《蛋白质与核酸》课件

蛋白质与核酸课程内容目录1蛋白质基础知识氨基酸结构、多肽形成、蛋白质层次结构2核酸基础知识核苷酸组成、与结构特征DNA RNA3结构与功能关系分子构象决定生物学功能的原理化学性质与检测蛋白质与核酸的地位生命活动核心所有生理过程的分子基础1遗传信息系统2储存、传递、表达遗传密码细胞基本组分3构成细胞结构和功能的主要大分子蛋白质基础概念组成单元多样性来源蛋白质由氨基酸单体通过肽键连接形成的高分子化合物自然蛋白质的巨大多样性源于氨基酸序列的变化即使是相同的氨界中存在种常见的氨基酸，它们是构建蛋白质的基本砌基酸组成，不同的排列顺序也会产生完全不同功能的蛋白质分20α-块子氨基酸的结构通式结构非极性氨基酸12氨基酸具有氨基、羧基和侧链基疏水性侧链，如丙氨酸、缬氨酸α-R带电氨基酸极性氨基酸正负电荷侧链，如赖氨酸、天冬氨酸亲水性侧链，如丝氨酸、苏氨酸43氨基酸的等电点与两性酸性条件氨基质子化，带正电荷等电点pI净电荷为零的值pH碱性条件羧基去质子化，带负电荷氨基酸的化学反应脱羧反应茚三酮反应氨基酸在特定条件下失去羧氨基酸与水合茚三酮反应产生基，生成相应的胺类化合物蓝紫色物质，这是检测和定量这个反应在生物体内由脱羧酶氨基酸的经典方法反应的颜催化进行，是某些神经递质合色深浅与氨基酸浓度成正比成的重要步骤反应FDNB二硝基氟苯与氨基酸的氨基反应，用于鉴定多肽链的端氨2,4-α-N-基酸这是蛋白质序列分析的重要工具之一多肽的形成1脱水缩合两个氨基酸分子脱去一分子水，形成肽键连接2肽键特征部分双键性质，限制自由旋转，具有平面结构3肽链方向从端（氨基端）到端（羧基端）的方向性N-C-4肽链延伸通过连续的肽键形成二肽、三肽直至长肽链蛋白质的结构层次一级结构1氨基酸的线性排列序列二级结构2螺旋和折叠等规则构象α-β-三级结构3整个肽链的三维空间构象四级结构4多个亚基组装的复合体结构蛋白质的空间构象氢键稳定肽链主链和侧链间形成的氢键网络维持蛋白质二级和三级结构的稳定性这些弱相互作用力虽然单个强度不大，但数量众多时提供显著稳定作用二硫键交联半胱氨酸残基间形成的共价二硫键提供强力的结构稳定这种交联在细胞外蛋白质中尤为重要，帮助维持恶劣环境下的结构完整性疏水相互作用非极性氨基酸侧链聚集在蛋白质内部，避免与水分子接触这种疏水效应是驱动蛋白质折叠的主要推动力之一蛋白质的命名与分类按组成分类按形状分类单纯蛋白质仅由氨基酸组成，如白蛋白、球蛋白结合蛋白质球状蛋白质结构紧密，多具有催化或调节功能纤维状蛋白质含有非蛋白质辅助基团，如血红蛋白含有血红素，糖蛋白含有结构延展，主要发挥结构支撑作用，如胶原蛋白和角蛋白糖基蛋白质的理化性质溶解性特征蛋白质的溶解度受、离子强度和温度影响在等电点附近溶解度pH最小，容易发生沉淀析出这一性质被广泛应用于蛋白质的分离纯化过程中紫外吸收性质蛋白质在处有特征吸收峰，主要来自酪氨酸和色氨酸残280nm基的芳香环结构这一性质为蛋白质的定量检测提供了简便方法变性与复性蛋白质在外界因素作用下可发生变性，失去天然构象和生物活性在适当条件下，某些蛋白质可以重新折叠恢复活性，这一过程称为复性蛋白质的化学性质肽键稳定性酶促水解1肽键在常温常压下化学性质稳定蛋白酶特异性切断特定肽键2侧链反应酸碱水解4氨基酸侧链参与特殊化学修饰3强酸强碱条件下非特异性断裂蛋白质的生理功能催化功能酶蛋白催化生化反应，降低活化能，提高反应速率和选择性运输功能载体蛋白负责物质跨膜转运，如血红蛋白运输氧气防御功能抗体蛋白识别并中和外来抗原，维护机体免疫防御调节功能激素蛋白传递生理信号，调节细胞代谢和生长发育典型蛋白质实例血红蛋白含有四个亚基的复合蛋白，每个亚基结合一个血红素辅基通过血红素中铁离子的可逆氧合作用，实现氧气从肺部到组织的高效运输其协同效应使氧气结合曲线呈型S聚合酶DNA催化复制的关键酶类，具有到聚合酶活性和到外切酶活性能够准确识别模板链，按照碱基配对原则合成新的链，保证遗传信息的忠实传递DNA5335DNA胰岛素由胰岛细胞分泌的多肽激素，含有链和链通过二硫键连接调节葡萄糖代谢，降低血糖浓度，促进葡萄糖向肌肉和脂肪组织的摄取和储存βA B蛋白质的实验检测反应Biuret蛋白质与⁺在碱性条件下形成紫色络合物，颜色深浅与蛋Cu²白质浓度成正比茚三酮反应氨基酸和多肽与茚三酮反应产生蓝紫色物质，用于氨基酸的定性定量检测电泳SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子量的蛋白质，是蛋白质分析的标准方法蛋白质的提纯技术盐析法利用不同蛋白质在粗分离，成本低高盐浓度下溶解度差异进行分离离子交换层析基于蛋白质表面电分辨率高，适用范荷差异的分离技术围广凝胶过滤层析按分子大小分离，温和条件，保持活大分子先洗脱性亲和层析利用蛋白质与特异特异性强，纯化倍性配体的结合进行数高纯化蛋白质结构分析方法

1.5Å

2.0Å射线晶体学核磁共振X分辨率可达原子水平，是蛋白质结可分析溶液中蛋白质动态结构和构构解析的金标准象变化

3.0Å冷冻电镜近年来快速发展，适用于大分子复合物结构研究蛋白质分子的变性与复性变性因素变性特征高温破坏氢键和疏水相互作用，极端值改变电荷分布，有变性蛋白质失去生物活性，溶解度改变，粘度增加，易被蛋白pH机溶剂破坏疏水环境，重金属离子与巯基结合这些因素都能酶水解可逆变性在去除变性因子后可恢复，不可逆变性则永导致蛋白质失去天然构象久失活温度升高•生物活性丧失

1.值变化•物理性质改变

2.pH有机溶剂•对酶解敏感性增加

3.重金属离子•构象彻底改变

4.蛋白质的生物合成简介1转录阶段模板转录生成，携带蛋白质编码信息DNA mRNA2翻译起始核糖体识别起始密码子，开始蛋白质合成mRNA3肽链延伸携带氨基酸按密码子顺序加入肽链tRNA4翻译终止遇到终止密码子，释放完整的蛋白质产物蛋白质的降解与更新泛素标记蛋白酶体识别异常蛋白被泛素分子标记蛋白酶体识别泛素化蛋白26S氨基酸回收蛋白质降解小肽进一步分解，氨基酸重新利用蛋白酶体将蛋白质水解为小肽小结蛋白质在生命中的作用生命活动执行者承担细胞内外所有生理功能结构与功能统一独特的三维结构决定特异性功能生物体重要组成细胞干重的以上由蛋白质构成50%核酸的基本概念遗传信息载体分类与分布核酸是储存、传递和表达遗传信息的生物大分子作为核酸主要分为脱氧核糖核酸（）和核糖核酸（）两DNA DNA RNA遗传物质储存在细胞核中，参与基因表达过程它们共同大类主要存在于细胞核、线粒体和叶绿体中，广RNA DNA RNA构成了生命遗传信息系统的基础泛分布于细胞质和细胞核中核酸的结构单元五碳糖含脱氧核糖，含核糖DNA RNA含氮碱基嘌呤类（、）和嘧啶类（、、）A GT CU磷酸基团连接糖分子形成糖磷酸骨架-五大碱基及配对规律腺嘌呤（）鸟嘌呤（）胸腺嘧啶（）尿嘧啶（）A GT U与胸腺嘧啶配对，形成个与胞嘧啶配对，形成个氢特有，在中由尿特有，与腺嘌呤配对23DNA RNA RNA氢键键嘧啶替代的结构特征DNA双螺旋结构反向平行大小沟槽模型描述的右手双螺两条链方向相反，一条为双螺旋表面形成大沟和小沟，为蛋白Watson-Crick DNA5→3旋结构，螺距，每圈含个方向，另一条为方向这种反质识别特定序列提供结合位点

3.4nm103→5DNA碱基对两条链通过氢键维持稳定，向平行排列是复制和转录的结构转录因子主要通过大沟识别特定基因DNA形成规则的型构象基础序列B DNA的高级结构DNA超螺旋结构双螺旋进一步盘绕形成超螺旋，有正超螺旋和负超螺旋之分DNA负超螺旋有利于解开，便于复制和转录过程的进行DNA核小体结构真核细胞中与组蛋白结合形成核小体，是染色质的基本单DNA位每个核小体由约缠绕组蛋白八聚体圈形147bp DNA

1.65成染色体结构核小体进一步压缩折叠形成纤维，最终高度压缩成染色30nm体这种分级压缩使长达米的能够容纳在微米级的细胞2DNA核中的结构特征RNA单链结构通常以单链形式存在，但可形成局部双链结构RNA信使RNA携带蛋白质编码信息，从核到胞质指导翻译mRNA转运RNA具有三叶草二级结构，转运特定氨基酸tRNA核糖体RNA是核糖体主要组分，具有催化肽键形成功能rRNA核酸的理化性质紫外吸收水解敏感性酸碱稳定性核酸在处有最比更易水在中性和弱碱性260nm RNADNA DNA大吸收峰，主要来自嘌解，因为核糖条件下稳定，强酸强碱2-OH呤和嘧啶碱基的共轭基团的存在使磷酸二酯会导致碱基脱落和糖π-电子系统这一特性被键不稳定碱性条件下磷酸骨架断裂温度升广泛用于核酸的定量分快速降解，而高会促进双链解链，形RNA析，比相对稳定，这是成单链结构A260/A280DNA DNA值可评估核酸纯度两者化学性质的重要差异核酸的化学反应内切核酸酶外切核酸酶1切断核酸内部磷酸二酯键从末端逐步移除核苷酸2修饰酶类限制性内切酶4甲基化酶、磷酸化酶等修饰3识别特定序列进行切割核酸的生理功能的功能的功能DNA RNA作为遗传物质，负责储存生物体的全部遗传信息通过在基因表达中发挥多种关键作用作为信息载DNA RNAmRNA精确的复制机制，确保遗传信息在细胞分裂过程中的忠实传体，作为氨基酸转运工具，具有肽基转移酶活tRNA rRNA递同时作为转录模板，指导的合成性某些还具有调节基因表达的功能RNA RNA•遗传信息储存•信息传递载体•复制传递遗传密码•蛋白质合成工具•转录模板功能•基因表达调节核酸的生物合成双链解开DNA解螺旋酶打开双链，形成复制叉结构半保留复制每条新链以原链为模板合成，保留一条原链连续与间断合成领先链连续合成，滞后链形成冈崎片段校对与修复聚合酶具有外切酶活性，纠正错误DNA3-5遗传信息的表达蛋白质基因表达的最终产物翻译过程指导蛋白质合成mRNA转录过程转录生成DNARNA遗传信息储存在序列中DNA突变与修复DNA突变识别细胞监测系统发现损伤DNA损伤切除核酸酶切除错误或损伤的碱基正确合成聚合酶填补空缺，恢复正确序列DNA连接修复连接酶密封切口，完成修复DNA真核生物核酸的调控甲基化组蛋白修饰DNA胞嘧啶的甲基化修饰通常导致基因沉默，是表观遗传调控组蛋白的乙酰化、甲基化等修饰改变染色质结构，影响基的重要机制因可及性非编码调控染色质重构RNA微小、长非编码等通过多种机制调节基因表达依赖的染色质重构复合体改变核小体位置，调节基因RNARNAATP水平转录常见分子生物学技术30循环数PCR标准反应通常进行个循环PCR25-35°94C变性温度高温变性阶段使双链分离DNA°72C延伸温度酶最适工作温度进行链延伸Taq⁶10扩增倍数理论上每轮循环使目标序列倍增核酸的分离与检测细胞裂解使用裂解缓冲液破坏细胞膜和核膜，释放核酸分子添加蛋白酶去除K蛋白质，去除污染，确保的纯度和完整性RNase RNADNA有机溶剂抽提酚氯仿抽提法去除蛋白质污染，留在水相中这是经典的核酸-DNA纯化方法，能够有效去除蛋白质和其他有机污染物凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳根据分子大小分离核酸片段在电场中向正DNA极迁移，小分子迁移速度快，大分子迁移缓慢，实现有效分离测序技术发展DNA1第一代测序链终止法，使用终止链延伸，准确率高达Sanger ddNTP

99.9%2第二代测序高通量并行测序，成本大幅降低，通量显著提高3第三代测序单分子实时测序，读长更长，可检测表观遗传修饰4未来发展纳米孔测序等新技术，实现便携式实时测序分子的研究方法RNA实时定量干扰技术PCR RNA技术通过荧光信号实时监利用小干扰qPCR RNAiRNA测扩增过程，可精确定量（）或微小PCR siRNARNA表达水平（）特异性沉默目标基RNA SYBRGreen miRNA染料或探针提供荧光信因表达这一技术广泛应用于基TaqMan号，值与初始模板量呈对数关因功能研究和疾病治疗开发Ct系测序分析RNA技术能够全转录组水平分析基因表达，发现新的转录本和剪接RNA-seq变体相比传统芯片技术，具有更高的分辨率和动态范围蛋白质与核酸的相互作用转录因子结合核糖体翻译作用转录因子通过特异性结合域识别启动子区域的特定序核糖体是蛋白质复合体，其中具有肽基转移酶活DNARNA-rRNA列，调控基因转录这种蛋白质相互作用是基因表达调性，催化肽键形成核糖体蛋白协助维持结构稳定性，确保翻-DNA控的基础，涉及氢键、静电相互作用和疏水相互作用译过程的准确性和效率酶与核酸酶外切核酸酶连接酶DNA从或端逐步移除核苷酸单连接片段，修复单链缺35DNA位口限制性内切酶聚合酶DNA识别特异性序列，产催化合成，具有外4-8bp DNA3-5生平末端或粘性末端切酶活性蛋白质工程与核酸工程定点突变技术通过技术在特定位点引入突变，改变蛋白质功能PCR核酸适配体设计筛选特异性结合目标分子的短核酸序列体外进化技术模拟自然选择过程，获得具有性质的分子desired合成生物学应用设计和构建新的生物系统，实现特定功能实验案例分析血清蛋白分析1样品预处理1采集血清样品，稀释至适当浓度，去除杂质和干扰物质2蛋白质定量使用法或法测定总蛋白浓度，确保加样量一致Bradford BCA电泳分离3分离不同分子量蛋白质，观察条带分布模式SDS-PAGE4结果解读分析白蛋白与球蛋白比例，识别异常蛋白质条带实验案例分析检测基因2PCR产物检测扩增PCR琼脂糖凝胶电泳检测产物，与分PCR DNA引物设计优化反应条件包括退火温度、循环数和酶子量标准对比确定产物大小目标条带的根据目标基因序列设计特异性引物，确保浓度标准三步法包括°变性、出现表明基因存在，条带亮度反映扩增效PCR94C扩增特异性和效率引物长度通常为°退火和°延伸，通常进行率18-55-65C72C个核苷酸，含量在之间，个循环25GC40-60%30-35避免二级结构形成蛋白质与核酸重大疾病相关性镰刀型贫血症肿瘤基因突变遗传性疾病诊断由于血红蛋白基因第位密码子肿瘤抑制基因突变在以上肿瘤现代基因检测技术能够早期发现遗传性疾β-6GAG p5350%突变为，导致谷氨酸被缬氨酸替代中发现蛋白正常情况下监控病的分子标志通过分析特定基因突变，GTG p53DNA这一单个氨基酸改变使血红蛋白聚合，红损伤，诱导细胞凋亡或修复突变导致细可以预测疾病风险，指导个性化治疗和遗细胞变形，引起血管阻塞和组织缺氧胞失控增殖，形成恶性肿瘤传咨询医药领域中的蛋白质与核酸单克隆抗体药物利用杂交瘤技术生产特异性抗体，用于癌症免疫治疗、自身免疫病治疗等疫苗技术mRNA新冠疫苗成功应用展示了疫苗的巨大潜力，快速响应新发传mRNA染病基因治疗药物通过载体将功能基因导入患者细胞，治疗遗传性疾病和某些获得性疾病精准医学应用基于个体基因组信息制定个性化治疗方案，提高治疗效果作业与思考题多肽序列设计突变影响分析实验设计题设计一个包含个氨基酸的多肽序分析序列中单个碱基突变对编码设计一个实验方案来检测某个基因在10DNA列，要求包含至少种不同类型的氨基蛋白质的影响讨论沉默突变、错义不同组织中的表达水平，包括提3RNA酸（非极性、极性、带电），并解释突变和无义突变的生物学意义，以及取、逆转录、定量等步骤，并预PCR序列选择的依据和可能的生物学功可能的表型后果测可能遇到的问题能蛋白质与核酸研究的前沿蛋白质组学系统性分析细胞或组织中所有蛋白质的表达、修饰和相互作用，揭示蛋白质网络的复杂调控机制质谱技术的发展使得大规模蛋白质鉴定和定量成为可能单细胞测序在单个细胞水平分析基因表达谱，揭示细胞异质性和发育轨迹这一技术革命性地改变了我们对组织结构和疾病机制的理解基因编辑CRISPR精确的基因编辑工具，可以在基因组特定位点进行定点突变、插入或删除系统在基础研究和临床治疗中展现出巨大潜力CRISPR/Cas9复习与知识梳理核心概念掌握深入理解蛋白质与核酸的基本概念和原理1结构功能关系2建立分子结构与生物学功能之间的联系实验技能应用3熟练掌握常用的分析检测方法和技术基础知识巩固4牢固掌握氨基酸、核苷酸等基本单元的性质结语与展望研究前景展望对生命科学的影响蛋白质与核酸研究将继续推动生命科学发展人工智能辅助的这些研究成果将直接转化为医学应用，为疾病诊断、治疗和预蛋白质结构预测、合成生物学、基因治疗等领域将带来革命性防提供新的策略同时，在农业、环境保护、生物能源等领域突破新技术的发展将使我们更深入地理解生命本质也将产生深远影响，推动可持续发展。