植物总RNA的提取及RT-PCR

植物总的提取及RNA RT-PCR生物学实验技术植物总的提取及RNA RT-PCR

一、实验目的学习从植物组织中提取总的方法1,RNA了解的基本原理和实验方法2,RT-PCR

二、实验原理提取的原理

1.RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的必须最大限RNA RNA,度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对的降解RNA高浓度强变性剂异硫氧酸月瓜可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活酶，所以从细胞中释放出来时RNA RNA不被降解细胞裂解后，除了还有、蛋白质和细胞碎RNA,DNA片,通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNAo的原理

2.RT-PCR提取组织或细胞中的总以其中的作为模板，采用RNA,mRNA作引物利用逆转录酶反转录成再以为模板OligodT cDNAcDNA进行扩增，获得目的基因或检测基因表达使PCR RT-PCR RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量样品分析RNA成为可能该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成探针等cDNA

三、仪器、药品与试剂配方一仪器及器皿低温离心机；琼脂糖凝胶电泳系统；高压灭菌锅；

1.

2.

3.仪；研钵；.一次性手套等；

4.PCR

5.6离心管；.培养皿；烧杯及试剂瓶等

7.

89.二药品焦碳酸二乙酯异硫鼠酸月瓜醋酸钠

1.DEPC

2.GT

3.NaAc苯酚异丙醇氯仿4,

5.6,乙醇筑基乙醇琼脂糖7,

8.0—9,反转录试剂盒聚合酶引物

10.MLV ll.TaqDNA12,三试剂配制水灭菌

1.

0.1%DEPC异硫氟酸月瓜

2.4mol/L灭菌

3.2mol/L NaAcpH

4.8灭菌

4.3mol/L NaAcpH

4.8灭菌

5.4mol/L LiCI缓冲液

6.lxTE10mM Tris-HCI pH

8.0,1mM EDTA灭菌pH

8.0,

四、实验步骤一总的提取RNA研钵冷却后，倒入液氮，加入植物材料，充分12/

30.2g研磨后转入一个含有300的的的聚丙烯管中，摇匀I4MGT L5ml加入摇匀,加入酸酚水23012M NaAcpH

4.9-

5.2300I饱和酚pH

5.0,生物学实验技术摇匀，加入三氯甲烷，摇匀1001年离心吸取上清，加入等体积3120XX rpm4C20min,异丙醇，于冰上放置15min年离心将沉淀悬浮于含4120XX rpm4c10min,100I4M氯化锂的管

1.5ml EP中，于放置小时或更长时间-20C1年离心将沉淀溶于5120XX rpm4C10-15min,

0.4水中,加入体积mIDEPC1/2氯仿和体积酸酚，摇匀，进行抽提，年离1/2120XX rpm4C°心；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，年5min120XX rpm4c离心5min上清液加入体积的乙酸钠和两倍体积的无61/103M水乙醇于放置小时或更长时间-20C1年离心超净台吹干，沉淀溶于7120XX rpm4C15min,灭菌的口£「水中101133贮于8RNA-80C二反转录产生RNA cDNA在处理过的离心管中冰上按下表加入DEPC模板RNAOligdT18水DEPC2I1I2I混匀，水浴中放置立即放置到冰上然后70C2min,2min在冰上依次加入RNasinM-MLV5x buffer10mM dNTP

0.5I1I2I

1.5I水浴中反应终止反应42C°,90min72C°,10min,加入的灭菌水，使总体积达到15I DEPC251三PCR.在灭菌的管中加入以下成分，形成反应体系1PCR PCR10X buffer2,5I dNTP

2.5mmol2I产物RT-PCR5I酶Taq

0.5I上游引物10mol/l

0.5I下游引物10mol/l

0.5I灭菌力口至ddH20U25I.按照下列条件进行反应2PCR94C°5min94C°30s55C°30s72C°1min个循环3072C°7min4C°四电泳检测将加的%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加电EB1lxTE泳缓冲液，覆盖凝胶约将及样品加到凝胶点样1mm RNADNA孔中，条件下电泳在紫85V30min,生物学实验技术外灯下观察结果

五、注意事项在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态

1.酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源

2.RNA酶外，外界环境中均存在酶，所以操作时应戴手套RNA RNA.使用时，应在通风橱中戴手套操作3DEPC提取用品准备

4.RNA）普通的玻璃器皿烘干小时（玻璃），研钵，小勺，1180C8试剂瓶若干个）一次性使用的塑料制品枪头、管等先用水处理2EP DEPC然后高压灭菌，烘干）电泳槽去污剂洗干净，水冲洗，彻33%H2O,

0.1%DEPCzk底冲洗）用烘烤过的药勺称取试剂4）用水配制试剂水至少处理5DEPC

0.1%DEPC37C12小时,高压灭菌15min）含有一类的缓冲液，不可用处理6Tris DEPC。