《生物色谱技术》课件

生物色谱技术生物色谱技术是现代生物科学研究和生物制药工业中不可或缺的关键分离技术它通过利用不同生物分子在固定相和流动相之间的分配差异，实现高效、高选择性的分离和纯化作为生物分析和分离的核心技术，色谱法在蛋白质、核酸、代谢物等生物大分子的研究中发挥着至关重要的作用通过本课程，我们将深入探讨生物色谱的基本原理、主要类型、关键应用以及最新发展趋势色谱技术历史与发展1起源阶段年，俄国植物学家首创色谱法，用于分1903Mikhail Tswett离植物色素他将植物提取物通过碳酸钙柱，观察到不同色素形成的彩色带，并首次使用色谱一词2发展阶段世纪年代，马丁和辛格发展了纸色谱和薄层色谱2040-60年，马丁和辛格因在色谱领域的贡献获诺贝尔化学奖，1952推动了色谱技术的快速发展3现代阶段世纪年代至今，高效液相色谱、气相色谱质谱2070HPLC-联用技术等现代色谱技术迅速发展，与生命科学深度GC-MS融合，成为生物研究的核心工具色谱技术的基本定义基本概念分离机制色谱技术是利用混合物中各组分当混合物通过色谱系统时，不同在固定相与流动相之间分配系数组分因其物理化学性质差异，在不同，通过反复多次分配平衡过两相间的分配行为不同，导致迁程，实现各组分分离的技术方法移速率差异，最终实现分离生物应用优势色谱法具有高选择性，能够在极其复杂的生物样品中分离出特定目标物质，而不会破坏其生物活性，为生物分子分析提供理想工具色谱技术的基本过程包括样品引入、分离、检测和数据处理四个环节在生物研究中，它能够处理从微量到大规模的各类样品，适用于实验室分析和工业生产色谱法的核心原理样品引入含多种组分的混合物被引入色谱系统分配平衡各组分在固定相和流动相间建立动态平衡差异迁移组分因亲和力差异以不同速率移动组分分离保留时间差异导致各组分完全分离色谱分离的核心在于各组分在两相间多次建立分配平衡分配系数（为组分在固K=Cs/Cm Cs定相中的浓度，为组分在流动相中的浓度）分配系数越大，组分在色谱柱中滞留时间越长Cm通过调整流动相组成、值、温度等参数，可以改变各组分的分配系数，优化分离效果这种多pH次平衡过程使色谱法具有极高的分离效率和选择性色谱法两相体系固定相流动相固定相通常为多孔固体材料或涂覆在惰性载体表面的液体，是色流动相可以是液体或气体，负责携带样品通过固定相流动相的谱分离的关键组成部分根据分离目标的不同，可选择不同类型选择直接影响分离效果的固定相水有机溶剂常用于反相色谱•-多孔硅胶表面活性高，常用于吸附色谱•缓冲溶液调节和离子强度•pH键合硅胶疏水性强，适合反相色谱•C18梯度洗脱逐渐改变流动相组成•离子交换树脂带电基团，用于离子交换色谱•等度洗脱保持流动相组成不变•凝胶材料定义孔径，适用于分子筛分•两相间的相互作用力包括范德华力、氢键、静电力、疏水作用等，共同决定了分离效果色谱法的主要分类吸附色谱分配色谱基于样品组分与固定相表面的吸附力差基于组分在两种不互溶液体间的溶解度异差异常用硅胶、氧化铝等极性吸附剂包括正相和反相两种模式分子排阻色谱离子交换色谱根据分子大小和形状进行筛分利用带电基团与样品离子间的静电作用适用于大分子的分离和分子量测定广泛用于蛋白质和核酸分离不同类型的色谱技术各有其适用范围和优势在实际应用中，通常会根据样品特性和分离目标选择最合适的色谱类型，有时还会采用多种色谱方法联用，以获得最佳分离效果生物色谱技术特点

99.9%分离纯度生物色谱可实现极高纯度分离，满足生物制药和研究需求⁻ng·g¹检测灵敏度现代色谱技术可检测纳克级别的生物分子分钟10分析速度高效色谱系统可在短时间内完成复杂样品分析1000+理论塔板数高效色谱柱可达数千理论塔板，保证分离效率生物色谱技术的特点使其成为分析复杂生物样品的理想工具它能在保持生物活性的条件下，实现高效、高选择性的分离，同时兼具良好的重现性和准确性与传统分离方法相比，生物色谱技术具有样品消耗少、操作简便、自动化程度高等优势，能够满足从基础研究到工业生产的各种需求生物色谱的常见类型高效液相色谱离子交换色谱凝胶色谱亲和色谱（）AC（）（）（）HPLC IECSEC/GFC利用生物分子之间的特异利用高压驱动流动相，通利用蛋白质等生物分子表也称分子排阻色谱，根据性识别（如抗原抗体、-过填充细小颗粒的色谱柱面电荷与固定相上带电基分子大小差异进行分离酶底物）实现高选择性-实现快速高效分离广泛团的相互作用实现分离大分子被排除在凝胶孔隙分离，是生物分子纯化的应用于各类生物分子分析，可根据分子的等电点差异外而先流出，小分子进入强大工具是最常用的色谱技术之一进行高分辨率分离孔隙后流出较慢吸附色谱基本原理表面吸附样品组分通过范德华力、氢键、偶极相互作用等被固定相表面吸附吸附强度取决于分子极性、官能团特性以及固定相表面性质竞争解吸流动相分子与样品组分竞争固定相吸附位点，导致组分解吸并随流动相移动吸附强度弱的组分先被解吸并洗脱出色谱柱分离实现不同组分因吸附强度差异而以不同速率移动，最终实现分离通过调整流动相极性或使用梯度洗脱可优化分离效果在吸附色谱中，常用的吸附剂包括硅胶（极性很强）、氧化铝（极性强）和活性炭（极性弱）等硅胶表面的硅羟基是主要的吸附活性位点，能够与极性分子形成氢键吸附色谱特别适合分离结构相似但极性差异明显的化合物，在生物分析中常用于多肽、抗生素等的分离纯化吸附色谱的生物应用多肽分离与纯化抗生素分离微量生物分子分析利用多肽分子中不同氨基酸侧链与吸附剂利用抗生素分子与硅胶等吸附剂的相互作吸附色谱具有高灵敏度，能够富集和分离表面的相互作用强度差异，实现结构相似用，结合梯度洗脱技术，实现不同抗生素复杂生物样品中的微量组分结合质谱等多肽的高效分离常用于合成多肽的纯化的分离和纯化广泛应用于抗生素生产和检测手段，可实现痕量生物活性物质的鉴和天然多肽的制备质量控制定和定量吸附色谱在生物样品预处理中也发挥着重要作用，特别是固相萃取技术，可以有效去除干扰物质，富集目标分析物，提高后续分析的准确性和灵敏度分配色谱基本机制液体固定相液体涂覆在惰性载体表面形成固定相分配平衡样品组分在两个不互溶液相间建立分配平衡溶解度差异不同组分因溶解度差异在两相间分配不同分离实现溶解度差异导致各组分迁移速率不同而分离分配色谱可分为正相和反相两种模式正相色谱使用极性固定相（如水或甘油）和非极性流动相（如己烷），适合分离极性化合物；反相色谱则相反，使用非极性固定相（如键合硅胶）和极性流动相（如水甲醇混合物），适合分离非极性化合物C18-在生物分析中，反相色谱因其良好的稳定性和广泛的适用性，成为最常用的分配色谱模式，特别是在系统中应用广泛HPLC分配色谱的生物应用分配色谱在生物样品分析中有着广泛应用，尤其适合处理中等极性至非极性的生物分子脂类分析是其典型应用领域，包括磷脂、甘油三酯、脂肪酸等的分离与定量反相能够高效分离结构相似但疏水性略有差异的脂质分子HPLC甾体激素分析是另一重要应用，利用反相色谱可以分离血清、尿液或组织中的各种甾体激素，如雌激素、孕激素和皮质激素等通过优化流动相组成和梯度条件，可实现多种甾体激素的同时分析在代谢组学研究中，分配色谱是分析生物体内代谢产物的重要工具结合质谱技术，可以检测和鉴定数百种代谢物，为疾病诊断和药物研发提供关键信息离子交换色谱基础基本原理离子交换剂类型离子交换色谱基于带电分子与固定相上带相反电荷的基团之间的静电相互作用当带阳离子交换剂含有负电荷基团（如₃⁻⁻），用于结合正电荷分子•-SO,-COO电样品通过离子交换柱时，与固定相上的离子交换基团形成可逆结合后续通过改变阴离子交换剂含有正电荷基团（如₃⁺₃⁺），用于结合负电荷分子•-NH,-NR流动相的值或盐浓度，使结合的分子依次洗脱pH根据交换基团的酸碱性质，又可分为结合强度取决于分子的电荷密度、电荷数目以及离子交换基团的性质带电荷多的分强酸性强碱性交换剂在宽范围内保持电离状态子结合更牢固，需要更高的盐浓度才能洗脱•/pH弱酸性弱碱性交换剂电离状态受影响大•/pH离子交换色谱在生物分离蛋白质分离核酸分离蛋白质表面带有多种带电氨基酸和分子骨架上带有大DNA RNA残基，其净电荷随变化利量磷酸基团，呈负电性，通常使pH用离子交换色谱可根据蛋白质等用阴离子交换色谱进行分离可电点差异实现高效分离强阳离根据核酸片段长度、构象差异实子交换剂如和现高分辨率分离，广泛应用于质SP-Sepharose强阴离子交换剂如粒制备、寡核苷酸纯化等领域Q-最为常用Sepharose糖类分析带电荷的糖类如唾液酸化糖、硫酸化糖等，可通过阴离子交换色谱进行分离结合脉冲安培检测技术，可实现复杂糖链的高灵敏度分析，为糖组学研究提供有力支持离子交换色谱在生物大分子分离中具有样品容量大、分辨率高、条件温和等优点，常作为蛋白质纯化的首选方法通过盐浓度或梯度洗脱，可实现精确控制的分级pH洗脱，满足各种生物分离需求分子排阻（凝胶）色谱机理小分子进入凝胶孔隙，洗脱慢中等分子部分进入孔隙，洗脱速度中等大分子被排除在孔隙外，最先洗脱分子排阻色谱也称凝胶过滤色谱或凝胶渗透色谱，是唯一不依赖于样品组分与固定相间相互作用的色谱技术其分离完全基于分子大小差异，GFC GPC固定相为具有特定孔径分布的多孔凝胶颗粒在分子排阻色谱中，洗脱顺序与其他色谱技术相反分子量大的组分因无法进入凝胶孔隙而沿颗粒间隙快速通过色谱柱，最先洗脱；分子量小的组分可进入凝胶孔隙，有更长的迁移路径，洗脱较慢通过选择合适孔径的凝胶材料，可以优化特定分子量范围内的分离效果常用的凝胶材料包括葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼Sephadex Bio-Gel P脂糖凝胶等Sepharose分子排阻色谱生物应用亲和色谱原理特异性结合洗脱非特异结合物目标分子与固定相上的配基结合洗脱缓冲液去除非特异结合的杂质竞争性洗脱获得纯化产物通过加入游离配基或改变环境条件解离目标收集含高纯度目标分子的洗脱液3分子亲和色谱基于生物分子间高度特异的识别和结合，如酶与底物、抗原与抗体、受体与配体等这种生物特异性使亲和色谱成为生物大分子分离纯化的最具选择性的方法配基是亲和色谱的关键，它需要与目标分子有高亲和力和特异性，同时能够共价连接到固定相载体上常用的载体材料包括琼脂糖、纤维素和聚丙烯酰胺等亲水性高分子材料，它们提供了连接配基的活性基团和良好的生物相容性亲和色谱应用举例抗体纯化酶纯化重组蛋白纯化亲和色谱是抗体纯化的金标准利用酶与其底物或抑制剂的特异性结合实现高金属螯合亲和色谱是纯化标签重组Protein A/G IMACHis主要来源于金黄色葡萄球菌，能特效纯化例如，凝血酶可通过苄胺琼脂糖亲和蛋白的常用方法镍或钴离子螯合在载体上，Protein A-异性结合多种抗体的区域在抗体纯化过程柱纯化；依赖性酶可通过琼脂糖柱能特异性结合蛋白端或端引入的组氨酸标签Fc ATPADP-N C中，样品通过色谱柱，抗体被特异纯化这种方法常能在一步操作中获得高纯度这种方法操作简便，纯化效率高，已成为重组Protein A性捕获，而其他蛋白则直接流出随后通过低活性酶，大大简化了传统多步纯化流程蛋白表达系统的标准配套技术缓冲液洗脱获得高纯度抗体pH亲和色谱因其高选择性和高效率，已成为生物制药工业中蛋白质纯化的首选方法，特别是在单克隆抗体、重组蛋白和疫苗生产中发挥着不可替代的作用高效液相色谱系统组成HPLC输液系统高压泵提供稳定流量和高压可达•

0.1-10ml/min6000psi脱气装置去除流动相中气泡•混合器实现梯度洗脱•进样系统自动进样器精确定量注入样品•1-100μl进样阀最小化样品扩散•样品环保证注入体积一致性•分离系统色谱柱填充各类固定相•柱温箱精确控制分离温度•预柱保护主柱延长使用寿命•检测与控制系统检测器、荧光、质谱等•UV数据采集系统记录色谱图•控制软件操作及方法开发•高效液相色谱系统是现代生物分析的核心设备，其高效率、高分辨率和高自动化程度使其成为生物分子分析的首选工具现HPLC代系统集成度高，操作简便，可满足从常规分析到复杂生物样品分离的各种需求HPLC核心技术参数HPLC柱效理论塔板数反映色谱柱分离效率，柱效越高，峰形越窄，分离度越好现代柱N HPLC理论塔板数可达米柱效受固定相粒径、流速、温度等因素影10,000-100,000/响选择性因子选择性因子表示两组分在色谱系统中保留行为的差异，₂₁，其中为容量αα=k/kk因子值越大，表明两组分分离越容易通过调整流动相组成、值等可改变选择αpH性分离度分离度是衡量色谱分离效果的综合指标，₂Rs Rs=

1.18tR-₁₁₂₁₁₂₂表示基线分离分离度与柱效、选择性因子tR/W/,+W/,Rs≥

1.5和容量因子都有关系色谱柱特性柱是最常用的反相色谱柱，适用于多数生物样品柱较极性略强，C18ODS C8C18适合分析较极性化合物柱长、内径和粒径影响分离效果和分析时间在生物分离案例HPLC多肽药物分析是的重要应用领域胰岛素、生长激素等治疗性多肽药物常使用反相进行纯度分析和含量测定结合质谱检测，可实HPLC HPLC现多肽序列确认和修饰位点鉴定和药典规定，多肽药物纯度和含量测定必须采用方法FDA HPLC维生素分析也广泛依赖技术水溶性维生素族、可采用阴离子交换色谱或反相色谱；脂溶性维生素、、、则主要通过反相HPLC BC AD EK色谱分离通过优化检测波长和流动相组成，可实现维生素的高灵敏度测定，检测限可达级别ng/mL神经递质分析是在神经科学研究中的关键应用多巴胺、羟色胺等递质可通过反相结合电化学检测器实现高灵敏度分析这种HPLC5-HPLC方法已成为研究神经系统功能和相关疾病的基础技术毛细管电泳色谱简介技术特点主要应用毛细管电泳色谱是结合电泳和色谱原理的微型化分离技术其分离基于分子在电场作用下的迁移速率差异，同时也利用了分析是最成功的应用之一在人类基因组计划中，技术发挥了关键作用，用于测序和基因分型利用毛细管凝CE DNACE CEDNA分子与毛细管壁及填充物的相互作用胶电泳，可在几分钟内分离出几百个碱基对差异的片段DNA的主要优势包括蛋白质分析也是的重要应用领域毛细管区带电泳能够根据蛋白质电荷质量比实现高效分离，特别适合分析蛋白质CE CECZE/异构体和翻译后修饰极高的分离效率，理论塔板数可达百万量级•小分子药物和代谢物分析同样可受益于技术通过优化缓冲液组成和添加环糊精等添加剂，可实现手性药物的拆分分析样品和试剂消耗极少，通常为级CE•nL分析速度快，通常只需几分钟•适用于分离带电荷生物大分子•生物分离工程中的色谱流程样品准备样品收集、稳定化处理、预纯化等初步处理步骤可能包括离心、过滤、沉淀等操作，目的是去除悬浮物和不溶性杂质，保证样品适合后续色谱分离分离方法选择根据目标物性质选择适当色谱类型考虑因素包括目标物分子量、溶解性、稳定性、电荷特性以及样品基质复杂程度通常蛋白质纯化采用多步策略，结合不同原理的色谱方法3条件优化调整流动相组成、、离子强度、温度等参数优化目标包括提高分辨率、缩pH短分析时间、提高回收率、保持生物活性等通常采用设计实验法系统优化分离条件规模化与放大从分析规模扩大到制备规模放大过程需保持关键参数不变，如线速度、样品负载比等工业生产中需考虑工艺稳健性、经济性和可重复性色谱操作中的样品预处理过滤离心脱盐使用滤膜去除颗通过高速离心使用分子排阻色谱、透析或超滤

0.22-

0.45μm10,000-粒物和微生物，防止色谱柱堵塞分离不溶性物质和细去除干扰盐离子脱盐对离子交20,000g生物样品通常需要先离心再过滤，胞碎片对于细胞裂解物，通常换色谱尤为重要，高盐会影响样以延长滤膜使用寿命尤其对需要先低速离心去除品与固定相的结合脱盐同时可3,000g样品，过滤是必不可少的大颗粒，再高速离心去除微粒实现缓冲液交换，调整样品至最HPLC步骤超速离心可用于亚细胞组分分离适条件浓缩与稀释根据需要调整样品浓度，避免过载或检测不足浓缩常用方法包括冷冻干燥、超滤、沉淀等稀释需使用与流动相相容的溶剂，避免引入沉淀或峰形变形样品预处理是影响色谱分离成功与否的关键环节良好的预处理不仅能提高分离效率和检测灵敏度，还能延长色谱柱使用寿命，减少系统故障对于生物样品，保持预处理过程中的低温环境通常°是防止4C生物活性丧失的重要措施色谱柱的装填与选择生物大分子的色谱分离难点易变性失活复杂基质中目标低丰度/蛋白质等生物大分子在色谱分离过程生物样品如血清、细胞裂解液中，目中容易因有机溶剂、极端、高盐浓标蛋白可能只占总蛋白的微小比例如pH度或剪切力等因素导致变性或失活这种大海捞针的挑战需

0.01%这要求色谱条件必须温和，通常需在要高选择性方法，如亲和色谱，或多生理范围内操作，并避免使用高浓步分离策略结合不同原理的色谱方法pH度有机溶剂某些酶类还需添加特定同时，需要高灵敏度检测技术来识别稳定剂，如金属离子或还原剂低丰度组分结构异质性生物大分子常存在多种异构体、糖基化变体或其他翻译后修饰形式这些微小差异给完全分离带来挑战解决方案包括使用高分辨率色谱系统，如基于亚微米填料的，或结合多维色谱技术，以不同分离机制进行正交分离UHPLC解决生物大分子色谱分离难题需要全面的方法优化和系统设计温度控制是关键因素之一，许多蛋白质分离需在°低温环境进行以维持活性同时，添加适当的缓冲剂、盐类和辅助4C因子可显著提高生物分子在色谱过程中的稳定性色谱数据的基本解读峰位分析峰高与峰面积峰形评价保留时间是色谱峰从进样到达峰顶所需时峰高和峰面积是定量分析的基础峰高易受峰理想色谱峰应呈高斯分布，对称性好峰不对tR间，是物质定性的主要依据相同条件下，特展宽影响，而峰面积则更为准确，尤其对非对称性通常由固定相活性位点非均匀分布、样品定物质有其特征保留时间保留因子称峰现代色谱工作站软件可自动积分计算峰过载或色谱柱老化等原因导致拖尾因子和k=tR-Tf反映物质与固定相亲和力强弱，值在面积，但需正确设置基线和积分参数峰面积不对称因子是评价峰形的重要参数，理想值t0/t0k As范围内最适合分析峰位可能受温度、与样品浓度在一定范围内呈线性关系，是定量应接近严重拖尾或前伸会影响分离效果和2-

101.0流速、流动相组成等因素影响分析的基础定量准确性色谱图是色谱分析的核心数据，其中包含丰富的定性和定量信息基线稳定性、噪音水平和信噪比也是评价色谱质量的重要指标良好的色谱系统应具有稳定基线、低噪音和高信噪比，以确保微量分析的准确性色谱定性与定量分析定性分析通过保留时间与标准品比对确认物质身份标准曲线建立2分析一系列已知浓度标准品，建立峰面积浓度关系-定量计算3根据样品峰面积和标准曲线计算未知样品浓度方法验证4评估方法的精密度、准确度、线性范围和检测限外标法是最常用的色谱定量方法，通过与一系列已知浓度标准品比对实现定量内标法则通过向样品中加入已知量的内标物质，利用样品与内标峰面积比进行定量，可有效补偿进样误差和仪器波动，提高定量准确性生物样品定量分析常面临基质效应干扰，可通过基质匹配标准品、标准加入法或同位素稀释法解决蛋白质定量通常采用外标法，结合检测或荧光检测，UV280nm可实现高灵敏度定量小分子代谢物分析则常结合质谱检测，灵敏度可达皮克或飞克级别自动化与高通量色谱自动进样智能梯度高精度自动进样器可连续处理数百个样品程序控制流动相组成变化，优化分离效率2并行分析多维分离多通道系统同时处理多个样品正交色谱机制结合，提高分离能力现代自动化色谱系统极大提高了分析效率和样品处理能力自动进样器可小时不间断工作，配合样品管理软件，实现样品的自动识别、追踪和数24据管理智能梯度系统可根据样品特性自动优化洗脱条件，缩短分析时间并提高分辨率多维色谱技术是提高分离能力的有效手段，特别适合复杂生物样品分析二维液相色谱常结合两种正交分离机制，如离子交换与反相色谱，2D-LC大幅提高峰容量自动切换阀实现了一维分离的馏分自动转移到第二维分离，无需人工干预生物色谱常用检测器检测器类型检测原理检测限适用范围紫外检测器化合物对特定波长级含发色团的生物分子UV ng光吸收UV二极管阵列检测器全波长光谱级需要光谱确证的分析UV-Vis ng扫描DAD荧光检测器分子受激发后发射荧级天然或衍生化荧光物FLD pg光质示差折光检测器测量样品与参比溶液级糖类等无发色团物质RIμg折光率差异质谱检测器分子电离后按质荷比级需高灵敏度或结构确MS fg-pg分离检测证的分析检测器是最常用的色谱检测器，简单可靠且成本低蛋白质通常在芳香族氨基酸或UV280nm肽键检测；核酸在有强吸收；多数药物在范围内有特征吸收检214nm260nm200-400nm DAD测器可同时记录全波长谱图，有助于峰纯度检查和化合物确认质谱检测器是现代生物分析的强大工具，不仅灵敏度高，还能提供分子量和结构信息常用的离子化技术包括电喷雾和大气压化学电离串联质谱通过多级碎裂提供更详细结构信息，是蛋ESI APCIMS/MS白质组学和代谢组学研究的核心技术色谱仪器维护与常见故障泵系统问题柱压异常基线问题泵漏液是常见故障，通常由密封圈磨损或背压升高常由色谱柱堵塞、进样器滤膜阻基线漂移可能由温度波动、流动相混合不阀门问题导致表现为流量不稳定、基线塞或系统管路堵塞引起解决方法包括反充分或检测器灯老化引起噪音增大则常波动或压力异常维护措施包括定期更换向冲洗色谱柱、更换进样器滤膜和检查连与检测器问题或电气干扰有关解决措施密封圈约个月一次，清洗和更换进接管路背压过低则可能是泄漏或连接松包括控制实验室温度、延长流动相混合时3-6出口单向阀，以及泵头的定期清洗使用动导致，需检查所有连接处和管路色谱间、更换检测器灯和定期清洗流通池流高盐缓冲液后应用纯水冲洗系统，防止盐柱应定期进行性能测试，监控柱效变化动相应事先脱气，避免气泡导致的基线跳析出损坏泵动预防性维护是确保色谱系统长期稳定运行的关键建立规范的维护计划，包括日常检查、周维护和月度季度深度维护每次使用后应用适当溶剂冲洗系/统，特别是使用了盐或缓冲液后定期校准流量、波长和温度等关键参数，确保分析数据可靠生物色谱分离案例蛋白纯化捕获阶段目标是从复杂混合物中初步分离目标蛋白，去除大部分杂质通常采用亲和色谱如抗体的亲和柱或离子交换色谱这一步可实现倍的纯化倍数，回收Protein A10-100率通常在样品负载量大，允许较高流速操作70-90%中间纯化进一步去除主要杂质，提高纯度至常用方法包括不同或盐梯度的离子交80-90%pH换色谱，或疏水相互作用色谱这一步着重于分离性质相似的杂质蛋白，通常需HIC要优化洗脱条件以提高分辨率精制阶段最终纯化步骤，目标是获得高纯度产品通常采用分子排阻色谱去除聚95%SEC集体和低分子量杂质，或高分辨率离子交换色谱去除带电性质相近的杂质这一步样品负载量较小，注重分辨率而非产量质量分析对纯化产品进行多方位表征，包括评价纯度，西方印迹确认身份，质谱分SDS-PAGE析分子量和修饰，以及活性测定确保功能完整性高效分析方法如和可RP-HPLC CE检测微量杂质和变体生物色谱分离案例核酸质粒纯化寡核苷酸纯化分离与纯化DNA RNA质粒纯化常采用阴离子交换色谱，利用合成寡核苷酸通常含有截短序列和保护基未完全去纯化面临的主要挑战是防止酶降解和维DNA DNA RNA RNA骨架上磷酸基团的负电荷与固定相上的正电荷基团除的副产物，需要高效纯化反相是最常用持完整性常用的色谱方法包括硅胶吸附和阴HPLC RNA相互作用采用氯化钠梯度洗脱，可有效分离质粒的纯化方法，利用寡核苷酸长度和疏水性差异实现离子交换色谱对于等小的分离，常miRNA RNA与、蛋白质和基因组等杂质现代分离对于修饰寡核苷酸如荧光标记或生物素化，采用反相色谱或凝胶排阻色谱纯化过程必须使用DNA RNADNA快速质粒纯化柱通常结合硅胶吸附技术，在高盐条常结合亲和色谱进行纯化离子对处理的无酶试剂，并保持低温操作现IP-RP-HPLC DEPCRNA件下选择性结合，而和蛋白则流出反相特别适合分离长度相近的寡核苷酸代纯化试剂盒常结合离心柱色谱技术，实现快DNARNAHPLC RNA速高效分离核酸色谱分离技术在基因组学、转录组学研究和基因治疗药物生产中发挥着关键作用高分辨率色谱技术能够分离单核苷酸差异的片段，为基因分DNA/RNA型和突变检测提供强大工具生物药物分离与检测单克隆抗体分析疫苗分析单克隆抗体是目前最重要的生物药物类别，其分析和质控严重依赖色谱技术主要分析项目包括疫苗产品通常含有多组分活性物质，其分析挑战性高不同类型疫苗采用不同色谱策略mAb纯度分析用于检测聚集体和片段；检测电荷变体病毒疫苗分析完整病毒颗粒，检测病毒蛋白•SEC CEX•SEC RP-HPLC糖基化分析结合质谱检测糖链分布蛋白亚单位疫苗离子交换和反相色谱评价纯度和含量•HILIC N-•鉴别测试肽图谱法反相分析酶切片段多糖疫苗和阴离子交换色谱测定分子量分布和纯度•HPLC•SEC含量测定法疫苗分析完整性和纯度•UV-HPLC•mRNA IP-RP-HPLC mRNA多种色谱方法联用可提供抗体全面表征，确保批间一致性和生物相似性蛋白质组学中的色谱技术10,000+单次分析蛋白数现代系统可在单次运行中鉴定数千种蛋白质LC-MS/MS1-10pg检测灵敏度最新技术可检测皮克级低丰度蛋白个3-5鉴定所需肽段数可靠蛋白鉴定通常需要多个独特肽段证据95%+鉴定准确率现代数据库检索算法可实现高可信度鉴定蛋白质组学研究依赖于高效色谱分离与质谱联用技术经典工作流程包括蛋白质提取、酶切、肽段分离和质谱分析四个主要步骤色LC-MS/MS谱分离是提高蛋白识别覆盖率的关键环节，常采用反相液相色谱分离肽段混合物RPLC多维色谱技术可大幅提高分离能力和蛋白鉴定数量常见的二维分离策略为强阳离子交换与反相色谱联用，先按肽段电荷分级，再按SCX RPLC疏水性分离现代全自动系统可实现在线二维分离，无需人工操作，同时减少样品损失糖组学色谱分析游离糖分析糖蛋白糖链分析阴离子交换脉冲安培检测整体糖蛋白分析通常采用亲和色谱如凝•-HPAEC-•无需衍生化，高灵敏检测还原集素亲和富集PAD糖疏水相互作用色谱适合极性糖释放型糖链分析常采用或反相•HILIC•N-HILIC类分离色谱多糖分子量分析通常采用结合多角糖肽分析采用或•SEC•HILIC-MS/MS RP-度光散射检测鉴定修饰位点MALS MS/MS糖链分析通常需消除释放后分析•O-β-衍生化增强检测氨基苯甲酸或氨基苯甲酰胺标记增强荧光检测•2-2-AA2-2-AB还原胺化引入质谱标签，实现相对定量•标记过程通常需优化反应条件，确保完全转化•多种糖链异构体分离需高分辨率色谱系统•糖组学色谱分析面临的主要挑战是结构多样性和异构体复杂性单一糖链可能存在多种连接方式和分支结构，要求色谱系统具有极高分辨率现代糖组学研究通常结合酶消化如释放糖链、PNGase FN-色谱分离和质谱分析，实现全面结构表征代谢组学色谱应用代谢组学研究通过综合分析生物样品中的小分子代谢物，揭示生物系统的生理状态和代谢网络色谱质谱联用技术是代谢组学研究的核心平台，能-LC-MS够检测和定量数百至数千种代谢物根据研究目标，代谢组学分析可分为靶向分析针对特定代谢物和非靶向分析全谱扫描两种策略反相液相色谱是分离非极性和中等极性代谢物的首选方法柱常用于脂质、类固醇、有机酸等化合物分析极性代谢物如氨基酸、糖类、核苷酸RPLC C18则更适合分离通过正交组合和，可显著提高代谢物覆盖面离子对试剂如三乙胺的添加可改善带电代谢物的保留和峰形HILIC RPLCHILIC质谱检测器为代谢物提供高灵敏度检测和结构信息高分辨率质谱如、可提供精确分子量，辅助代谢物鉴定串联质谱通过碎片Q-TOF OrbitrapMS/MS模式进一步确认结构代谢组学数据处理通常需要专业软件和数据库支持，如、和等XCMS CompoundDiscoverer HMDB生物色谱相关法规与标准药典标准要求标准GMP/GLP ISO各国药典如中国药典、美国生物制药行业色谱分析必须是测试和ISO/IEC17025药典、欧洲药典对遵循药品生产质量管校准实验室能力的国际标准，USP EPGMP色谱分析方法有详细规定，理规范或药物非临床规定了质量管理体系和技术GLP包括系统适用性测试、方法研究质量管理规范要求这能力要求生物分析实验室验证要求和仪器性能标准包括仪器确认、通常需获得认证，证明IQ/OQ/PQ ISO生物药物分析通常需遵循药方法验证、标准操作规程其分析结果的可靠性ISO典通则和各论要求，确保结、人员培训和数据完质量管理体系也常被SOP9001果准确可靠药典方法经过整性管理等方面电子记录色谱仪器制造商采用，确保全面验证，具有权威性，但需符合要产品质量一致性某些特殊21CFR Part11更新较慢，有时不能满足最求，确保数据可追溯性和完领域还有专门标准，如ISO新技术需求整性医学实验室ISO15189生物色谱方法验证是确保分析质量的关键环节，通常需评估特异性、线性范围、准确度、精密度、检测限、定量限、稳定性和耐用性等参数对于生物分析方法，还需特别关注基质效应和样品稳定性指南提供了分析方法验证的详细框架，被全球广泛采用ICH Q2R1绿色生物色谱技术发展环保溶剂替代使用水、乙醇等低毒性溶剂溶剂用量减少微型化和高效系统降低资源消耗生物可降解材料3开发环保型色谱填料和耗材绿色色谱技术旨在减少环境影响并提高可持续性，同时保持或提升分析性能传统常使用乙腈、甲醇等有机溶剂，不仅有毒性和环境危害，还面临HPLC价格波动和供应问题绿色色谱策略包括使用低毒替代溶剂如乙醇代替乙腈、减少溶剂消耗如技术、回收再利用溶剂等UHPLC水相色谱技术是一个重要发展方向，如高温水色谱利用高温下水极性降低的特性，在纯水中实现类似有机溶剂的分离效果超临界流体色谱HTWC使用超临界₂作为主要流动相，极大减少有机溶剂用量，特别适合疏水性生物分子分析SFC CO生物可降解填料的开发也取得进展，如基于壳聚糖、纤维素等天然聚合物的色谱填料这些材料不仅环保，还具有独特选择性，适合特定生物分子分离新型绿色检测技术，如无标记检测方法，也减少了有毒试剂使用，符合绿色分析化学理念微流控色谱芯片技术特点生物应用微流控色谱芯片将色谱系统微型化集成在厘米级芯片上，通过精密微通道网络实现样品处理、分离和检测其主要特点包括微流控芯片在生物分析领域应用广泛•样品和试剂消耗极少通常nL-μL级•单细胞分析捕获单个细胞并分析其内含物•分析速度快秒至分钟级•蛋白质分析微型化电泳和色谱分离蛋白质高度集成化样品前处理、分离、检测一体化核酸分析扩增和毛细管电泳分离••PCR•便携性好，适合现场和即时检测•体外诊断即时检测POCT生物标志物可并行多通道分析，提高通量药物筛选高通量药效和毒性评价••制造工艺多借鉴半导体工业技术，如光刻、刻蚀、键合等，材料包括玻璃、硅、聚合物、等微流控芯片特别适合精准医疗和个体化诊断，可处理极少量珍贵样本如循环肿瘤细胞、微量活检，提供快速结果指导临床决策PDMS PMMA色谱法与人工智能结合方法开发智能优化数据处理与分析人工智能算法能够预测色谱分离条件对结果机器学习算法能够从复杂色谱图谱中提取有的影响，显著加速方法开发过程与传统用信息，增强数据解读能力深度学习模型试错法相比，辅助方法开发可减少可自动识别复杂基质中的目标峰，即使在共AI80%以上的实验次数系统可基于少量初始实验洗脱或部分重叠情况下也能准确定量模式数据，构建预测模型，推荐最优分离条件识别技术能够发现常规分析可能忽略的微小如流动相组成、值、温度等某些先差异，特别适用于批次一致性评价和生物相pH进系统还能自动执行实验，收集数据，并迭似性分析算法还能自动评估数据质量，AI代优化方法，实现全自动方法开发标记可疑结果，降低人为错误结构预测与鉴定系统能够基于色谱质谱数据预测未知化合物结构，加速新物质鉴定通过分析保留行为和质谱AI-碎片模式，系统可推断未知分子的结构特征，大幅缩小候选结构范围这在代谢组学和天然产物研究中特别有价值，可帮助发现新代谢物和生物活性分子先进系统能够整合多种谱学数据，提供更准确的结构预测人工智能与色谱技术的结合正在改变生物分析领域的研究模式，从被动分析转向主动预测和发现基于云计算的协作平台使研究人员能够共享方法和数据，构建更强大的预测模型未来，自主学习系统有望实现色谱分析全过程的智能化，包括样品制备、分析条件选择、数据处理和结果解读，显著提高研究效率和发现能力色谱与实验动物样品分析血清血浆样品分析/动物血清血浆是药代动力学和生物标志物研究的主要样品类型由于其基质复杂，通常需要蛋白沉淀如、有机溶剂、液液萃取或固相萃取等前处理微量血浆样品分析通常采用微量进/TCASPE样技术或微孔板自动化处理是分析动物血浆中药物和代谢物的标准方法，检测限可达级别SPE UPLC-MS/MS pg/mL组织样品处理组织样品分析更具挑战性，需要均质化处理将固体组织转化为可注入样品常用技术包括机械匀浆、超声破碎和冷冻研磨提取缓冲液组成对回收率影响显著，通常需根据目标分析物特性优化内标添加时机也很关键，一般应在均质前添加，以补偿提取过程的损失组织样品往往需要更复杂的清除过程，如除脂、去蛋白和净化SPE蛋白质组定量实验动物组织和体液中蛋白质组分析是理解疾病机制和药物作用的重要手段同位素标记技术如、结合色谱质谱联用，可实现多个样本间蛋白表达水平的相对定量比较目标蛋白绝TMT iTRAQ-对定量则常采用多反应监测或平行反应监测技术，使用同位素标记内标肽段作为定量参考这些方法广泛应用于生物标志物发现和验证研究MRM PRM实验动物样品分析需特别注意伦理规范和原则替代、减少、优化微型化分析技术允许从同一动物获取多个时间点样品，减少实验动物使用样品管理系统对确保样品溯源性和分析过程质量控制至关重要，特别是在药物开发法规研究中3R生物制药行业色谱趋势生物色谱与单细胞分析单细胞分离使用流式细胞术、微流控装置或激光捕获显微切割技术实现单个细胞的分离和收集微流控芯片技术能够高效捕获和处理单个细胞，常与后续分析平台无缝集成最新技术可实现高通量单细胞分选，每小时处理数千至数万个单细胞样品处理采用微量样品处理技术提取和富集单细胞中的目标分子针对蛋白质分析，常使用纳米级固相萃取芯片或免疫捕获技术富集目标蛋白对于核酸分析，则采用微型化的裂解和纯化流程，保证高回收率样品处理通常需在封闭系统内完成，避免微量样品损失超高灵敏度分析利用纳升级色谱系统结合高灵敏度检测器分析单细胞组分纳流液相色谱结合高分nanoLC辨质谱是单细胞蛋白质组学的核心技术，检测限可达阿托摩尔级别基于毛细管电泳的分离系统特别适合单细胞代谢物分析，提供极高的分离效率和灵敏度单细胞色谱分析技术正在改变我们理解细胞异质性的方式，揭示了传统混合细胞分析无法发现的生物学信息例如，在肿瘤研究中，单细胞蛋白质组分析展示了肿瘤细胞群体内惊人的功能多样性，有助于理解药物抵抗机制和复发原因在神经科学领域，单细胞代谢组学揭示了不同神经元类型独特的代谢特征，为神经退行性疾病研究提供新视角未来发展方向包括进一步提高通量、降低检测限，以及实现活细胞实时监测结合空间组学技术，未来有望在保留组织空间信息的同时，获得单细胞分辨率的分子谱图，为精准医学提供强大工具色谱分离的质量控制质量参数计算公式理想值影响因素色谱纯度目标峰面积总峰面分离条件、样品负载/95%积×量100%回收率实际回收量理论总洗脱条件、吸附损失/80%量×100%分离度流动相、柱效、选择Rs2tR2-tR1/w1+w

21.5性拖尾因子固定相活性、过载Tf W

0.05/2f

0.9-

1.2理论塔板数越高越好粒径、流速、温度N16tR/w²生物药物批间一致性评价是色谱质量控制的重要应用现代生物制药通常使用指纹图谱方法，通过比较多个批次的色谱谱图模式，评估工艺一致性常用统计工具包括相似度分析、主成分分析和聚类分PCA析等，能够客观量化批次差异，建立合理接受标准系统适用性测试是每次分析前确保色谱系统正常运行的关键步骤典型的参数包括保留时间重SST SST现性、峰面积精密度、分离度和拖尾因子等建立控制图可实现长期系统性能监控，及时发现性能下降趋势，预防分析失败对于生物样品分析，验证方法稳健性尤为重要，通常需评估样品稳定性、基质效应和方法转移适应性等方面生物分离新型色谱材料磁性纳米颗粒磁性纳米颗粒结合生物识别元件，可实现快速高效的生物分子分离表面功能化的磁性颗粒可修饰抗体、抗原、蛋白质或特异性配体，用于靶向捕获目标分子分离过程无需传统色谱MNPs A/G柱，仅通过外加磁场即可实现固液分离，大幅简化操作流程这种技术特别适合处理浑浊或高黏度生物样品，如全血、细胞裂解液等-分子印迹聚合物分子印迹聚合物是一类能特异识别目标分子的人工材料，被称为人工抗体通过在聚合物合成过程中使用模板分子，形成与目标分子匹配的三维结合位点与生物识别元件相比，MIPsMIPs具有更高的化学稳定性和更低的成本，可在极端条件下使用已成功应用于多种生物分子分离，包括激素、抗生素、蛋白质和核酸等MIPs MIPs整体柱材料整体柱是一种新型色谱填料，由连续多孔材料构成，而非传统的分立颗粒其独特的结构提供了优异的传质性能和低背压特点，特别适合生物大分子快速分离整体柱可基于硅胶或有机聚合物如聚甲基丙烯酸酯制备，表面可进行多种功能化修饰在蛋白质和核酸的高通量分析中，整体柱已显示出明显优势，分析时间可缩短以上50%新型色谱材料的发展极大拓展了生物分离的应用边界混合模式色谱填料结合多种分离机制如离子交换、疏水相互作用等，可在单一步骤中实现复杂样品的高效分离而超高压兼容的亚填料则将分离效率推向新高度，在保持相同分辨率的前提下，可将2μm分析时间缩短以上90%色谱法在环境与食品生物分析生物毒素分析食品掺假检测生物残留物监测环境和食品中的生物毒素是重要安全隐患，色色谱技术是鉴别食品掺假的有力工具蛋白质农药残留、兽药残留和环境污染物等生物残留谱技术是其检测的主要手段黄曲霉毒素、赭掺假如三聚氰胺添加可通过物监测是色谱技术的重要应用多残留分析通HILIC-MS/MS曲霉毒素等真菌毒素通常采用或技术检测；转基因成分鉴定常结合扩增和常采用前处理结合或HPLC-FLD PCRQuEChERS LC-MS/MS分析，灵敏度可达级毛细管电泳分析；食用油掺假可通过脂肪酸甲技术，可同时检测数百种目标物LC-MS/MS ppb-ppt GC-MS/MS水华毒素如微囊藻毒素则常用反相色谱结合紫酯的或指纹图谱分析识别乳制品中荷尔蒙和抗生素残留通常需要富集后进行GC HPLCSPE外检测或质谱检测海洋生物毒素如贝类毒素添加的增稠剂和防腐剂可通过离子排阻色谱结分析持久性有机污染物UHPLC-MS/MS通常需色谱分离，结合高分辨质谱确证合脉冲安培检测技术分析色谱同位素比质谱监测则常采用技术，近年与色HILIC-POPs GC-MS新型免疫亲和色谱柱可实现毒素的高选择性富技术可鉴别天然与合成香料的差异谱二维×技术结合，大幅提高复杂样品GC GC集和净化中微量污染物的检出能力环境和食品生物分析通常需要处理复杂基质中的极微量目标物，对方法灵敏度和选择性要求极高标准方法常由政府机构或国际组织制定，如中国国标、美国方GB FDA法、欧盟参考实验室方法等，确保结果的可比性和法律有效性随着公众对食品安全意识提高，快速便携式色谱分析系统正成为现场筛查的重要工具，可实现从农场到餐桌的全程监控色谱技术常见问题及解决基线问题峰形问题基线漂移是色谱分析中常见问题，可能由多种因素导致峰拖尾是影响定量准确性的常见问题，主要原因及解决方法温度波动使用柱温箱控制温度，避免实验室温度变化过载减少进样量，避免超出柱容量••流动相混合不均延长混合时间，检查混合器是否正常残留硅醇基团调整流动相，加入离子对试剂，或更换端封闭较好的柱••pH检测器灵敏度过高调整检测器参数，平衡灵敏度和信噪比死体积过大减少连接管长度，使用内径小的管路••流动相污染使用级试剂，过滤除气处理流动相二级相互作用添加适量竞争剂，如三乙胺抑制碱性化合物拖尾•HPLC•检测器老化按规定维护检测器，必要时更换灯或流通池柱老化反冲洗柱或更换新柱••周期性基线波动通常与泵脉动有关，可通过维修泵或使用脉冲阻尼器解决峰前伸通常与溶剂效应或化合物降解有关，可通过调整进样溶剂与流动相匹配度解决未来展望与新挑战超高分辨率系统集成发展超高分辨率色谱技术，解析复杂生物样品全流程自动化集成平台，从样品处理到数据分中微小结构差异析一体化微型化与便携化绿色与可持续4发展基于芯片的微型色谱系统，实现现场快速减少有机溶剂使用，开发环保材料和方法3分析生物色谱技术面临的主要挑战包括极端复杂样品的分离能力和超微量分析的检测灵敏度多维色谱技术将进一步发展，通过正交分离机制的组合，大幅提高峰容量，实现深度覆盖分析而单分子检测技术的发展有望将检测限推向极限，实现单细胞甚至亚细胞水平的分子谱图绘制智能自动化是未来生物色谱的重要发展方向人工智能辅助的自适应色谱系统可根据初始分离结果，自动优化后续分析条件，实现闭环方法开发大数据和机器学习算法将提升从复杂数据中提取有用信息的能力，特别是在多组学集成分析中发挥关键作用总结与答疑核心技术价值技能培养要点学科交叉前景生物色谱技术作为现代生命科学和医药产业的核心掌握生物色谱技术需要理论与实践并重扎实理解生物色谱技术与多学科深度融合，未来发展潜力巨支撑技术，其重要性体现在多个方面基础研究中分离原理是方法开发的基础；熟悉样品制备技术对大与微流控技术结合，实现精准单细胞分析；与提供分子级分离能力，药物开发中保证安全有效，确保可靠结果至关重要；仪器操作和维护能力是日人工智能结合，提升数据挖掘能力；与基因编辑技临床诊断中提供准确生物标志物分析，生物制药中常工作的保障；数据分析和解读能力则决定了研究术结合，助力精准医疗；与合成生物学结合，支持确保产品纯度和批次一致性价值的实现新型生物材料和药物开发本课程全面介绍了生物色谱技术的基本原理、主要类型、关键应用和前沿发展从色谱法的基础概念，到蛋白质、核酸、代谢物等各类生物大分子的分离策略，再到现代生物分析中的高级应用，系统梳理了这一重要技术领域的知识体系希望同学们通过学习，不仅掌握了理论知识，更培养了实验设计和问题解决能力在未来的研究和工作中，能够灵活运用色谱技术解决各种生物分离和分析问题，为生命科学研究和生物医药发展贡献力量。