品、移液器、比色BSA1mg/ml G-250皿等按照梯度配制标准溶液，浓度范围为，共设置个浓度点BSA0-100μg/ml6-8样品反应取各浓度标准蛋白和未知样品，分别加入考马斯试剂，轻轻混匀，室温放

0.1ml5ml置分钟（不超过小时）同时设置空白对照组（用蒸馏水代替蛋白溶液）21吸光度测定使用分光光度计，在波长处测定各组吸光度值注意测量前要用空白校595nm准仪器每个样品至少测定三次，取平均值，相对标准偏差应小于5%数据分析以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线通过线性回归分析BSA得到方程将未知样品的吸光度代入方程，计算出蛋白质浓度，考虑稀释因素后得到原始样品的蛋白质含量实验二血清球蛋白的分离γ-球蛋白的意义γ-分离原理球蛋白主要包含免疫球蛋白，是机体γ-利用不同蛋白质在盐溶液中溶解度不同的体液免疫的重要组成部分，具有抗原识别特性，通过调节硫酸铵浓度实现球蛋γ-和抗体活性，在临床诊断和治疗中有重要白的选择性沉淀和分离应用分离步骤纯度检测先用饱和硫酸铵沉淀去除白蛋白和33%通过电泳、免疫扩散等方法检测分离产物球蛋白，再用饱和硫酸铵沉淀α,β-50%的纯度和活性，评价分离效果球蛋白，经透析除盐后获得纯品γ-实验二血清球蛋白的分离（续）γ-血清准备收集新鲜血清样品，离心去除细胞成分，装入离心管中新鲜血清应呈淡黄色透明状，避免溶血实验前应将血清恒温至室温一级盐析在血清中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液（℃，），使最终浓度达到饱4pH

7.433%和边加边搅拌，避免局部浓度过高℃静置分钟，使蛋白充分沉淀430分离沉淀离心分钟，小心收集上清液（含球蛋白）沉淀物（主要为白蛋白和3000rpm15γ-球蛋白）可保存作对照离心过程中应平衡离心机，防止震动α,β-二级盐析向上清液中继续加入饱和硫酸铵至饱和，℃静置小时再次离心，这次收集沉50%41淀（富含球蛋白），弃去上清液沉淀用少量缓冲液重悬γ-PBS实验二血清球蛋白的分离（续）γ-透析除盐纯度检测保存方法将重悬的沉淀转入透析袋中，在大体积采用紫外吸收光谱分析，测定制备好的球蛋白可分装保存短期保γ-缓冲液中透析小时，期间比值，正常应大于存可在℃冰箱，加入叠氮钠防PBS24-48A280/A

2601.

440.02%更换数次缓冲液透析过程去除硫酸铵，通过电泳检测纯度，纯的腐；长期保存宜在℃或℃，或SDS-PAGE-20-80避免其对后续实验的干扰透析完成后球蛋白在处应有一个经冻干后密封保存避免反复冻融，以γ-150-160kD的溶液应该清澈透明主带免疫电泳可进一步确认其免疫学免失活活性实验三血清蛋白电泳电泳原理带电分子在电场作用下迁移的技术蛋白质电泳种类2聚丙烯酰胺凝胶电泳、、等电聚焦等SDS-PAGE与比较PAGE SDS-PAGE天然保留蛋白质活性，分辨率更高PAGE SDS-PAGE蛋白质电泳是分离和分析蛋白质的重要技术在电场作用下，不同蛋白质因电荷和分子量不同而呈现不同的迁移速率天然主PAGE要基于蛋白质的电荷与形状差异进行分离，适合研究蛋白质的天然构象和活性；而则通过使蛋白质变性并带上均一SDS-PAGE SDS负电荷，使分离主要依赖分子量大小，适合测定分子量和纯度实验三血清蛋白电泳（续）凝胶制备样品处理电泳条件根据目标蛋白分子量范对于，样品将凝胶安装到电泳槽，SDS-PAGE围选择适当浓度的丙烯需与含、巯基乙倒入电泳缓冲液，小心SDSβ-酰胺（通常醇的上样缓冲液混合，上样初始电压设为

7.5%-）配制分离胶和℃加热分钟使蛋白通过浓缩胶，然后15%95580V浓缩胶溶液，加入变性天然则不调至进行分离整APS PAGE120V和引发聚合，注需加热变性样品上样个过程控制在小时，TEMED1-2意排除气泡凝胶应在量为，蛋白含避免过热可通过示踪10-30μl聚合前迅速倒入胶板，量在之间为宜，染料监控电泳进度，直10-50μg表面覆盖水或正丁醇，过多会导致条带模糊到染料接近胶底停止确保平整实验三血清蛋白电泳（续）染色技术脱色处理常用考马斯亮蓝染色，银染用使用含醋酸和甲醇的脱色液去除背景染R-250于高灵敏度检测料数据分析凝胶成像测量蛋白条带相对迁移率，计算分子量通过凝胶成像系统记录电泳结果电泳结束后的染色和分析是获取实验数据的关键步骤考马斯亮蓝是最常用的蛋白质染色剂，可检测蛋白质；而银R-2505-10μg染可检测至级别，灵敏度更高但操作更复杂脱色过程需耐心进行，直到蛋白条带清晰可见而背景较浅通过比较蛋白标准分子量ng标志物与未知蛋白的相对迁移率，可以计算出未知蛋白的分子量，从而推断其身份实验四碱性磷酸酶分离纯化5-7最适值pH碱性磷酸酶活性最高的酸碱环境°37C最适温度酶催化反应效率最高的温度140kDa分子量人体碱性磷酸酶的大致分子量种4同工酶人体内主要的碱性磷酸酶亚型数量碱性磷酸酶是一种重要的水解酶，能在碱性环境中催化磷酸单酯的水解，释放无机磷酸和醇它广泛分布于生物体内，在骨骼、肝脏、肠道和胎盘等ALP组织中含量较高在临床上，血清活性是评估肝胆疾病和骨代谢异常的重要指标ALP酶的分离纯化是生物化学研究的基础技术，纯化策略需根据酶的特性设计，通常包括粗提取、分级沉淀、层析分离等步骤，最终获得高纯度、高活性的酶制剂实验四碱性磷酸酶分离纯化（续）纯化步骤原理操作要点注意事项组织匀浆机械破碎释放细胞低温操作，添加保避免剧烈搅拌产生内容物护剂热量和泡沫离心分离根据颗粒大小和密选择合适转速和时平衡离心管，逐步度分离间提高转速硫酸铵沉淀利用蛋白质盐析特缓慢加入，充分搅控制温度，避免局性拌部浓度过高透析除盐利用半透膜分子筛选择合适截留分子定期更换缓冲液，选作用量防止膜袋破裂离子交换层析基于分子表面电荷选择合适树脂和洗控制流速，收集峰差异脱条件型完整实验四碱性磷酸酶分离纯化（续）层析过程监测酶制剂浓缩保存层析分离过程中，通过在线紫外检测收集含高活性的馏分后，需进行浓缩器实时监测洗脱液的值，绘制处理，常用方法包括超滤浓缩、硫酸A280洗脱曲线同时收集不同洗脱体积的铵沉淀或冻干等浓缩后的酶溶液应馏分，进行酶活性测定，确定目标酶尽快分装，避免反复冻融的精确位置纯化酶保存时应添加稳定剂（如甘油、对于碱性磷酸酶，可使用对硝基苯磷等），避免重金属离子污染，BSA-典型的层析洗脱曲线显示蛋白质浓度酸二钠作为底物进行快速检测℃或℃长期保存每批次酶制pNPP20-80和酶活性分布碱性磷酸酶A280活性馏分会使底物水解产生黄色对硝剂都应测定其比活性、蛋白浓度和纯通常在特定离子强度或条件下洗脱，pH基苯酚，通过肉眼观察或测定度，建立质量控制标准A405形成峰型完整的活性峰通过比较不即可初步判断酶的存在同峰的比活性，可以判断纯化效果实验五碱性磷酸酶比活性测定酶活性定义测定原理酶活性是指单位时间内酶催化底物转碱性磷酸酶可催化对硝基苯磷酸酯化为产物的能力国际单位定义水解，释放黄色的对硝基苯U pNPP为在指定条件下，每分钟催化转化酚在波长下测定吸pNP405nm底物所需的酶量比活性则光度变化率，根据产物摩尔吸光系数1μmol是单位蛋白质量所具有的酶活性，单计算酶活性反应在碱性条件pH位为下进行，需加入⁺作为辅助U/mg

9.8Mg²因子计算方法酶活力×总×××酶，其中为U/ml=ΔA/min V1000/εd VεpNP的摩尔吸光系数⁻⁻，为比色皿光径，总为反应总体积

18.5mM¹cm¹d cmV，酶为加入的酶液体积比活性酶活力蛋白浓度ml Vml=/mg/ml实验五碱性磷酸酶比活性测定（续）实验五碱性磷酸酶比活性测定（续）碱性磷酸酶的活性可受多种因素影响常见抑制剂包括磷酸盐、和苯丙氨酸等磷酸盐作为反应产物，通过产物抑制降低酶活性；通过螯合⁺和⁺EDTA L-EDTA Mg²Zn²等必需金属离子导致活性下降；苯丙氨酸则是胎盘型碱性磷酸酶的特异性抑制剂L-在实验误差控制方面，应注意温度波动、精确调节、酶制剂的稳定性、底物纯度和分光光度计的准确性等因素建议使用标准品进行质控，并采用多次重复测定取平均pH值的方法，提高数据可靠性通过比较不同纯化阶段样品的比活性，可评价纯化的有效性实验六血糖含量测定临床意义葡萄糖氧化酶法方法比较血糖测定是临床上最常见的生化检测葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成葡邻甲苯胺法是早期常用的化学法，但项目之一，用于糖尿病诊断、监测和萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧特异性较差，已逐渐被酶法取代葡治疗评估正常空腹血糖值为化物酶作用下与显色底物反应产生有萄糖试纸条法基于葡萄糖氧化酶法，

3.9-，超过可色化合物，颜色深浅与葡萄糖浓度成操作简便，适合家庭和床旁监测，但

6.1mmol/L

7.0mmol/L诊断为糖尿病妊娠期、严重疾病和正比，通过分光光度计测定此法特精确度稍低六氟化钾静脉血是最准应激状态也可引起血糖异常异性高，准确度好确的临床检测样本实验六血糖含量测定（续）样品采集空腹状态下采集静脉血或指尖毛细血管血静脉血应使用含氟化钠草酸钾的抗凝管，防止/糖酵解样品应及时分离血清或血浆，避免红细胞对葡萄糖的消耗影响结果准确性采集后小时内样品稳定，否则需℃保存24样品处理去蛋白处理常用₄₂或三氯乙酸沉淀蛋白质，离心收集上清液胎儿血ZnSO-BaOH清需透析除去干扰物质样品稀释时应考虑最终测定值落在标准曲线的线性范围内，通常葡萄糖浓度应在之间

0.1-

0.5mg/ml标准曲线配制一系列浓度的葡萄糖标准溶液（），加入葡萄糖0,

0.1,

0.2,

0.3,

0.4,

0.5mg/ml氧化酶过氧化物酶工作液，℃温育分钟，终止反应后测定以葡萄糖浓度为-3710A505横坐标，为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程A505样品测定将处理后的样品按与标准品相同的方法进行反应和测定从标准曲线查出或计算出相应的葡萄糖浓度，结合稀释因素，计算原始样品的血糖浓度每批检测应包含质控样品，确保结果可靠性实验六血糖含量测定（续）

5.6正常值范围健康人空腹血糖mmol/L

11.1口服糖耐量糖尿病诊断阈值mmol/L

7.0糖尿病阈值空腹血糖诊断标准mmol/L

6.1-

7.0糖耐量异常空腹血糖受损范围mmol/L血糖测定的最终计算采用以下公式血糖浓度样品测定值×稀释倍数×，其中是葡萄糖的分子量，用于将mmol/L=mg/ml1000/180180转换为结果分析时应考虑采样时间、是否空腹、年龄等因素的影响mg/ml mmol/L在实验中常见的问题包括溶血对结果的干扰、试剂不新鲜导致酶活性下降、温育时间控制不准确等解决方案是严格控制样品质量、定期更换试剂、精确计时和温度控制，以及使用自动分析仪提高准确性对异常值应复查确认，必要时采用多种方法交叉验证实验七血清甘油三酯测定心血管风险评估预测动脉粥样硬化和心血管疾病风险代谢疾病诊断评估脂肪肝、代谢综合征等疾病治疗效果监测监测降脂药物和生活方式干预效果甘油三酯是人体主要的脂类物质之一，由甘油与三个脂肪酸分子酯化而成，是能量储存的重要形式血清甘油三酯水平与饮食、肝功能、内分TG泌状态密切相关，其升高是动脉粥样硬化和心血管疾病的独立危险因素法甘油磷酸氧化酶过氧化物酶法是目前临床最常用的甘油三酯测定方法该方法首先通过脂肪酶水解甘油三酯生成甘油和脂肪酸，然GPO-PAP-后甘油在甘油激酶催化下生成甘油磷酸，继而被甘油磷酸氧化酶氧化产生₂₂，最后过氧化物酶催化₂₂与显色剂反应生成有色产物，-3-H OH O通过测定吸光度计算甘油三酯浓度实验七血清甘油三酯测定（续）样品采集空腹采血，避免血液污染样品处理离心分离血清，避免溶血反应体系加入试剂，混匀孵育GPO-PAP结果计算测定吸光度，计算浓度TG样品采集与处理是确保准确测定的关键步骤甘油三酯测定要求受试者空腹小时以上，避免餐后脂血12症的影响采集静脉血，使用干净无油脂的试管，防止污染导致假性高值血液应在采集后小3-5ml2时内分离血清，如不能及时检测，可将血清置于℃保存（稳定小时）或℃长期保存472-20试剂配制需要特别注意工作液由脂肪酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化物酶和显色剂GPO-PAP组成，使用前应充分混匀并预热至℃标准品使用甘油标准液（），应避光保存所有

372.26mmol/L移液操作应使用一次性吸头，防止交叉污染实验七血清甘油三酯测定（续）实验八转氨酶的转氨基作用转氨基作用机理转氨酶催化氨基从氨基酸转移到酮酸上的反应，是氨基酸代谢的关键步骤该反应需要维生素（吡哆醛磷酸，）作为辅酶，形成希夫碱中间体，实现氨基的转移α-B6PLP这一过程在氨基酸合成和分解中扮演核心角色与比较ALT AST丙氨酸转氨酶主要催化丙氨酸与酮戊二酸之间的氨基转移，在肝脏中含量高；天冬氨酸转氨酶催化天冬氨酸与酮戊二酸之间的反应，在心肌、肝脏等多种组ALTα-ASTα-织中含量丰富二者的比值在临床上有重要诊断价值AST/ALT临床应用血清转氨酶活性是评估肝脏损伤的敏感指标急性肝损伤时，升高更明显；慢性肝病晚期和酒精性肝病中，升高更显著心肌梗死、肌肉疾病也可导致升高转ALT ASTAST氨酶检测已成为临床上最常用的肝功能检查项目之一实验八转氨酶的转氨基作用（续）底物选择测定原理丙氨酸酮戊二酸，天冬氨酸ALT+α-AST反应式氨基酸酮酸⇌酮酸氨基酸L-+α-α-+L-2酮戊二酸+α-活性计算测量方法根据吸光度变化率计算酶活性利用生成物的变化监测反应速率转氨酶活性测定的原理基于酶促反应的动力学特性目前临床上主要采用比色法和连续监测法两种方法比色法是将转氨酶催化生成的丙酮酸或Reitman-Frankel草酰乙酸与二硝基苯肼反应形成有色衍生物，通过测定吸光度计算酶活性连续监测法则是通过耦联辅酶的氧化反应，测定处吸光度的下降速2,4-NADH340nm率计算酶活力底物选择和反应条件对测定结果有重要影响反应体系中需添加足量的底物（氨基酸和酮酸）、辅酶，并控制在最适范围（）反应温度通常设α-PLP pH

7.2-

7.4定为°，以模拟体内环境国际建议单位为，定义为°条件下，每分钟催化转化底物所需的酶量37C U/L37C1μmol实验八转氨酶的转氨基作用（续）步骤试管（测定管）试管（对照管）操作要点A B加底物底物液底物液预热至°

0.5ml

0.5ml37C加酶液酶液精确计时

0.1ml-混匀孵育°，分钟避免震荡产生气泡37C30-加显色剂二硝基苯肼二硝基苯肼立即混匀2,4-2,4-

0.5ml

0.5ml加酶液（对照）酶液需先停止反应-

0.1ml显色室温分钟室温分钟避光2020加碱液充分混匀NaOH5ml NaOH5ml测吸光度分钟内完成505nm505nm10实验结果解释需结合临床背景正常值范围为，为，女性略低于男性ALT5-40U/L AST8-40U/L转氨酶升高的程度与肝损伤的严重性相关，但不能完全反映肝功能储备急性肝炎时可升高至正常上ALT限的倍；而常提示酒精性肝病可能需注意，肌肉注射、剧烈运动等也可造成转10-100AST/ALT2氨酶轻度升高实验九的分离纯化DNA结构与功能DNA遗传信息储存与传递的核心分子提取原理细胞裂解、蛋白去除和核酸沉淀方法比较不同组织来源的提取策略差异DNA（脱氧核糖核酸）是由脱氧核苷酸聚合而成的大分子，呈双螺旋结构，携带生物遗传信息它由磷酸、脱氧核糖和含氮碱基（、、、）组成，DNA AT GC不同生物体间序列的差异决定了生物多样性分子具有复制、转录和修复等功能，是现代生物学研究的核心分子DNA DNA提取的基本原理包括三个主要步骤首先使用去垢剂和蛋白酶裂解细胞膜和核膜，释放核酸；然后通过酚氯仿抽提或盐析法去除蛋白质和其他细胞DNA-成分；最后使用乙醇或异丙醇沉淀不同来源的样本（如血液、组织、植物、微生物）需要采用针对性的提取方法，以应对不同样本类型的特殊挑DNA战实验九的分离纯化（续）DNA细胞裂解或等去垢剂溶解细胞膜和核膜•SDS NP-40螯合二价阳离子，抑制活性•EDTA DNase蛋白酶消化蛋白质，解除与蛋白的结合•K DNA°孵育促进裂解和蛋白酶活性•56C蛋白质去除酚氯仿抽提利用有机溶剂与水相分层•-蛋白沉淀法高盐浓度沉淀蛋白•离心分离蛋白沉淀与含上清液•DNA反复抽提以提高纯度•DNA沉淀与洗涤DNA加入乙醇或异丙醇沉淀•DNA加入醋酸钠或乙酸铵提高沉淀效率•低温促进沉淀形成•乙醇洗涤去除盐分•70%干燥后溶解于缓冲液或无菌水•TE实验九的分离纯化（续）DNA纯度和浓度检测是评价提取效果的关键纯度检测主要通过分光光度计测定和比值，理想值为，低于表明蛋白质污染，高DNA A260/A280A260/A230A260/A

2801.8-

2.

01.8于可能有污染；理想值大于，低值表明存在有机溶剂或盐类残留浓度计算公式浓度××稀释倍数，其中是双链的

2.0RNA A260/A

2302.0DNAμg/ml=A2605050DNA转换系数实验中常见问题及解决方案

①产量低延长裂解时间，优化沉淀条件；

②纯度差增加酚氯仿抽提次数，注意取上清时避免接触界面；

③降解避免剧烈振荡，加入DNA DNA-DNA去除；

④溶解困难适当加热（°），缓慢震荡，延长溶解时间所有操作应避免交叉污染，使用无菌耗材和水RNase ARNA DNA56C DNase-free实验十琼脂糖电泳DNA电泳原理电泳参数选择琼脂糖凝胶电泳是分离和分析的凝胶浓度选择是关键因素DNA

0.5-

0.7%基本方法，基于荷负电的分子在适合分离大片段；DNA5-10kb

0.8-

1.2%电场作用下向正极迁移的原理迁移速适合分离片段；适合1-5kb

1.5-

2.0%率与分子量、凝胶浓度、电压、分离小于片段电压通常控制在DNA1kb缓冲液等因素有关以下，过高会导致凝胶过热和5V/cm条带模糊分子的磷酸骨架赋予其均一的负电泳缓冲液常用或适合DNA TAE TBE TAE在电泳过程中呈现独特的迁移规电荷密度，因此在电场中主要按分子大DNA大片段分离和回收；适合小DNA TBE律线性双链的迁移速率与分子小（碱基对数）分离较小的片DNA片段和高分辨率需求电泳时间取决于DNA量的对数成反比环状（如质粒）段在凝胶中迁移更快，形成条带的位置DNA目标片段大小和分辨率要求，通常从的迁移则更为复杂，根据其拓扑结构不更远分钟到数小时不等30同（超螺旋、开环、线性），即使分子量相同也会呈现不同的迁移速率实验十琼脂糖电泳（续）DNA凝胶制备根据目标大小选择合适浓度的琼脂糖粉末（通常），用×或缓冲DNA

0.8-

2.0%1TAETBE液溶解微波加热至完全透明，冷却至约℃后加入核酸染料（如溴化乙锭，终浓度60）将溶液倒入已安装好梳子的凝胶盒中，室温凝固分钟注意避免气泡

0.5μg/ml20-30形成，保持凝胶表面平整样品处理将样品与体积的×上样缓冲液（含溴酚蓝和甘油）混合上样缓冲液中的甘油增DNA1/66加密度，使样品沉入凝胶孔中；溴酚蓝作为示踪染料，监控电泳进度对于分子量未知的样品，应同时上样适当范围的标准分子量每个凝胶孔加载的量通常为DNA MarkerDNA，视检测灵敏度和条带需求而定

0.1-1μg电泳条件将凝胶浸没于电泳缓冲液中，确保液面高出凝胶表面连接电源，设定适当电压2-3mm（通常）开始电泳电流方向必须从负极（黑色）流向正极（红色），因为80-120V DNA带负电荷电泳时间根据目标片段大小和凝胶长度调整，通常待溴酚蓝迁移至凝胶处即2/3可停止过长的电泳时间会导致小分子扩散和条带模糊DNA实验十琼脂糖电泳（续）DNA电泳结束后的染色与成像是结果分析的关键步骤溴化乙锭是最常用的核酸染料，它能插入碱基对之间，在光照射下发出红橙色荧光EB DNAUV如采用电泳后染色法，需将凝胶浸泡在含的缓冲液中分钟，然后在透射仪上观察现在也有许多新型无毒染料，如和EB10-30UV SYBRSafe，提供更安全的替代选择GelRed结果分析首先关注条带的形态和清晰度清晰锐利的条带表明质量好且浓度适中；拖尾状条带可能提示降解或过载；弥散模糊的条DNA DNA DNA带可能是构象不均一或电泳条件不适通过与标准分子量标记物比较，可计算样品的大小计算方法是绘制标准分子量的对数值与迁移距DNA DNA离的标准曲线，再根据未知样品的迁移距离推算其分子量对于重组和产物的鉴定，还需结合理论预期大小进行综合判断DNA PCR补充实验肝中核酸的提取肝组织特性提取原理RNA肝脏富含和，同时也含有大法基于酸性硫氰化胍和酚的变性RNA DNATrizol量核酸酶和脂质肝组织和作用，能有效灭活酶并分离核酸RNA DNARNA的提取需要特别注意防止酶降解在酸性条件下，保持在水相，而RNA RNA和脂质干扰新鲜肝组织含有活性核酸和蛋白质则分配到有机相和界面，DNA酶，须立即处理或速冻保存，操作中需从而实现的选择性提取该方法RNA始终保持低温环境操作简便，产量高，适合同时提取多个样本提取原理DNA肝组织提取通常采用改良的蛋白酶消化法首先用裂解细胞，蛋白DNA SDS-K SDS酶消化蛋白质，然后通过酚氯仿抽提去除蛋白质和脂质，最后乙醇沉淀肝K-DNA组织特有的挑战是高脂质含量，可通过增加氯仿比例或重复抽提来改善补充实验肝中核酸的提取（续）组织处理新鲜肝组织切成小块（约），立即放入液氮速冻，或置于℃保存实验前冰上解冻，100mg-80加入试剂（或裂解缓冲液），使用组织匀浆器充分研磨，直至组织完全匀浆匀浆1ml Trizol过程中保持低温，防止核酸酶激活2分离RNA匀浆后室温孵育分钟，使核蛋白复合物完全解离加入氯仿，剧烈震荡秒，室温静

50.2ml15置分钟×离心分钟（℃），此时形成上清（含）、中间层（含）2-312,000g154RNA DNA和有机相（含蛋白质）三层小心吸取上清至新管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA纯化RNA×离心分钟（℃）收集沉淀用乙醇洗涤沉淀两次，去除残留盐分和有7,500g104RNA75%机溶剂短暂风干后，用处理的水或缓冲液溶解溶解过程中可在℃加热DEPC TERNA5610分钟辅助溶解测定比值评估纯度（理想值为）A260/A

2801.8-

2.04提取DNA可从分离的中间层进一步提取，或使用专用试剂盒从肝组织直接提取基本步骤包Trizol DNA括裂解、去蛋白、沉淀和洗涤，与标准提取流程类似，但需特别注意去除脂质污染通常DNA需增加蛋白酶消化时间和酚氯仿抽提次数K-补充实验影响酶促反应速度的因素温度值pH温度升高可增加分子热运动，加速酶与影响酶分子表面电荷分布和活性中心pH底物碰撞，提高反应速率但过高温度氨基酸侧链的离子化状态，从而影响酶导致酶蛋白变性，活性丧失大多数哺的催化活性每种酶都有特定的最适，pH乳动物酶的最适温度在℃左右偏离此值活性显著降低37-40酶浓度底物浓度在底物充足条件下，反应速率与酶浓度3在低底物浓度时，反应速率与底物浓度成正比这是酶活性测定的理论基础，成正比；随浓度增加，速率增长逐渐减通过测量反应速率可计算酶的浓度或活缓，最终达到最大速率（），呈典Vmax性型的米氏曲线补充实验影响酶促反应速度的因素（续）补充实验运动对肌肉组织糖代谢的影响运动生理学基础糖代谢机制动物模型建立运动时，肌肉能量需求大幅增加，引发一系列代肌糖原通过磷酸化酶催化分解为葡萄糖磷酸，常用小鼠或大鼠作为运动代谢研究模型实验设-1-谢变化短时高强度运动主要依赖无氧糖酵解产进入糖酵解途径产生能量运动时，交感神经释计通常包括对照组（安静状态）和运动组（不同生，生成乳酸；而长时间中低强度运动则主放肾上腺素，激活磷酸化酶，加速糖原分解同强度和时间的运动干预）运动方式可选择游泳、ATP要依赖有氧代谢，包括糖原、脂肪和少量蛋白质时，运动诱导肌肉葡萄糖转运体转位到细跑台或爬梯，不同方式有各自优缺点为确保实GLUT4的氧化肌肉收缩过程中，肌糖原是快速动员的胞膜，增强葡萄糖摄取高强度运动时，糖酵解验效果，需提前适应性训练，避免应激反应干扰能量来源，而血糖和脂肪酸则为持续性能量供应速率超过三羧酸循环能力，导致丙酮酸转化为乳结果实验过程中需控制饮食、环境温度、光照酸，乳酸可经血液运输到肝脏，通过糖异生途径周期等因素，确保组间唯一变量是运动状态转化为葡萄糖（循环）Cori补充实验运动对肌肉组织糖代谢的影响（续）样本采集和处理肌糖原和肝糖原测定数据分析和结果讨论运动结束后，立即麻醉动物，迅速分离股蒽酮法是测定糖原的经典方法，原理是在实验数据分析通常包括组织糖原含量比较、四头肌、腓肠肌等骨骼肌，以及肝脏组织强酸条件下，多糖水解为单糖，与蒽酮反血糖和血乳酸水平变化，以及相关酶活性取材过程应尽量快速，防止代谢状态变化应生成蓝绿色产物，在处有最大测定统计分析采用检验或方差分析，620nm t组织样本立即置于液氮中快速冷冻，然后吸收方法灵敏度高，但受其他糖类干扰视为有统计学意义p

0.05转入℃保存待用-80酶法则利用淀粉酶和糖苷酶将糖原水解为结果讨论应结合运动生理学理论，解释不肌糖原测定前，需将组织在中煮葡萄糖，再用特异性葡萄糖测定试剂盒测同强度运动对肌糖原消耗的影响，以及训30%KOH沸分钟完全消化，然后用乙醇沉淀糖原定，特异性更高此外，还可采用染练引起的代谢适应变化例如，耐力训练15PAS沉淀物再用酸水解转化为葡萄糖，最后用色结合图像分析技术，直观显示糖原在组会增加肌糖原储存能力和脂肪氧化能力，葡萄糖氧化酶法或蒽酮法测定糖含量测织中的分布和含量变化提高有氧代谢效率，而力量训练则主要增定时需设立标准曲线，确保结果准确可靠强糖酵解能力补充实验质粒的提取1-500范围kb常见质粒大小范围⁶10拷贝数高拷贝质粒在细胞中的数量种3拓扑形式质粒可能的结构状态数量20-100μg/ml典型质粒提取产量质粒是细菌细胞内独立于染色体外的环状分子，能够自主复制它携带非必需但有益的遗传信息，如抗生素抗性、毒力因子等在分子生物学中，质粒DNA被广泛用作基因克隆、表达和遗传操作的载体质粒结构包括复制起点、选择标记基因（如抗生素抗性）、克隆位点和各种功能元件ori碱裂解法是最常用的质粒提取方法，由三个关键步骤组成首先，在含的等渗缓冲液中重悬细菌细胞；然后，加入含的碱性溶液（），裂EDTA SDSNaOH解细胞并变性；最后，加入酸性中和溶液（乙酸钾），使染色体和蛋白质沉淀，而小分子质粒则保持溶解状态此方法简单高效，是商业质DNADNADNA粒提取试剂盒的基础原理补充实验质粒的提取（续）细菌培养接种含有目标质粒的大肠杆菌于培养基中（添加相应抗生素），°振荡培养LB37C12-小时至对数生长期高拷贝质粒通常在培养基中培养，而低拷贝质粒可能需要添16LB加氯霉素放大培养收获细胞前测定，理想值为离心收集细菌细胞，OD

6001.0-

1.5弃去上清培养基碱裂解提取将细菌沉淀重悬于含的缓冲液中加入裂解缓冲液（含和RNase AP1P2NaOH），轻轻混匀，室温放置不超过分钟加入中和缓冲液（高浓度乙酸钾），SDS5P3立即轻轻混匀，形成白色絮状沉淀高速离心分钟分离沉淀，小心收集含质粒10的上清液DNA纯化与沉淀对于小规模提取，可直接用异丙醇沉淀上清液中的质粒；大规模提取则通常DNA采用硅胶膜柱或离子交换树脂进一步纯化沉淀后的用乙醇洗涤，除去DNA70%残留盐分风干后溶解于缓冲液或无菌水中，°保存避免反复冻融，TE-20C防止降解DNA补充实验质粒的酶切鉴定限制性内切酶原理酶切反应设计限制性内切酶是细菌中的一类防御酶，酶切反应设计需考虑质粒图谱、酶切位能识别特定的序列（通常为点分布、酶的兼容性和反应条件等因素DNA4-8bp的回文序列），并在特定位点切断双链单酶切通常用于线性化质粒或确认特定不同酶具有不同的识别序列和切位点；双酶切或多酶切可用于切出特定DNA割方式，可产生平末端或粘性末端这片段或验证克隆构建选择酶时应避免种特异性切割特性使其成为分子克隆和星状活性（非特异性切割），并确保质分析的重要工具粒中有足够数量的切点产生可分辨的片DNA段图谱分析方法酶切图谱分析是通过比较实际酶切产物与理论预期图谱来鉴定质粒的方法需先获得质粒的预期序列或图谱，计算各酶切位点间的距离，预测酶切后产生的片段大小和数DNA量实验后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与分子量标准比较，确定各片段大小，判断是否符合预期补充实验质粒的酶切鉴定（续）步骤操作要点关键参数注意事项反应体系配制准确添加各组分总体积通常酶体积不超过总体积的10-50μl1/10质粒使用高纯度质粒反应避免等抑制剂DNA

0.5-1μg/EDTA限制性内切酶加酶前混匀其他组分反应酶应保存在℃5-10U/-20反应缓冲液选择兼容的缓冲液×终浓度注意不同酶的缓冲液需求1反应条件恒温孵育通常℃，小时部分酶需特殊温度371-4反应终止加入终止缓冲液或热灭活℃，分钟不是所有酶都能热灭活65-8010-20电泳分析选择合适浓度凝胶琼脂糖大片段低浓度，小片段高浓度

0.8-

2.0%分子生物学实验技术拓展技术基因克隆PCR聚合酶链式反应是体外扩增特基因克隆是将目标基因插入载体并在PCR定片段的强大技术通过反复的宿主细胞中扩增的过程关键步骤包DNA变性退火延伸循环，利用耐热括目标基因获取（或酶切）、载--PCR聚合酶（如酶）和特异性引体准备、连接反应、转化宿主细胞和DNA Taq物，可将目标序列指数级扩增阳性克隆筛选常用载体包括质粒、PCR技术广泛应用于基因克隆、突变检测、噬菌体、酵母人工染色体等，选择取病原体诊断等领域变种技术包括实决于插入片段大小和应用需求载体时定量、反转录、巢式通常含有选择标记（如抗生素抗性）、PCR PCRPCR等，各有特定用途复制起点和多克隆位点蛋白质表达与分析重组蛋白表达系统包括原核（大肠杆菌）和真核（酵母、昆虫、哺乳动物）表达系统选择表达系统需考虑蛋白折叠、翻译后修饰、产量和纯化难度等因素表达后的蛋白可通过亲和层析、离子交换、凝胶过滤等方法纯化蛋白功能分析方法包括酶活性测定、蛋白质相互作用研究（免疫共沉淀、酵母双杂交）和结构解析（射线晶体学、X核磁共振）等数据分析和结果处理实验报告撰写指南标题与摘要引言简明扼要反映实验主题和结果阐述实验背景、原理和目的参考文献材料与方法列出引用的相关文献详述实验步骤，确保可重复性3讨论结果分析结果含义和实验局限性客观呈现数据，不包含解释撰写高质量实验报告需遵循科学写作规范引言部分应简述实验原理和研究背景，明确实验目的；材料和方法部分详细描述实验过程，使他人能够重复；结果部分客观呈现实验数据，使用表格和图形辅助说明；讨论部分解释结果含义，分析实验误差来源，提出改进建议，并将结果与已有文献比较常见问题包括

①结果与讨论混淆，应分别呈现；

②方法描述不清，缺乏关键参数；

③数据处理不当，缺乏统计分析；

④讨论流于表面，未深入分析改进建议使用第三人称和被动语态保持客观；严格遵循科学术语；图表编号并在文中引用；结果解释要有数据支持；注意引用格式的一致性；行文逻辑清晰，避免冗余生物化学实验技术发展趋势高通量筛选技术微流控芯片和自动化平台大幅提高了生物分子分析的通量和效率基于微阵列的技术允许同时分析数千个样本，广泛应用于药物筛选、基因表达谱分析和蛋白质组学研究新一代测序技术的发展使得全基因组测序成本大幅降低，速度显著提高，推动了个性化医疗的发展单细胞分析方法传统生化分析基于细胞群体平均值，难以揭示细胞间的异质性单细胞测序、单细胞蛋白质组学和单细胞代谢组学技术的发展，使研究者能够精确分析单个细胞的生化特性这些技术结合微操作、微流控和高灵敏度检测方法，为理解复杂生物系统中的细胞异质性提供了强大工具组学研究与系统生物学多组学整合分析已成为生物化学研究的重要趋势通过同时分析基因组、转录组、蛋白质组和代谢组数据，可以从系统层面理解生物过程生物信息学和人工智能的应用使得大规模数据分析和模型构建成为可能，促进了系统生物学的发展，为疾病机制研究和药物开发提供了新视角生物化学实验在科研中的应用基础研究应用生物化学实验在揭示生命基本规律中发挥关键作用以糖酵解调控机制研究为例，科学家通过酶活性测定、代谢中间产物分析和基因表达研究，发现了酶在肿瘤细胞PFKFB3代谢重编程中的核心作用这一发现不仅丰富了对肿瘤能量代谢的认识，也为靶向肿瘤代谢的治疗策略提供了理论基础临床诊断应用生物标志物的发现和验证离不开生物化学实验技术心肌梗死早期诊断中，高灵敏度肌钙蛋白检测方法的建立，大大提高了急性冠脉综合征的诊断准确性和及时性这一技术结合了抗体亲和纯化、化学发光检测和自动化分析平台，使检测灵敏度提高了近百倍，为心肌梗死的早期干预提供了可能药物研发应用靶向酶抑制剂开发是现代药物研发的热点领域肿瘤治疗药物帕博西尼（抑制剂）的研发过程展示了生物化学实验的关键作用研究人员通过酶活性筛选、激酶抑制CDK4/6谱分析、细胞毒性测定和动物模型验证，最终获得了对有高度选择性的抑制剂，显著延长了激素受体阳性乳腺癌患者的无进展生存期CDK4/6总结与展望核心实验技能掌握生物分子分析、分离纯化和功能研究的基础方法科学研究思维培养实验设计、数据分析和结果解释的科学思维方式实验操作规范3建立严谨的实验习惯和安全意识《生物化学实验》课程通过系统的理论讲解和实践操作，全面介绍了蛋白质、酶、核酸和代谢产物分析的基本方法我们学习了从简单的比色法到复杂的分子克隆技术，掌握了生物化学研究的核心实验技能这些技能不仅是生命科学研究的基础，也是医学诊断、药物开发和生物技术产业的关键支撑随着生命科学的快速发展，生物化学实验技术也在不断创新单分子检测、空间组学和活体成像等前沿技术正在改变我们研究生命的方式人工智能和大数据分析在生物化学研究中的应用，将进一步加速科学发现作为生命科学的学习者，我们应保持开放的思维，不断学习新知识和新技术，为揭示生命奥秘和改善人类健康贡献力量。