脑卒中动物模型培训课件

脑卒中动物模型培训课件欢迎参加脑卒中动物模型培训课程！本课程旨在为神经科学研究者和医学实验人员提供全面的脑卒中动物模型建立技术与评估方法我们的培训对象主要包括神经科学研究人员、药物研发人员以及医学院校学生通过系统学习，您将掌握各类脑卒中模型的建立方法、评估标准及应用场景，为脑卒中机制研究和药物开发奠定坚实基础本课程注重理论与实践相结合，通过大量实验案例和操作演示，确保学员能够独立完成模型构建并进行科学评估脑卒中研究概述万万万15006005000全球年发病人数年死亡人数幸存者总数全球每年约有万人发脑卒中导致全球每年约全球约有万脑卒中幸15005000生脑卒中，相当于每秒就万人死亡，是全球第存者，其中大部分面临不2600有人罹患此病二大死亡原因同程度的残疾1脑卒中已成为全球主要致残和致死原因之一，其高发病率、高死亡率和高致残率对全球公共卫生构成严重挑战中国是世界上脑卒中负担最重的国家之一，发病率远高于欧美发达国家临床脑卒中简介缺血性脑卒中由血栓或栓子阻塞脑动脉，导致脑组织缺血、缺氧而引起的神经功能损伤占所有脑卒中病例的约85%出血性脑卒中脑内血管破裂导致血液渗入脑组织或蛛网膜下腔，引起脑损伤占所有脑卒中病例的约15%1常见诱因2典型症状高血压、动脉粥样硬化、心房颤动单侧肢体无力或麻木••糖尿病、高脂血症、吸烟语言障碍、吞咽困难••酗酒、肥胖、缺乏运动视力障碍、头痛、意识障碍••动物模型在脑卒中研究中的作用基础机制研究药物筛选探索脑卒中发生发展的病理生理机制，了解脑为新型脑卒中治疗药物提供临床前评价平台，组织损伤与修复过程是药物从实验室到临床的必经环节临床转化支持神经保护研究桥接基础研究与临床应用，促进新技术和新疗评估各类神经保护策略的有效性，为临床治疗法的转化方案优化提供依据动物模型是脑卒中研究中不可或缺的工具，它们能够模拟人类疾病过程，允许研究者在控制条件下研究疾病机制、测试治疗方法，并预测临床结果脑卒中动物模型分类按病理类型分类按时程分类按建模方式分类缺血性脑卒中模型模拟脑血管阻塞导致急性模型模拟突发性脑卒中，观察早期机械性阻断模型线栓法、开颅法等•••的缺血损伤病理变化化学诱导模型光化学法、三氯化铁法等•出血性脑卒中模型模拟脑内出血或蛛网慢性模型研究长期神经功能恢复与重构••基因修饰模型基因敲除或过表达导致的•膜下腔出血过程自发性脑卒中选择合适的模型类型是实验成功的关键因素，需根据研究目的、技术条件和评价指标综合考量模型动物种类选择大鼠小鼠兔猪最常用的脑卒中研究基因背景清晰，可进血管结构与人类相近，脑结构与人类高度相动物脑血管解剖结行基因编辑，成本低，适合栓塞和血管内手似，白质比例接近人构相对稳定，体型适适合大样本实验但术研究但成本较高，类，适合转化研究中便于操作，神经行脑体积小，手术难度行为学评估方法有限但成本高，饲养和实为学评估方法成熟较大验空间要求大选择合适的实验动物应考虑研究目的、技术条件、成本效益以及与人类疾病的相关性等多方面因素对于药物筛选，应考虑动物的代谢特性与人类的差异缺血性脑卒中模型概览全脑缺血模型通过心脏骤停或颈总动脉阻断，模拟全脑血流中断适用于心脏骤停后脑损伤研究局灶性缺血模型阻断特定脑区的血液供应，是最常用的脑卒中模型类型包括线栓法、开颅法、光化学法、三氯化铁法、自体血栓法等遗传修饰模型通过基因编辑技术创建自发性脑卒中动物，如过表达血管紧张素基因的高血压自发性脑卒中模型栓子栓塞模型注射微球或血栓碎片到颈动脉，模拟多发性微栓塞适合研究小血管病变与认知功能障碍国际主流研究多采用线栓法作为标准模型，其次为开颅法近年来，光化学法因其微创性和可控性受到越来越多关注不同模型之间存在互补性，应根据MCAO研究目的选择最合适的模型线栓法（）基础原理MCAO基本原理模型特点线栓法通过插入尼龙线创伤小不需开颅，减少外科创伤干扰Middle CerebralArtery Occlusion,MCAO•栓到颈内动脉，使其前进至大脑中动脉起始部位，从而阻断血流，导致可控性强可精确控制阻断时间，研究不同缺血时长的影响•该血管供应区域缺血再灌注可模拟临床再灌注治疗•线栓表面通常涂有硅胶，使其直径与血管内径匹配，提高阻断效果阻标准化国际广泛采用，结果可比性强•断一定时间后撤出线栓，可实现血流再灌注，模拟临床溶栓或机械取栓适应性广适用于多种研究目的和动物种类•后的再灌注过程线栓法是目前最广泛使用的脑缺血模型，具有良好的可重复性和稳定性，被认为是脑卒中研究的金标准模型线栓法操作步骤详解

（一）1材料准备实验动物成年雄性大鼠•SD250-300g线栓尼龙单丝，直径，尖端涂硅胶•

0.28-

0.32mm手术器械显微镊、眼科剪、血管夹等•监测设备激光多普勒血流仪、体温计•2动物麻醉腹腔注射水合氯醛或异氟烷吸入麻醉•10%350mg/kg确认麻醉深度无痛反射，呼吸平稳•置于手术台上，仰卧位固定•3生理参数监测体温维持在±℃，使用恒温垫•

370.5血压通过尾动脉或股动脉监测可选•血气分析维持在生理范围可选•4脑血流监测准备剃除头部毛发，暴露颅骨•在大脑中动脉供血区钻小孔•放置激光多普勒探头，记录基线血流值•准备工作的质量直接影响实验结果的可靠性特别是体温控制至关重要，体温过低会显著影响梗死体积，造成实验误差线栓法操作步骤详解

（二）颈部切口与血管分离1颈部正中切口约•2cm分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉•2线栓插入结扎颈外动脉远端和颈总动脉•颈外动脉近端剪小口•通过切口将线栓插入颈外动脉•缺血确认3沿颈内动脉前进大鼠•18-20mm•激光多普勒监测血流下降70%•感受轻微阻力时停止，固定线栓观察对侧前肢活动减弱•4再灌注如需要阻断维持预定时间通常分钟•60-120缓慢拔出线栓约•10mm观察血流恢复基线值•50%缝合伤口，术后护理•线栓插入深度是影响模型成功率的关键因素插入过浅无法阻断中动脉，过深则可能损伤血管或穿入蛛网膜下腔对于不同体重的动物，应适当调整插入深度线栓法模型优缺点优点缺点创伤较小不需开颅，减少外科创伤影响学习曲线长技术要求高，需要充分训练••可控性强可精确控制缺血时间长短个体差异解剖变异可导致模型不稳定••再灌注能力可模拟临床再灌注治疗线栓规格要求严格不同批次可能存在差异••标准化程度高国际广泛采用，结果可比性强与临床差异梗死发展速度快于人类••技术成熟大量文献支持，操作规范不适合溶栓研究阻塞为机械性而非血栓性••适用范围广适合多种研究目的假阳性风险手术本身可能导致炎症反应••线栓法模型尽管存在一些局限性，但由于其可重复性好、创伤小等优势，仍是目前最常用的脑卒中模型在应用时应充分考虑其特点，选择合适的研究问题和评价指标开颅法基础原理基本原理阻断方式阻断位置开颅法是通过开颅手术直接暴露大脑中动脉动脉夹法使用微血管夹暂时夹闭血管可选择主干近端或分支远端进行阻•MCA，然后采用物理方法阻断血流，包括断近端阻断导致较大梗死区，远端阻断则MCA电凝法电凝永久阻断血流•MCA动脉夹夹闭、电凝、热损伤等方式该方法梗死范围较小，更适合局灶性研究热损伤法通过加热探针封闭血管•可在直视下精确操作，梗死范围可控结扎法用缝线直接结扎血管•开颅法提供了直观的血管可视化操作环境，使研究者能够精确控制阻断的血管及位置，但创伤性较大，可能引入额外的炎症反应和脑水肿电凝法通常用于永久性阻断模型，而动脉夹法则适合可复灌研究开颅法详细流程1麻醉与固定腹腔注射麻醉剂或吸入麻醉•侧卧位固定，剃除头部毛发•局部消毒，铺无菌巾•2头皮切开与颅骨暴露在眼角与耳间做弧形切口•分离头皮，暴露颞部颅骨•确定颞窝位置（眼眶与外耳道之间）•3开颅与血管暴露使用牙科钻在颞骨钻直径小孔•2-3mm扩大骨窗至约ו44mm切开硬脑膜，暴露大脑表面•在显微镜下找到主干或分支•MCA4血管阻断操作动脉夹法放置微血管夹，预定时间后取出•电凝法使用电凝器低功率凝固血管•结扎法用尼龙线结扎血管•10-0封闭伤口，缝合或使用组织胶•开颅手术操作要求精细，需在显微镜下进行暴露时应避免损伤脑组织和小血管电凝时功率不宜过高，以免损伤周围MCA组织结扎和动脉夹操作需防止血管断裂或出血开颅法优缺点优点缺点直视操作可精确观察和控制血管阻断位置创伤大开颅手术本身带来额外创伤••梗死体积稳定个体差异小，重复性好技术要求高需要显微外科技能••可选择性可针对不同分支进行操作设备需求需要显微镜等专业设备•MCA•适合永久性阻断电凝法提供可靠的永久阻断炎症干扰手术可能引起炎症反应••梗死范围可控根据阻断位置调整梗死大小脑干扰脑脊液流失、脑水肿风险••适合长期观察模型稳定性好复灌不易电凝后无法实现自然复灌••开颅法最大的优势在于可直接观察操作区域，确保血管阻断的准确性，但开颅本身带来的创伤是其主要局限在选择此方法时，应考虑额外创伤可能对实验结果的影响，并采取措施减少干扰光化学法原理与应用基本原理技术特点光化学法利用光敏感染料如玫瑰红静脉注射后，选择性地激活特定脑区高度空间定位可精确选择脑区•血管内的染料激活的染料产生自由基，损伤血管内皮细胞，导致血小微创性好无需开颅或血管插管•板聚集和血栓形成梗死体积可调通过调整照射参数•通过调整激光照射的位置、强度和时间，可以精确控制血栓形成的位置适合皮层梗死表层血管易于照射•和程度，实现高度局灶性的缺血性损伤重复性好参数标准化后个体差异小•血栓形成机制与人类血栓形成相似•血栓形成与缺血激光照射目标区域血管内皮损伤引发血小板聚集和血栓形成，注射光敏染料使用特定波长激光照射目标脑区，激活染料导致局部脑缺血静脉注射玫瑰红等光敏染料，等待其均匀分产生活性氧自由基布于血液循环中光化学法详细流程1设备与材料准备激光源波长绿光激光•535nm光敏染料玫瑰红•10-20mg/kg光纤传导系统•多普勒血流监测仪•2动物准备麻醉异氟烷或戊巴比妥•固定俯卧位或侧卧位•头部处理剃毛，局部消毒•颅骨暴露小切口暴露照射区颅骨•3光敏染料注射与激光照射尾静脉或股静脉注射玫瑰红•等待分钟使染料均匀分布•5将激光光纤定位至目标脑区上方•调整光斑直径至•1-3mm激光功率设置为•

0.5-

1.5W/cm²持续照射分钟•10-204缺血监测与确认激光多普勒监测血流变化•血流下降至基线的以下视为成功•30%照射结束后观察分钟•15-30缝合伤口，术后护理•光化学法的关键参数包括染料剂量、激光功率和照射时间，这些参数的调整直接影响梗死体积和严重程度实验前应进行参数优化，建立稳定的剂量效应关系-光化学法优缺点优点缺点微创性好不需要开颅或血管插管设备依赖需要特定波长激光••空间精准性高可精确选择目标脑区深部脑区局限穿透深度有限••操作简便技术要求相对较低染料非特异性可能影响全身其他器官••重复性好标准化后个体差异小梗死发展过程与自然血栓形成有差异••血栓形成机制与人类相似复灌困难形成的血栓不易溶解••适合皮层研究表层缺血模型理想模型可逆性差不适合再灌注研究••梗死体积可调通过参数控制个体差异光敏染料敏感性可能不同••光化学法特别适合需要高度局灶性脑缺血的研究，如特定皮层功能区的损伤研究但由于其作用机制与临床脑卒中有一定差异，在药物筛选和转化研究中应谨慎解释结果三氯化铁法机制化学作用原理血栓形成过程三氯化铁₃是一种强氧化剂，外用于血FeCl₃接触血管后约分钟内开始形成血FeCl5-15管表面时，可穿透血管壁作用于内皮细胞栓，分钟内血管可完全闭塞形成的血栓30₃导致内皮细胞损伤，暴露基底膜，触FeCl主要由血小板和纤维蛋白组成，结构与临床动发血小板聚集和凝血级联反应，最终形成血栓脉血栓相似组织学表现应用特点₃诱导的血栓呈红棕色，易于肉眼识别三氯化铁法可应用于不同口径的脑血管，从大FeCl组织学上显示血管内血小板聚集、纤维蛋白沉脑中动脉主干到小分支，实现局灶性血栓形成积和红细胞聚集，血管壁出现内皮损伤和铁离浓度和作用时间可调整，控制血栓大小和闭塞子沉积程度三氯化铁法的主要优势在于操作简便、微创，且形成的血栓结构与临床相似这种方法特别适合研究抗血小板和抗凝药物的效果三氯化铁法操作流程材料准备1三氯化铁溶液浓度•10-50%滤纸或棉球ו22mm2动物准备与血管暴露显微外科器械••激光多普勒血流仪•麻醉并固定动物对于大脑中动脉需开颅暴露•三氯化铁应用3对于颈动脉颈部切口暴露颈动脉••将滤纸或棉球浸泡在FeCl₃溶液中•仔细分离目标血管，不损伤血管壁轻轻放置在目标血管表面•4血栓形成监测保持分钟浓度和时间可调整•3-5生理盐水冲洗残留₃激光多普勒监测血流变化•FeCl•观察血管颜色变化红棕色•血流下降视为成功•80%封闭伤口，术后护理•三氯化铁浓度和作用时间是影响血栓形成速度和程度的关键因素通常使用浓度，作用分钟可达到理想效果过高浓度或过长时间可能导致血管过度损伤，甚至血管破裂20-30%3-5三氯化铁法优缺点优点缺点操作简便技术要求较低化学损伤₃本身具有细胞毒性••FeCl微创性好创伤小，特别是应用于颈动脉时非生理性化学诱导机制与自然血栓形成不同••血栓形成机制与临床相似铁离子干扰可能影响后续生化分析••可控性通过调整浓度和时间控制血栓形成梗死体积变异浓度控制难度大••重复性好标准化后个体差异小血管破裂风险浓度过高可能导致血管破裂••适用范围广可应用于不同口径血管深部血管局限主要适用于表浅血管••成本低不需特殊设备应用历史短文献支持相对有限••三氯化铁法由于其简便性和可控性，近年来在脑卒中研究中应用越来越广泛它特别适合研究血小板和凝血系统在缺血性脑卒中中的作用，以及抗血小板药物的筛选但在解释结果时需考虑其非生理性特点自体血栓法建模机制缺血形成血栓注射血栓阻断脑血管后，下游脑组织血流减少，氧气血栓制备将制备好的血栓通过导管注入颈内动脉，血栓随和营养物质供应中断，逐渐形成缺血性损伤缺从动物自身抽取血液，与凝血促进剂如凝血酶血流进入脑循环，最终在脑血管分支处通常是血区域取决于阻塞血管的位置和大小混合，在体外培养形成血栓血栓经过特殊处理大脑中动脉形成栓塞，导致下游脑组织缺血后可切割成特定大小的小块，用于后续注射自体血栓法最大的特点是使用动物自身血液形成的真实血栓，其组成和结构与人类血栓高度相似，包含血小板聚集、纤维蛋白网络和红细胞这种生理性血栓使该模型特别适合研究血栓形成机制和溶栓治疗与线栓法不同，自体血栓法产生的栓塞位置可能存在一定随机性，这既是其局限也是其优势更接近临床脑卒中的自然发生过程——自体血栓法详细操作1血栓制备从动物股动脉静脉抽取血液•/

0.5-1ml与凝血酶混合•2-5U/ml℃水浴孵育小时•372-4形成的血块切成长小段•

0.5-1mm用洗涤多次，去除游离凝血酶•PBS2动物准备麻醉并固定动物•颈部切口暴露颈总动脉和颈内动脉•临时结扎颈总动脉近心端和颈内动脉•颈外动脉结扎并切断•3血栓注射颈外动脉残端插入导管至颈内动脉开口•将制备的血栓悬浮于生理盐水中•通过导管缓慢注入个血栓•1-3松开颈内动脉夹，使血栓随血流进入脑循环•撤出导管，结扎颈外动脉残端•4缺血评估激光多普勒监测脑血流变化•神经功能评分确认神经缺损•或染色确认梗死区•MRI TTC血栓大小和数量是影响模型成功率的关键因素血栓过小可能无法有效阻断血管，过大则可能阻塞主要动脉干通常使用直径略小于目标血管的血栓，以确保其能随血流到达目标位置自体血栓法优缺点优点缺点高临床相关性血栓组成和结构与人类相似技术要求高血栓制备需精确控制••适合溶栓研究可评估等溶栓药物效果成功率不稳定血栓位置难以精确控制•tPA•自然栓塞过程模拟心源性栓塞个体差异大血栓特性可能存在差异••血栓形态多样可调整血栓大小和组成自发溶解血栓可能自行溶解导致再灌注••组织学分析价值高可研究血栓与血管互作梗死范围变异取决于血栓最终位置••创伤较小不需开颅操作时间长血栓制备耗时••免疫相容性好使用自身血液评估复杂需多种方法确认栓塞位置••自体血栓法最适合研究栓子性脑卒中，特别是心源性脑栓塞以及溶栓治疗的机制和疗效尽管操作技术要求高，但其高度的临床相关性使其成为转化研究的理想模型在应用时需充分考虑其变异性，增加样本量并采用多种方法确认造模成功局部凝血法电流损伤法/基本原理技术特点电流损伤法利用低强度直流电通过微电极直接作用于血管壁，导致内皮高度局灶性损伤限于电极接触部位•细胞损伤、胶原暴露，激活血小板聚集和凝血级联反应，形成局部血栓可控性强通过调整电流强度和时间控制损伤程度•精确定位可在显微镜下精确选择损伤位置•与化学损伤法相比，电流损伤更加精准可控，可以针对特定血管部位进血栓形成快通常在分钟内形成稳定血栓•10-30行定点损伤，且不引入外源性化学物质无化学干扰不引入可能影响后续分析的化学物质•电流损伤电极定位施加低强度直流电通常，持血管暴露

0.1-

0.5mA在显微镜下将微电极尖端精确放置在目标血续分钟，导致局部内皮损伤和血栓形5-15开颅或其他方法暴露目标血管，通常选择大管壁上，避免直接穿刺血管成脑中动脉或其分支电流损伤法操作流程1设备准备恒流电源可调•0-1mA铂金或不锈钢微电极直径•

0.1-

0.3mm显微操作系统•激光多普勒血流仪•接地电极置于皮下•2动物准备与血管暴露麻醉并固定动物•颅骨钻孔或开窗•切开硬脑膜，暴露脑表面•在显微镜下识别目标血管•放置接地电极于附近皮下组织•3电极定位与电流损伤微电极尖端轻触血管壁外表面•确保良好接触但不穿刺血管•设定电流强度通常•

0.2-

0.3mA开启电源，持续通电分钟•10观察血管变化变窄、颜色改变•4血栓形成确认激光多普勒监测血流变化•血流下降视为成功•70%可通过显微摄影记录血栓形成过程•完成后关闭伤口，术后护理•电流损伤法的关键参数是电流强度和通电时间电流过小可能无法形成稳定血栓，过大则可能导致血管破裂通常从低强度开始，根据血流监测结果逐渐调整不同口径血管可能需要不同的电流参数电流损伤法优缺点优点缺点高度精准可实现亚毫米级精确定位技术复杂需要精细微操作技能••可控性强通过调整电流参数控制血栓形成设备要求需专业电流源和显微系统••无化学干扰不引入外源性化学物质开颅创伤通常需开颅暴露血管••血栓形成快通常分钟内完成深部血管局限主要适用于表浅血管•10-30•适合微血管研究可应用于细小血管个体差异血管对电流敏感性可能不同••可视化程度高整个过程可在显微镜下观察血管破裂风险参数不当可能导致破裂••重复性好参数标准化后变异小应用历史较短文献支持相对有限••电流损伤法特别适合需要高度精准定位的脑缺血研究，如特定功能区小梗死模型或微血管闭塞研究它与光化学法类似，都提供了精确控制缺血位置的能力，但不需要光敏染料，避免了全身性影响该方法在血管狭窄和微血栓形成机制研究中具有独特优势出血性脑卒中模型简介颅内注射法球囊压迫法高血压诱导法最常用的模型通过立体定位仪将自体血将微型球囊置入颅内，充气扩张导致血管破裂利用自发性高血压动物或药物诱导高血压，导ICH液或溶菌酶等物质注入特定脑区，直接诱导出出血可模拟血管破裂的动态过程，但技术要致脑血管自发破裂病理过程最接近临床，但血操作简便，出血位置和体积可控，但出血求高，创伤大出血位置和时间难以控制，个体差异大过程不够自然自体血注射法详述胶原酶注射法详述通过立体定位仪将自体新鲜血液通常注入特定脑区通常为向目标脑区注射细菌胶原酶，酶消化基底膜导致血管破裂和25-100μl

0.1-

0.5U纹状体注射速度控制在分钟，以防止液体回流和组织损伤持续性出血出血过程缓慢数小时，更接近临床的进展性出血5-10μl/ICH注射后保持针头原位分钟，然后缓慢撤出5该模型特别适合研究继发性脑损伤和血肿扩大机制，但引入外源性酶可该方法可精确控制出血位置和体积，重复性好，是药物筛选的理想模型能带来额外的炎症反应动物模型选择对比表模型方法适应性可控性创伤性临床相关性线栓法广泛高低中等开颅法常用高中较高光化学法局灶很高很低高三氯化铁局部中很低中自体血栓模拟自然低中高1机制研究模型选择2药物筛选模型选择3转化研究模型选择研究脑缺血基础机制时，线栓法和开颅溶栓药物研究应选择自体血栓法；抗血临床前转化研究应尽可能选择与临床相法最为常用，因其稳定性和重复性好小板药物研究适合三氯化铁法或电流损关性高的模型，如自体血栓法同时，若需研究特定脑区，可选择光化学法进伤法；神经保护剂筛选则以线栓法最为在大型动物上验证小型动物获得的结果行精确定位标准化也十分重要模型评判标准梗死体积神经功能评分衡量脑组织损伤程度的直接指标，通常通过评估动物行为和神经功能缺损，反映模型的功染色或测量理想模型应产生稳定、能学意义常用量表包括、评TTC MRImNSS Garcia可重复的梗死范围，变异系数小于分等，应显示与梗死体积相关的功能障碍20%血流动力学变化存活率通过激光多普勒等方法监测脑血流变化，验证反映模型的安全性和可操作性理想模型24缺血程度理想模型应显示明确的血流下降小时存活率应，过高死亡率不仅不人道，80%通常和稳定的缺血状态也增加实验成本和伦理问题70%综合评价一个脑卒中模型需要多维度指标除了上述主要指标外，还应考虑模型的稳定性、重复性、与临床的相关性以及操作难度等因素不同研究目的可能强调不同的评价指标，如药物筛选研究更看重模型的稳定性和功能学意义梗死体积测量方法染色法影像评估TTC MRI三苯基氯化四氮唑是最常用的脑梗死体积测量方法磁共振成像是活体无创评估梗死体积的金标准，可进行连续动态观察2,3,5-TTC TTC在存在脱氢酶的正常组织中被还原为红色甲臢，而缺血坏死formazan加权像显示脑水肿和组织损伤•T2区域因缺乏脱氢酶活性而呈现苍白色扩散加权像早期检测细胞毒性水肿•DWI取新鲜脑组织，切成厚脑片•2mm灌注加权像评估脑血流灌注状况•PWI℃溶液中孵育分钟•372%TTC15-30不匹配识别缺血半暗带•DWI/PWI多聚甲醛固定•4%使用半自动分割软件计算体积•拍照并使用图像分析软件测量面积•优势在于可进行活体连续观察，无需牺牲动物，但设备昂贵，操作MRI计算公式梗死体积百分比梗死区域体积对侧半球体积ו=/100%复杂除上述方法外，组织学染色如、尼氏染色、脑组织水分含量测定和脑血管造影等也可辅助评估梗死程度多种方法联合使用可提高评估准确性HE神经功能行为学评分修正神经功能缺损评分mNSS综合评价运动、感觉、反射和平衡功能，满分分，分数越高表示损伤越严重评分项目包括18运动测试肢体活动，分•0-6感觉测试触觉和视觉，分•0-2平衡测试平衡木行走，分•0-6反射异常和病理反射分•0-4专项行为学测试针对特定功能的专项测试，更敏感地反映特定脑区损伤转棒测试评估运动协调能力•抓握力测试评估前肢肌力•悬尾测试评估平衡和前肢功能•粘性胶带去除测试评估感觉和精细运动•水迷宫评估学习记忆功能•Morris长期功能恢复评估针对慢性期神经功能恢复的专项测试阶梯行走测试评估精细运动协调•柱状物抓取测试评估灵巧度恢复•新物体识别评估认知功能恢复•社交互动测试评估行为复杂性•行为学评分应在固定时间点进行，通常包括术前基线、术后小时、天、天、天等时点为减少主观偏倚，理想情况下应由不知分243714组的观察者进行盲法评分根据研究目的选择合适的行为学测试十分重要，例如针对运动皮层损伤的研究应强调运动功能测试血流动力学监测激光多普勒血流仪其他血流监测技术LDF最常用的脑血流监测方法，基于红细胞运动引起的多普勒频移原理激光散斑成像无接触测量较大脑区血流分布，空间分辨率高LSI准备在目标区域钻小孔，暴露脑表面脑磁共振血流灌注无创评估全脑血流，但需专用设备•MR perfusion探头放置固定在脑表面或颅骨上•基线记录记录分钟稳定基线值•10正电子发射断层扫描使用示踪剂精确量化脑血流和代谢，但成本PET动态监测实时记录造模全过程血流变化高•判断标准血流下降视为有效缺血•70%脑微透析监测脑组织代谢物变化，反映脑灌注状态优点在于实时性好、操作相对简便，但只能监测局部小范围血流，LDF组织氧分压监测直接测量脑组织氧合状态，反映供氧情况且受探头位置影响大血流监测不仅是确认造模成功的重要指标，也是研究缺血再灌注动态变化的关键工具理想情况下，应将血流变化与神经功能缺损和梗死体积相关联，-全面评估模型质量在药物干预研究中，血流监测尤其重要，可区分药物的血管作用和神经保护作用造模成功与失败案例成功造模案例常见失败原因分析线栓法成功案例•线栓插入深度不当过浅导致梗死不完全，过深可能穿破血管•血流下降80%并维持稳定•线栓直径不合适过细无法完全阻断，过粗可能损伤血管•TTC染色显示大脑中动脉供血区清晰梗死•血管解剖变异大鼠Willis环变异导致侧支循环差异•梗死体积占同侧半球30-40%•术中体温控制不当低温可显著减小梗死体积•mNSS评分10-14分•血压异常低血压会加重缺血，高血压可能导致出血•明显对侧前肢无力•麻醉深度过深麻醉可能保护神经元，影响模型图像特点梗死区边界清晰，主要位于纹状体和皮层区域，无蛛网膜下出血成功MCAO模型TTC染色显示皮层-纹状体梗死，边界清晰，梗死区呈白色，正常组织呈红色血管穿破失败案例线栓插入过深穿破血管壁，导致蛛网膜下腔出血，表现为脑表面广泛出血不完全梗死各种建模方法典型应用线栓法MCAO典型应用开颅法典型应用神经保护剂筛选多数批准的神经保护剂临床永久性缺血研究电凝产生稳定梗死•FDA•MCA前研究采用此模型皮层功能区特异性研究可精确选择阻断位置•缺血再灌注机制研究可控制再灌注时间点•经典案例缺血半暗带组织保护策略研究•经典案例自由基清除剂的临床前评价•edaravone光化学法典型应用微小梗死模型精确定位皮层特定功能区•小血管病研究多点照射产生多发性微梗死•经典案例运动皮层微梗死后神经可塑性研究•自体血栓法典型应用三氯化铁法典型应用溶栓药物研究如、尿激酶等效果评价抗血小板药物研究如氯吡格雷、阿司匹林评价•tPA•机械取栓研究配合血管内介入技术血栓形成机制研究血小板活化与内皮互作••经典案例新型溶栓药物与比较研究经典案例新型抗血小板聚集药物筛选•tPA•出血性模型典型应用止血药物研究如止血酶、凝血因子•VII血肿清除研究如尿激酶原溶血酶•经典案例重组活化因子评价•rFVIIa VII临床前药效研究流程1实验设计阶段确定研究目的与假设•选择合适模型与动物•确定给药方案剂量、时间、途径•设计分组与样本量•确定评价指标与时间点•制定随机化与盲法策略•2造模与干预阶段动物分组与编码盲法•基线检查与行为学测试•按标准流程进行造模•造模质量控制血流监测等•按方案进行药物干预•密切监测生理参数与不良反应•3评价指标检测神经功能评分多时间点•梗死体积测定或•TTC MRI生化指标检测氧化应激、炎症等•组织病理学检查•分子生物学指标基因、蛋白表达•安全性评价器官毒性、副作用•4数据分析与结论数据收集与整理•统计分析盲态解码后•剂量效应关系分析•-治疗时间窗探索•与阳性对照药比较•结论与临床转化价值评估•临床前药效研究应严格遵循指南推荐的标准理想的药效研究应包括多种动物种属验证、雌雄动物均衡、年STAIRStroke TherapyAcademic IndustryRoundtable龄因素考量、剂量效应关系探索、治疗时间窗确定、长期结局评价等-伦理规范与动物福利法规依据3R原则实验动物研究必须遵循国家和国际法规，包括《实验动物管理条例》、国际实验动物护遵循替代、减少、优化原则尽可能使用ReplacementReductionRefinement理与使用指南等所有动物实验方案必须经过伦理委员会审批体外模型替代，科学设计减少动物数量，优化操作减轻痛苦IACUC镇痛与麻醉人道终点必须提供适当麻醉与镇痛术中使用戊巴比妥或异氟烷麻醉，术后根据需要给予布洛芬预先设定人道终点标准，包括严重体重下降、严重神经功能障碍、无法进食饮20%等镇痛药物定期评估疼痛程度，必要时追加镇痛水、自伤行为等达到标准时应及时安乐死，避免不必要痛苦适当的术后护理安乐死方法保温术后使用加热垫维持体温₂吸入法逐渐增加浓度，减少应激••CO补液皮下注射生理盐水预防脱水麻醉药过量戊巴比妥超剂量静脉注射••喂食对进食困难动物提供软食或管饲颈椎脱位小型啮齿类动物的辅助方法••抗生素必要时预防感染安乐死确认确保心跳和呼吸完全停止••单笼饲养防止同笼攻击，便于观察•所有安乐死操作必须由经过培训的人员执行，确保快速、无痛和人道环境安静、温暖、避免应激•常见风险与防控麻醉风险管理出血控制术前禁食但不禁水熟悉血管解剖，避免损伤••根据体重精确计算麻醉剂量准备明胶海绵和棉签••持续监测呼吸和心率局部加压止血法••准备呼吸支持设备避免损伤大血管••避免麻醉药物过量小血管可电凝处理••感染预防严格无菌操作•术前剃毛和消毒•手术器械灭菌•术后伤口处理•必要时使用抗生素•呼吸管理体温管理保持气道通畅恒温手术台或加热垫••调整头位避免舌后坠直肠温度实时监测•••定期监测呼吸频率•目标温度37±

0.5℃准备气管插管设备避免热源过近造成烫伤••高度麻醉时辅助通气预防术后低温••操作者安全动物咬伤防护•锐器安全处理•化学试剂防护•激光安全操作•动物过敏预防•实验中应建立应急预案，处理突发情况操作前进行风险评估，准备相应急救设备和药品对新手应进行充分培训和指导，初期在有经验人员监督下操作定期总结经验教训，不断完善操作流程和风险防控体系建模过程注意事项动物选择与准备手术操作关键点体重范围大鼠，小鼠麻醉深度无痛反射但呼吸稳定•250-300g20-25g•年龄因素优先选择成年动物周体温控制全程维持在±℃•8-12•

370.5性别考量雌雄动物可能有不同反应手术时间尽量控制在分钟内••90健康状况排除有明显疾病的动物暴露血管避免牵拉和损伤••适应环境实验前天入室适应插入深度线栓法根据体重调整深度•7•术前禁食手术前小时禁食不禁水血流监测确认血流下降•8-12•70%出血控制及时处理小出血•1线栓法特殊注意事项2开颅法特殊注意事项3光化学法特殊注意事项线栓质量表面平滑，直径均匀，硅胶涂颅骨钻孔避免损伤脑组织和血管染料注射避免气泡和外渗•••层完整硬脑膜处理小心切开，避免出血光源定位准确对准目标区域••插入角度沿颈内动脉走向，避免强行插•血管识别正确辨认及其分支照射时间严格控制，避免过度损伤•MCA•入电凝操作功率适中，避免周围损伤防光保护操作者应佩戴防护眼镜••固定方法插入后稳固固定，防止移位•拔出技巧缓慢平稳拔出，避免血管痉挛•动物术后护理要点体温管理水分与营养术后低温是常见并发症，可加重神经损伤应使用加热垫脑卒中动物可能出现吞咽困难应在笼内放置水凝胶或将维持体温，直到动物完全清醒动物饲养环境温度应保持饮水瓶口降低便于获取食物可软化或研磨，严重病例需在℃，提供足够垫料供筑巢保暖进行管饲或皮下补液生理盐水，天22-2430-50ml/kg/监测与护理舒适环境定期检查体重变化、活动能力、饮食情况和排泄功能观提供干净、柔软的垫料，定期更换单笼饲养避免同群攻察伤口愈合情况，及时处理感染建立评分系统，对严重击保持环境安静，减少惊吓和应激光照周期保持稳定，病例加强观察频率和护理强度避免过度干扰动物休息特殊症状处理监测频率建议偏瘫提供容易获取的食物和水术后小时内每小时检查一次••61-2旋转行为增加笼舍空间，减少障碍物术后小时内每小时检查一次••244痉挛必要时使用抗痉挛药物术后天每小时检查一次••1-38自伤行为可使用伊丽莎白圈术后天每小时检查一次••4-712严重神经症状考虑提前终点术后天后每日检查一次••7典型问题与应对策略线栓法动脉破裂梗死体积不一致问题表现插入线栓时感到阻力突然消失，撤出线栓有大量鲜血，动物问题表现同一批次动物，梗死范围差异大，变异系数30%瞳孔扩大原因分析环解剖变异、线栓位置不一致、体温控制不严格、麻Willis原因分析线栓插入过深或角度不当，用力过猛导致血管穿破醉深度不同解决方案立即撤出线栓，夹闭出血血管，使用明胶海绵压迫止血调解决方案使用激光多普勒验证缺血程度，严格控制体温在±℃，

370.5整线栓直径和插入深度，插入时避免用力过猛标准化线栓制备流程，考虑预先筛查环解剖结构Willis术后死亡率高问题表现动物术后小时内死亡率2430%原因分析梗死范围过大、蛛网膜下出血、麻醉过量、体温过低、术后护理不足解决方案缩短缺血时间，优化线栓深度，加强术后保温和补液，提供软食和易取水源，考虑预防性抗生素使用血流再灌注不良感染并发症问题表现撤出线栓后，激光多普勒血流恢复不足基线值问题表现伤口红肿，体温升高，白细胞计数增高，行为异常50%原因分析血管痉挛、线栓撤出损伤内皮、微血栓形成、线栓残留原因分析手术无菌操作不严格，术后环境不洁，免疫力下降解决方案撤出线栓时动作轻柔缓慢，考虑使用硝酸甘油局部舒张血管，解决方案严格无菌操作，术前术后使用碘伏消毒，必要时使用抗生素延长监测时间等待自然恢复，重新检查线栓完整性青霉素或恩诺沙星，提供清洁环境和垫料模型成功率低问题表现造模成功率，许多动物无明显神经功能缺损70%原因分析操作技术不熟练，线栓质量不稳定，动物个体差异大解决方案增加培训和练习，标准化线栓制备流程，使用激光多普勒实时验证，考虑增加手术量以提高熟练度最新脑卒中动物模型进展基因编辑模型机器人辅助造模多模态成像评估利用技术创建精确基因修饰的使用微创机器人系统进行精确血管操作，减少结合多种成像技术实时评估脑缺血状态如CRISPR/Cas9脑卒中易感动物如敲除血管紧张素转换酶人为因素影响机器人系统可实现微米级精度，联合成像同时获取脑血流和代谢信PET-MRI基因，增加缺血敏感性；或过表达显著提高造模一致性和成功率，特别适用于小息；光声成像技术无创监测血氧饱和度；扩散2ACE2组织型纤溶酶原激活剂基因，研究内源鼠等小型动物模型张量成像评估白质纤维束完整性tPA性溶栓机制自发性脑卒中模型类器官与微流控芯片开发更接近人类自然发病过程的模型如高血压自发性卒中大鼠体外脑器官样结构模拟脑卒中微环境人源性诱导多能干细胞iPSC，可在不需外科干预的情况下自发发生脑卒中；动脉粥样硬化分化的脑类器官可模拟人脑缺血反应；器官芯片技术整合神经元、胶质SHRSP易感小鼠结合高脂饮食，研究粥样硬化相关性卒中细胞和内皮细胞，研究神经血管单元在缺血中的相互作用ApoE-/-这类模型虽然造模时间长，但病理过程更接近人类慢性疾病发展过程，这些新型体外模型可部分替代动物实验，符合原则，也便于高通量药3R为慢性干预研究提供平台物筛选复杂疾病联合模型卒中合并糖尿病模型通过链脲佐菌素STZ注射或高脂高糖饮食诱导糖尿病，待血糖稳定升高后进行脑卒中造模这类模型显示更严重的神经损伤和更差的功能恢复，类似临床中糖尿病患者脑卒中预后较差的情况卒中合并高血压模型使用自发性高血压大鼠SHR或通过植入缓释昇压药物微泵建立高血压状态，再进行脑卒中造模高血压背景下，脑梗死体积更大，出血转化风险增加，对再灌注治疗反应也不同卒中合并老龄模型使用18-24月龄老年动物进行脑卒中造模老龄动物对缺血损伤更敏感，炎症反应更强，神经再生能力减弱，更接近老年患者的病理特点老龄模型特别适合评估适用于老年人的治疗策略真实科研案例分享1神经保护剂筛选案例研究团队使用模型筛选一种新型谷氨酸受体拮抗剂初期模型梗死体积变异大MCAO，通过标准化线栓制备、严格控制体温和使用激光多普勒监测，将变异系数CV30%降至以下最终证实该药物在分钟给药窗口内有显著神经保护作用，减少梗15%60-90死体积以上40%2细胞治疗研究案例团队使用改良开颅法建立永久性模型，研究间充质干细胞移植治疗脑卒中MCAO MSCs的效果通过优化细胞移植时间窗缺血后天和移植途径侧脑室注射，显著提高了细3胞治疗效果长期随访周显示治疗组功能恢复明显优于对照组，为后续临床试8MSCs验提供了有力支持3多中心验证案例一项新型溶栓药物在单中心研究中显示出色疗效，但临床转化前需多中心验证研究者建立了标准化自体血栓模型操作规程，在个实验室同步进行验证初期结果差异大，通5过视频培训、现场指导和关键参数标准化，最终实现了结果一致性该药物在所有中心均显示比更长的治疗时间窗和更低的出血风险tPA以上案例共同特点是高度重视模型质量控制，严格遵循随机化、盲法原则，并采用多种结局指标全面评价干预效果成功的转化研究通常从机制验证开始，经过剂量探索、时间窗确定、多种动物验证等系统研究，最终为临床试验提供全面依据造模操作视频动态图演示/线栓法MCAO关键步骤操作难点分解颈部正中切口，分离肌肉，暴露颈总动脉血管分离轻柔操作，避免血管痉挛

1.•分离颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉远端线栓准备尖端涂硅胶，直径

2.•

0.28-

0.32mm颈总动脉和颈内动脉临时夹闭插入深度大鼠，小鼠

3.•18-20mm9-11mm颈外动脉近端剪小口，插入线栓阻力判断轻微阻力表示到达中动脉起始部

4.•松开颈内动脉夹，将线栓前送至阻力点血流监测激光多普勒显示血流下降

5.•70%固定线栓，恢复颈总动脉血流线栓固定使用缝线轻轻固定，避免滑脱

6.•阻断维持分钟后撤出线栓线栓撤出缓慢平稳，避免血管损伤

7.60-90•血管暴露线栓插入血流监测建模常见仪器与耗材手术显微镜放大倍数倍，带冷光源推荐品牌蔡司、徕卡选择带摄像系统的显微镜便于记录和教学操作细小血管和神经组织必备，特别是开颅法和小鼠模型6-40ZEISS Leica温控设备恒温手术台或加热垫，温度控制精度±℃配套直肠温度探头实时监测体温控制对梗死体积影响显著，是标准化模型的关键设备

0.5激光多普勒血流仪品牌推荐、带软件记录系统，可连续监测局部血流变化是验证缺血模型成功的标准设备，特别适用于线栓法和光化学法PeriFlux MoorInstruments必备手术器械消耗品与耗材显微手术器械套装眼科级线栓尼龙单丝，••

0.28-

0.32mm微血管夹不同尺寸硅胶涂层材料••微型持针器和显微剪染色粉••TTC骨钻钻头三苯基氯化四氮唑•

0.8-

1.2mm•2,3,5-立体定位仪用于颅内注射玫瑰红光化学法••小动物麻醉机异氟烷三氯化铁溶液••10-50%小动物呼吸机备用生理盐水、氯化钠••缝合材料至麻醉药物水合氯醛、戊巴比妥•6-010-0•消毒液碘伏、酒精•75%无菌手术巾和手套•器材选择应考虑实验需求、预算和实验室条件初建实验室可先购置基础设备，如显微镜、温控设备和基础手术器械，逐步添加专业设备高精度设备如激光多普勒可显著提高模型质量，但价格昂贵，可考虑多个研究组共享使用造模标准操作流程SOP1术前准备阶段•动物筛选检查体重、活动度、无明显疾病•随机分组使用随机数表分配实验组别•术前禁食手术前8-12小时禁食不禁水•器械准备灭菌消毒手术器械•线栓准备检查线栓直径、涂层完整性•设备检查激光多普勒、温控设备校准2麻醉与监测•麻醉剂量水合氯醛350mg/kg或异氟烷

1.5-2%•麻醉深度确认无痛反射，呼吸规律•体温监测直肠温度探头，维持37±

0.5℃•呼吸监测观察呼吸频率和深度•基线生理参数记录体重、体温、呼吸率3手术操作（线栓法）•激光多普勒探头放置钻孔或颅骨变薄•记录基线血流稳定10分钟•颈部切口暴露并分离颈动脉•血管处理按标准顺序夹闭和结扎•线栓插入控制深度，检查位置•缺血确认血流下降70%，维持预定时间•再灌注撤出线栓，确认血流回升50%4术后处理•伤口缝合使用5-0或6-0缝线•消毒碘伏消毒伤口•镇痛布洛芬5mg/kg皮下注射•补液生理盐水5ml皮下注射•保温加热垫直至完全清醒•单笼饲养标记笼号，记录手术信息1关键节点与验收标准•血流下降较基线下降≥70%视为有效阻断•再灌注标准血流恢复至基线的≥50%•体温波动全程不超过±

0.5℃•手术时间从切皮到缝合不超过90分钟•术后24小时死亡率应低于20%数据管理与实验记录原始数据记录规范数据存储与备份使用专用实验记录本，页码连续编号电子数据使用统一命名规则••记录实验日期、操作者、实验编号图像数据保存为原始格式和分析格式••详细记录动物信息品系、性别、体重、年龄建立数据备份机制本地云端••+手术参数完整记录麻醉剂量、阻断时间等重要数据至少三重备份••实时记录生理参数体温、血流变化等定期每周或每月数据归档••记录异常情况和处理方法原始记录保存至少年••5原始图像数据染色照片、图像等附编号保存设置数据访问权限管理•TTC MRI•行为学评分原始记录表关键数据加密保存••数据分析与质控盲法实施与管理实验管理系统实验数据分析前进行质量控制，包括异常值检测、实验采用三盲设计手术操作者不知分组，评估者建立实验室信息管理系统，整合实验设计、LIMS缺失值处理和一致性检查建立标准化分析流程，不知分组，数据分析者不知分组使用编码系统替操作记录、数据收集和分析系统应支持实验流程确保分析方法一致对关键数据如梗死体积测量应代实验组名称，由非直接参与实验的人员保管编码追踪、资源管理、数据可视化和报告生成，提高实由两名以上研究者独立分析，结果差异大时需第三只有在数据分析完成后才进行解码，确保客观性验效率和数据可靠性小型实验室可使用电子表格方评判建立简易管理系统跨实验室模型结果对比标准化协议建立多中心研究首先需建立详细的标准操作规程SOP，包括动物选择标准、手术步骤、评估方法和数据分析流程SOP应包含足够细节，确保不同实验室能复制相同操作关键步骤可通过视频演示辅助培训质量控制体系建立多层次质量控制体系，包括预实验培训、操作技能评估、样本交叉验证和定期质控检查可设立中心实验室负责关键样本的集中分析，减少实验室间系统误差定期举行技术研讨会解决操作差异问题数据一致性分析使用统计学方法评估实验室间结果一致性，如组内相关系数ICC、Bland-Altman分析等识别影响结果一致性的关键因素，如动物供应商差异、环境条件变化、操作者经验等针对性调整以提高数据可比性课后考核与答疑理论考核内容操作技能评估常见疑难问题脑卒中模型基本原理与分类显微手术基本技能测试不同批次动物模型结果差异大•••各类模型的适应症与局限性血管分离与处理能力梗死范围个体差异如何控制•••模型建立的关键技术参数线栓制备与插入技术术后高死亡率原因分析•••常见并发症及处理方法激光多普勒使用与血流监测药物研究阴性结果解释•••评价指标与结果分析染色与梗死体积测量伴随疾病模型的特殊考量••TTC•伦理规范与动物福利要求神经功能评分操作规范数据分析方法选择•••考核标准培训证书理论考核基础知识占，应用能力占，分析问题能力占完成全部课程并通过考核的学员将获得脑卒中动物模型建立技术培训证书，40%30%30%证明已具备独立进行模型构建和评价的能力操作考核手术技能占，仪器使用占，异常处理占，结果评估50%20%20%占证书分为基础级和高级两种，高级证书要求能独立完成至少种不同类型的脑10%3卒中模型构建，并具备培训他人的能力合格标准理论和操作均需达到分以上，操作关键步骤无重大失误70考核结束后将安排专家答疑环节，解答学员在实践中遇到的具体问题学员也可通过线上平台继续交流，分享经验和解决新出现的问题培训机构将提供为期个3月的远程技术支持，协助学员在各自实验室成功建立模型总结与展望未来发展方向转化研究挑战多模型、多物种验证将成为标准实践伴随疾病模型、模型技术进步尽管动物模型取得长足进步，脑卒中治疗从实验室到老龄动物模型和人源化模型将更受重视体外模型如脑卒中动物模型技术从早期简单的开颅法发展到如今临床的转化仍面临挑战多数在动物模型中有效的神脑器官样结构和器官芯片将部分替代动物实验人工多样化、标准化的模型体系新技术如基因编辑、多经保护剂在临床试验中失败，提示我们需要更全面思智能辅助分析将提升数据价值规范化、标准化研究模态成像和微创手术技术不断提升模型的精确度和临考物种差异、合并症影响和临床试验设计等因素流程将促进结果可靠性和可重复性床相关性未来将向更精准、个体化和微创方向发展模型建立核心原则转化研究建议目的导向根据研究问题选择合适模型多模型验证不同模型交叉验证结果••技术规范严格遵循标准操作流程多物种验证从啮齿类到大型动物••质量控制多参数验证模型有效性考虑合并症研究常见基础病影响••伦理优先遵循原则，保障动物福利长期结局关注慢性期功能恢复•3R•数据透明完整报告所有相关参数剂量探索建立明确剂量效应关系••-综合评价多指标评估干预效果时间窗探索确定临床可行治疗窗口••脑卒中动物模型作为连接基础研究与临床应用的桥梁，其重要性不言而喻掌握规范的模型构建技术，理解各模型的特点与局限，合理设计实验方案，是开展高质量脑卒中研究的基础希望本课程所传授的知识和技能能帮助各位研究者在脑卒中研究领域取得更大成就，最终造福患者。