蛋白质教学课件

蛋白质教学课件蛋白质简介蛋白质是生命的物质基础，在生物体内承担着构建细胞结构、催化生化反应、传递信号等多种关键功能作为生命体内最丰富的有机大分子，蛋白质约占细胞干重的，在人体中约占干重的这些生命50-80%20%的积木由氨基酸通过肽键连接形成，每一种蛋白质都拥有特定的氨基酸序列，这种序列决定了蛋白质的三维结构和生物学功能蛋白质的多样性令人惊叹人体内含有约万种不同的蛋白质，每种——10都有其特定结构和功能从构成肌肉的肌动蛋白，到运输氧气的血红蛋白，再到参与免疫防御的抗体蛋白，蛋白质无处不在，是维持生命活动的核心分子蛋白质的重要性结构基石代谢调控防御保护蛋白质是细胞和组织的主要构建成分，酶是一类特殊的蛋白质，能催化几乎所免疫系统中的抗体蛋白能特异性识别和形成细胞骨架、肌肉纤维和结缔组织有生物化学反应人体内有数千种不同中和外来病原体血液凝固蛋白如纤维例如，胶原蛋白是皮肤、骨骼和肌腱的的酶，每种酶都能特异性地催化特定反蛋白参与创伤修复过程蛋白质还参与主要成分，角蛋白构成头发和指甲，肌应代谢途径中的每一步通常都由特定细胞凋亡调控，清除受损或异常细胞，动蛋白和肌球蛋白组成肌肉纤维这些的酶催化，使反应速率提高数百万倍防止肿瘤形成这些功能共同构成了机结构蛋白为生物体提供形态和机械支此外，激素蛋白如胰岛素调控代谢过体的防御屏障，保护生命健康持程，维持机体内环境稳态氨基酸的结构氨基酸是蛋白质的基本构建单元，也是自然界中最重要的含氮有机化合物之一每个氨基酸分子都有一个中心碳原子（称为α碳），与四个不同的化学基团相连一个氨基（-NH₂）、一个羧基（-COOH）、一个氢原子（-H）和一个侧链（-R基团）正是这个R基团的差异，造就了20种标准蛋白质氨基酸的多样性和特异性氨基酸的结构公式可表示为氨基酸因同时含有氨基和羧基而具有两性电解质的性质，在不同pH环境下可以形成阳离子、两性离子或阴离子在生理pH条件下，大多数氨基酸以两性离子形式存在，即氨基质子化为-NH₃⁺，羧基解离为-COO⁻氨基酸分类必需氨基酸1非必需氨基酸2极性氨基酸3非极性氨基酸4酸性碱性氨基酸/5根据人体是否能合成，氨基酸可分为必需氨基酸和非必需氨基酸必需氨基酸是指人体不能合成或合成速率不能满足需要，必须从食物中摄取的氨基酸，包括赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和组氨酸（儿童还需要精氨酸）非必需氨基酸则是人体能够合成的氨基酸，如丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等根据侧链R基团的化学性质，氨基酸又可分为

1.非极性氨基酸侧链以碳氢结构为主，疏水性强，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸

2.极性无电荷氨基酸侧链含有极性基团但不带电荷，如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸

3.酸性氨基酸侧链含有额外的羧基，在生理pH下带负电荷，如天冬氨酸和谷氨酸

4.碱性氨基酸侧链含有氨基或咪唑基，在生理pH下带正电荷，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸氨基酸的理化性质等电点反应特性等电点（pI）是氨基酸在该pH值下呈电中性状态氨基酸可参与多种化学反应的pH值在等电点时，氨基酸分子中正负电荷数•酸碱反应氨基酸是两性电解质，能与酸碱发量相等，表现为两性离子形式，溶解度最小，不在生中和反应电场中移动等电点计算公式为•酯化反应羧基与醇反应形成酯•酰化反应氨基与酰基化试剂反应•脱羧反应在特定条件下失去CO₂其中pKa₁和pKa₂分别为氨基和羧基的解离常数•脱氨反应失去氨基形成α-酮酸的负对数对于含有带电侧链的氨基酸，计算更为•茚三酮反应与茚三酮反应生成紫色产物，用复杂，需考虑侧链的pKa值于氨基酸的检测和定量溶解性色谱分离氨基酸在水中的溶解性与其结构紧密相关极性氨由于氨基酸之间存在理化性质差异，可以使用多种基酸因能与水分子形成氢键而溶解性好；非极性氨色谱技术进行分离基酸溶解性相对较差；在等电点时，氨基酸的溶解度达到最低值此外，氨基酸在有机溶剂中几乎不•离子交换色谱基于氨基酸电荷差异溶解•薄层色谱利用极性差异•高效液相色谱（HPLC）高效精确分离复杂混合物肽键的形成氨基酸准备脱水反应肽键形成两个氨基酸分子靠近，准备进行化学反应一个氨基在反应过程中，第一个氨基酸的羧基中的-OH与第二脱水后，第一个氨基酸的碳原子与第二个氨基酸的氮酸的羧基（-COOH）与另一个氨基酸的氨基（-个氨基酸的氨基中的-H结合形成水分子（H₂O）并原子之间形成了共价键，这种特殊的化学键称为肽键NH₂）相互靠近这一过程通常在生物体内由酶催化释放出来，这是典型的脱水缩合反应此反应需要能（-CO-NH-）肽键具有部分双键特性，呈平面结进行，而在实验室中则需要活化剂参与量投入，在生物体内由ATP提供能量支持构，限制了肽链的旋转自由度肽键是蛋白质结构中最基本的化学键，连接着组成蛋白质的氨基酸单元肽键形成后，多肽链表现出明显的方向性，通常用N端（氨基端）到C端（羧基端）来表示肽键的特殊电子结构使其表现出部分双键特性，使C-N键周围的六个原子（Cα-C-O-N-H-Cα）保持在同一平面内，这大大限制了肽链的构象自由度，对蛋白质的折叠和结构稳定性有重要影响多肽与蛋白质当多个氨基酸通过肽键连接在一起时，形成的线性分子称为多肽根据链长的不同，多肽通常分为以下几类•寡肽（Oligopeptide）含2-10个氨基酸残基•多肽（Polypeptide）含10-100个氨基酸残基•蛋白质（Protein）通常含100个以上氨基酸残基然而，这种分类并非绝对，某些功能性蛋白质可能只有几十个氨基酸残基通常认为，具有明确三维结构和生物学功能的多肽链可称为蛋白质蛋白质可由单条多肽链构成，也可由多条多肽链（亚基）通过非共价键相互作用组装成复合结构例如，胰岛素由两条多肽链（A链21个氨基酸，B链30个氨基酸）通过二硫键连接构成；而血红蛋白则由四条多肽链组成蛋白质的多样性主要源于氨基酸序列的差异仅考虑20种标准氨基酸，一条含100个氨基酸残基的多肽链的可能组合数高达20¹⁰⁰，这个数字远远超过了宇宙中原子的总数！这种巨大的多样性使蛋白质能够执行生物体内几乎所有的功能性工作蛋白质的一级结构定义与特点测定方法蛋白质的一级结构是指组成蛋白质的氨基酸按蛋白质一级结构的测定方法主要包括1特定顺序排列形成的线性序列，即从N端到C Edman降解法从N端逐个切下氨基酸并鉴端的氨基酸残基连接顺序这种序列由基因编定；2质谱分析通过蛋白质或多肽片段的质码决定，是蛋白质结构的最基本层次，决定了荷比确定氨基酸组成和序列；3基因测序间接蛋白质的所有高级结构和功能特性一级结构推导通过测定编码蛋白质的基因序列，根据的改变（如点突变导致单个氨基酸替换）可能遗传密码推导氨基酸序列随着技术发展，目导致蛋白质功能改变甚至丧失前已测定并收录数百万种蛋白质的一级结构突变影响一级结构上的微小变化可能导致显著的功能后果经典案例是镰状细胞贫血症，仅因血红蛋白β链第6位谷氨酸被缬氨酸替代，导致蛋白质聚合形成纤维状结构，使红细胞变形为镰刀状，功能受损类似地，很多遗传病如苯丙酮尿症、白化病等都是由特定蛋白质一级结构突变导致的蛋白质的二级结构螺旋结构折叠结构αβα螺旋是蛋白质中最常见的二级结构之一，由单β折叠是另一种重要的二级结构，由多肽链呈之条多肽链螺旋状盘绕形成其主要特点包括字形排列形成其特点包括•每个螺旋转角约含

3.6个氨基酸残基•多肽链呈伸展状态，相邻氨基酸之间距离为•螺旋上每个氨基酸的C=O与其后第四个氨基

0.35nm酸的N-H之间形成氢键•相邻肽链间通过氢键连接，形成片层状结构•所有侧链（R基团）指向螺旋外侧•根据相邻肽链方向可分为平行β折叠和反平•每转螺旋上升距离为

0.54nm行β折叠•右手螺旋为稳定构象•侧链在片层的上下方交替排列α螺旋在球状蛋白中分布广泛，如肌红蛋白中约β折叠常见于丝蛋白等纤维状蛋白中，也是很多球状蛋白的重要组成部分例如，抗体分子中的75%的氨基酸残基参与形成α螺旋某些蛋白质如α-角蛋白几乎完全由α螺旋构成脯氨酸因其β折叠结构对其抗原结合能力至关重要特殊结构常破坏α螺旋的连续性无规则卷曲和转角β蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是指单条多肽链在空间中的完整三维折叠构象这种折叠通常使疏水性氨基酸侧链集中在蛋白质内部，而亲水性侧链暴露在表面，形成热力学稳定的结构多种分子间力共同维持三级结构的稳定疏水相互作用1非极性氨基酸侧链倾向于聚集在蛋白质内部，远离水环境，这是三级结构形成的主要驱动力疏水核心的形成显著增加了蛋白质的稳定性氢键2除参与二级结构形成的氢键外，蛋白质中还存在许多其他氢键，连接不同区域的主链和侧链，增强结构稳定性离子键（盐桥）3带相反电荷的氨基酸侧链（如赖氨酸和谷氨酸）之间形成的静电吸引力，对维持特定构象具有重要作用二硫键4蛋白质的三级结构决定了其生物学功能例如，酶的活性中心通常由远离彼此的两个半胱氨酸残基的巯基（-SH）之间通过氧化形成的共价键（-S-S-），对许多分泌蛋白和胞外蛋白的稳定性至氨基酸在空间上聚集形成；受体蛋白的配体结合位点由特定折叠区域构成；膜蛋关重要白的跨膜区域富含疏水氨基酸，易于嵌入脂质双分子层范德华力5非极性基团之间的弱相互作用，虽然单个作用力很弱，但数量众多，对蛋白质结构稳定性有重要贡献蛋白质的四级结构定义与组成相互作用力蛋白质的四级结构是指由两个或多个多肽链维持四级结构稳定的主要是非共价相互作用，（亚基）通过非共价相互作用组装成的复合体包括疏水相互作用、氢键、离子键和范德华结构每条多肽链都有自己的一级、二级和三力在某些情况下，亚基间也可能通过二硫键级结构，它们通过精确的方式组装在一起，形连接，如胰岛素中的A链和B链这些相互作成功能性的蛋白质整体具有四级结构的蛋白用虽然单个较弱，但数量众多，共同提供了足质也称为寡聚蛋白或多亚基蛋白够的稳定性典型例子对称性血红蛋白是研究最透彻的多亚基蛋白之一，由多亚基蛋白质通常表现出某种对称性，如二聚两个α链和两个β链组成四聚体每个亚基都体的二重轴对称、四聚体的四重轴对称等这含有一个血红素辅基，能可逆结合氧分子肌种对称性不仅使结构更稳定，也与蛋白质的功红蛋白虽与血红蛋白结构相似，但只有单个亚能协同性和调节机制密切相关例如，血红蛋基，没有四级结构，其氧结合曲线为双曲线，白的四个亚基间存在协同作用，使氧结合呈S不具协同性型曲线蛋白质的分类简单蛋白质仅由氨基酸组成，水解后只产生氨基酸包括白蛋白、球蛋白、谷蛋白、组蛋白、胶原蛋白等这类蛋白质结构相对简单，但功能多样，从运输到结构支持均有涉及结合蛋白质除蛋白质部分外，还含有非氨基酸成分（称为辅基或辅因子）辅基可能是金属离子、有机分子或其他生物大分子水解后产生氨基酸和非氨基酸组分包括糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白等派生蛋白质由蛋白质经物理或化学变化（如热、酸、碱处理）产生的衍生物可分为初级派生蛋白（如变性蛋白）和次级派生蛋白（如蛋白胨、肽酮等蛋白质降解产物）这类蛋白质常见于食品加工过程或消化过程中除上述基于化学组成的分类外，蛋白质还可根据其他标准分类

1.按溶解性分类可溶性蛋白质（如白蛋白、球蛋白）和不溶性蛋白质（如纤维蛋白、角蛋白）

2.按生物学功能分类酶类、调节蛋白、运输蛋白、结构蛋白、防御蛋白、储存蛋白等

3.按形状分类球状蛋白（如酶、血红蛋白）和纤维状蛋白（如胶原蛋白、角蛋白）

4.按细胞定位分类细胞质蛋白、膜蛋白、核蛋白、分泌蛋白等简单蛋白质类型球状蛋白纤维状蛋白球状蛋白是一类形状近似球形或椭球形的蛋白质，通纤维状蛋白是一类呈长纤维状的蛋白质，通常不溶于常可溶于水或盐溶液这类蛋白质的多肽链紧密折水和一般溶剂这类蛋白质的多肽链沿一个方向延叠，形成紧凑的三维结构，疏水氨基酸侧链主要位于伸，形成纤维状结构，主要起结构支持和保护作用分子内部，而亲水氨基酸侧链则位于表面球状蛋白主要类型包括在生物体内执行大多数功能性工作，主要类型包括•胶原蛋白结缔组织的主要成分，由三条多肽链以特殊方式缠绕成三股螺旋结构广泛存在于皮•白蛋白如血清白蛋白，在血浆中含量最高，主肤、骨骼、肌腱和血管等组织中，提供张力强度要功能是维持渗透压和运输小分子物质•角蛋白富含二硫键的硬蛋白，是头发、指甲、•球蛋白如免疫球蛋白（抗体），参与免疫防御羽毛、角质等的主要成分，提供机械强度和保护•组蛋白与DNA结合形成染色体的基本单位—•弹性蛋白具有弹性的结构蛋白，存在于皮肤、—核小体血管、韧带等需要弹性的组织中•酶蛋白几乎所有酶都是球状蛋白，如消化酶胰•肌动蛋白和肌球蛋白肌肉收缩的主要功能蛋蛋白酶、代谢酶糖原磷酸化酶等白，通过滑行机制产生收缩力•激素蛋白如胰岛素、生长激素等•纤维蛋白血液凝固过程中形成的不溶性蛋白，构成血凝块主要成分•运输蛋白如血红蛋白、肌红蛋白、脂肪酸结合蛋白等球状蛋白对温度、pH和化学试剂敏感，容易变性，变性后通常失去生物活性结合蛋白质类型糖蛋白脂蛋白核蛋白糖蛋白含有共价连接的碳水化合物基团，通常通过N-糖苷键（与脂蛋白含有非共价结合的脂质分子，主要功能是运输脂溶性物核蛋白是蛋白质与核酸（DNA或RNA）结合形成的复合物最天冬酰胺残基的氮原子连接）或O-糖苷键（与丝氨酸或苏氨酸残质血浆脂蛋白如低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白典型的例子是染色体，由DNA与组蛋白和非组蛋白形成的复合基的羟基连接）与多肽链相连糖基化修饰影响蛋白质的稳定（HDL）负责胆固醇等脂质的运输；细胞膜中的脂蛋白参与信号物，负责遗传信息的储存和表达调控病毒粒子中的核衣壳也是性、溶解性和抗蛋白酶降解能力，并参与细胞识别和免疫应答转导和物质跨膜转运脂蛋白按密度可分为乳糜微粒、极低密度由蛋白质与核酸组成的核蛋白复合物这些复合物在基因表达、典型例子包括抗体、细胞表面受体和血型抗原脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白DNA复制和修复中发挥关键作用其他重要的结合蛋白类型还包括•金属蛋白含有金属离子的蛋白质，如含铁的血红蛋白、含锌的碳酸酐酶、含铜的细胞色素氧化酶等金属离子通常参与催化反应或维持蛋白质结构稳定性•磷蛋白含有共价结合的磷酸基团，如酪蛋白（牛奶中的主要蛋白质）磷酸化修饰常用于调节蛋白质活性、细胞信号传导和能量代谢•铬蛋白含有色素基团的蛋白质，如视紫红质、细胞色素等这些蛋白质通常参与光感应或电子传递过程蛋白质的生物功能蛋白质的调节功能激素蛋白质受体蛋白信号转导蛋白激素是体内重要的化学信使，其中许多是蛋白质或多肽蛋白受体蛋白是细胞识别和响应外部信号的关键分子细胞表面受信号转导蛋白负责传递和放大受体接收到的信号这类蛋白质质激素通过与靶细胞表面的特异性受体结合，激活细胞内信号体如G蛋白偶联受体、酪氨酸激酶受体和离子通道型受体，负包括G蛋白、蛋白激酶、磷酸酶和第二信使产生酶等信号转转导途径，调控基因表达和代谢活动胰岛素是最重要的蛋白责识别并结合细胞外配体（如激素、神经递质、生长因子导过程通常涉及蛋白质磷酸化级联反应，如MAP激酶级联质激素之一，由胰腺β细胞分泌，控制血糖水平胰岛素通过等），将细胞外信号转化为细胞内响应核受体如雌激素受信号蛋白之间的相互作用形成复杂的信号网络，能整合多种刺促进葡萄糖转运入细胞和刺激糖原合成，降低血糖浓度生长体、糖皮质激素受体等，位于细胞质或细胞核中，直接调控基激信号，产生协调的细胞响应这些蛋白质的精确调控对维持激素、催乳素和促肾上腺皮质激素等也是重要的蛋白质激素因表达受体蛋白的异常与多种疾病相关，如癌症、糖尿病和细胞内环境稳态至关重要，其功能异常可导致信号传导紊乱和神经退行性疾病疾病发生蛋白质的调节功能不仅表现在信号传导中，还包括基因表达调控转录因子是一类能与DNA特定序列结合的蛋白质，通过招募或阻碍RNA聚合酶活性，调控基因的转录水平不同的转录因子识别不同的DNA序列，允许特定基因在特定时间和特定细胞中表达此外，组蛋白修饰酶如乙酰转移酶、甲基转移酶等通过改变染色质结构，影响基因的可及性和表达水平蛋白质的防御功能抗体的防御机制抗体通过多种机制保护机体免受病原体侵害•中和作用直接结合病毒或细菌毒素，阻止其与宿主细胞结合•吞噬促进作用抗体Fc部分与吞噬细胞表面受体结合，促进吞噬•补体激活抗原-抗体复合物激活补体系统，形成膜攻击复合物，裂解靶细胞•抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）NK细胞识别抗体Fc部分，杀伤靶细胞其他防御蛋白除抗体外，还有多种蛋白质参与免疫防御•补体蛋白一系列血浆蛋白，激活后形成级联反应，增强炎症和免疫应答•干扰素病毒感染后产生的细胞因子，诱导抗病毒状态免疫球蛋白（抗体）是机体体液免疫系统中最重要的效应分子，由B淋巴细胞分泌抗•溶菌酶能破坏细菌细胞壁的酶，存在于唾液、泪液等体液中体分子呈Y字形，由两条重链和两条轻链通过二硫键连接而成每个抗体分子含有两•急性期蛋白炎症时肝脏产生的蛋白质，如C反应蛋白（CRP）个抗原结合部位（Fab区），能特异性识别并结合抗原；还含有一个Fc区，负责与补体•防御素广谱抗菌肽，作用于多种病原体的细胞膜系统和免疫细胞表面受体相互作用，激活下游免疫反应人体内存在五类抗体IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，各自在不同组织和免疫阶段发挥作用IgG是血清中含量最高的抗体，也是唯一能通过胎盘的抗体，为新生儿提供被动免疫保护蛋白质的运动功能肌肉蛋白结构肌肉收缩主要由两种蛋白质协同完成肌动蛋白（细肌丝）和肌球蛋白（粗肌丝）肌动蛋白是球状蛋白单体聚合成的双螺旋细丝；肌球蛋白由两条重链和四条轻链组成，形似高尔夫球杆，头部具有ATPase活性，能与肌动蛋白结合并水解ATP释放能量在骨骼肌中，这些蛋白质按特定方式排列，形成重复的肌节结构滑行机制肌肉收缩的分子基础是肌动蛋白和肌球蛋白的滑行机制当神经冲动到达肌肉时，引起钙离子释放，钙离子与肌钙蛋白结合，改变原肌球蛋白构象，暴露肌动蛋白上的肌球蛋白结合位点肌球蛋白头部结合ATP并与肌动蛋白结合，ATP水解提供能量使肌球蛋白头部构象改变，产生划桨运动，推动肌动蛋白丝向肌节中央滑动，导致肌肉收缩能量利用肌肉收缩过程需要持续供应ATP作为能量来源ATP水解为ADP和无机磷酸后，肌球蛋白头部与肌动蛋白的亲和力降低，准备进行下一轮结合-滑行循环肌肉细胞含有大量线粒体和肌红蛋白，前者通过有氧呼吸产生ATP，后者储存氧气供线粒体使用在无氧条件下，肌肉可通过糖酵解和肌酸磷酸系统快速产生ATP，但这些系统只能维持短时间的高强度收缩除了肌肉收缩，蛋白质在其他形式的生物运动中也扮演关键角色•细胞分裂中的纺锤体形成和染色体分离依赖微管蛋白和动力蛋白•细胞内物质运输由动力蛋白和驱动蛋白沿微管或肌动蛋白丝移动完成•细胞迁移过程中，肌动蛋白网络的重组和肌球蛋白的收缩提供推动力•鞭毛和纤毛的摆动由动力蛋白的ATP依赖性构象变化驱动•细菌鞭毛马达由蛋白质构成，利用质子动力势驱动旋转蛋白质的理化性质两性电解质性质分子量与胶体性质蛋白质分子含有多种电离基团，如羧基（-COOH）、氨基蛋白质的分子量范围极广，从几千道尔顿（如胰岛素，

5.8（-NH₂）、咪唑基（组氨酸）、巯基（半胱氨酸）和酚kDa）到数百万道尔顿（如血红蛋白，

64.5kDa）不等羟基（酪氨酸）等这些基团在不同pH环境下可以释放或大多数功能性蛋白质的分子量在10-200kDa之间蛋白接受质子，使蛋白质呈现两性电解质特性在酸性环境质分子尺寸通常在1-100nm范围，属于胶体粒子中，蛋白质带正电荷；在碱性环境中，带负电荷；在等电作为胶体，蛋白质溶液表现出一系列特征性质点pH值时，蛋白质的正负电荷数量相等，总电荷为零•丁达尔效应光束通过蛋白质溶液时发生散射等电点是蛋白质重要的理化参数，不同蛋白质的等电点差异很大•布朗运动蛋白质分子在溶液中做不规则热运动•电泳现象带电蛋白质在电场作用下向相反电极移动•酸性蛋白质（如胃蛋白酶）等电点7•透析性蛋白质不能透过半透膜，而小分子溶质可以•中性蛋白质等电点≈7溶解性•碱性蛋白质（如组蛋白）等电点7在等电点pH时，蛋白质溶解度最小，容易发生沉淀；偏离蛋白质的溶解性受多种因素影响等电点，溶解度增加这一性质是蛋白质分离纯化的重要•pH值在等电点溶解度最小，远离等电点溶解度增加基础•盐浓度低盐促进溶解（盐溶效应），高盐降低溶解度（盐析效应）•温度多数蛋白质溶解度随温度升高而增加，但过高温度会导致变性•有机溶剂通常降低蛋白质溶解度，容易导致变性蛋白质的分子量测定凝胶渗透色谱电泳SDS-PAGE凝胶渗透色谱（GPC）或凝胶过滤色谱（GFC）是基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分子大小分离蛋白质的方法色谱柱填充多孔凝胶颗是最常用的蛋白质分子量测定方法SDS是强阴离子表粒，小分子能进入凝胶孔隙而大分子被排除，导致不同面活性剂，能与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上均匀大小的分子以不同速率通过色谱柱通过比较样品蛋白的负电荷在电场作用下，蛋白质-SDS复合物主要按与已知分子量标准蛋白的洗脱体积，可以估算样品蛋白分子量大小在凝胶中分离通过比较样品条带与标准蛋的分子量这种方法适用于原生态蛋白，能保持蛋白质白条带的迁移距离，可计算样品蛋白的分子量这种方的生物活性，但精确度较低，误差可达±10%法简便快速，分辨率高，但会破坏蛋白质的天然结构和活性质谱分析沉降平衡法质谱是测定蛋白质精确分子量的现代技术常用的质谱超速离心沉降平衡法是通过测定蛋白质在离心场中的沉方法包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱降行为来确定分子量的经典方法当离心力与扩散力达（MALDI-TOF MS）和电喷雾电离质谱（ESI-到平衡时，蛋白质在离心管中形成浓度梯度通过分析MS）这些技术能将蛋白质电离为带电分子，通过测这一梯度，结合蛋白质的部分比容和溶液密度，可以计量其在电磁场中的飞行特性确定质荷比，进而计算分子算蛋白质的分子量这种方法适用于天然状态的蛋白量质谱分析具有极高的准确性（误差

0.01%）和灵质，能测定复合物的整体分子量，但操作复杂，耗时较敏度（可检测皮摩尔级样品），还能提供蛋白质组成和长修饰信息蛋白质的变性变性原因变性对结构和功能的影响蛋白质变性是指蛋白质的高级结构（二级、三级和四级结构）蛋白质变性导致多种可观察到的物理化学性质变化被破坏，而一级结构（氨基酸序列）保持不变的过程导致蛋•溶解度降低疏水基团暴露导致聚集和沉淀白质变性的因素包括•黏度增加展开的蛋白质链增加溶液黏度物理因素•旋光性改变空间结构改变影响偏振光旋转•紫外吸收增强芳香氨基酸暴露增强吸收•温度高温加速分子运动，破坏非共价键；低温影响疏水相互作用•酶活性丧失活性中心结构破坏导致催化功能消失•压力高压改变蛋白质构象，影响分子间相互作•抗原性改变表面抗原决定簇结构变化用变性与复性实验•剧烈振荡机械力可打断蛋白质氢键，导致变性（如蛋白质起泡）安芬森（Anfinsen）的核糖核酸酶复性实验是蛋白质折叠研•紫外线和电离辐射破坏化学键，特别是二硫键究的里程碑他发现完全变性和还原的核糖核酸酶在适当条件下能自发复性，恢复活性这表明蛋白质的一级结构决定其三维结构，折叠过程不需要额外信息这一发现支持了热力学化学因素假说，即蛋白质折叠至热力学最稳定状态•pH值极端pH改变氨基酸侧链电荷，破坏离子键和氢键•有机溶剂乙醇、丙酮等破坏蛋白质的疏水相互作用•变性剂尿素、盐酸胍等破坏氢键和疏水相互作用•表面活性剂SDS等破坏蛋白质的疏水核心•还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等还原二硫键•重金属离子与巯基结合，破坏蛋白质结构蛋白质的分离与纯化样品制备1从组织或细胞中提取蛋白质的第一步是制备均质液动物组织通常经过机械破碎和匀浆；植物组织可能需要额外的酶处理；微生物细胞则需要通过超声波、冻融或酶解等方法破壁破碎过程通常在低温条件下进行，并添加蛋白酶抑制剂防止降解沉淀法2破碎后经离心分离得到粗提液，可进一步分离特定细胞组分（如线粒体、核糖体盐析是最常用的初步分离方法，基于不同蛋白质在不同盐浓度下的溶解度差异硫等）酸铵是最常用的盐析试剂，具有高溶解度和稳定性通过逐步增加硫酸铵浓度，可分步沉淀不同蛋白质等电点沉淀利用蛋白质在等电点溶解度最小的特性，通过调色谱分离3节pH使目标蛋白质沉淀有机溶剂沉淀（如乙醇、丙酮）和热处理沉淀也常用于特现代蛋白质纯化主要依赖各种色谱技术离子交换色谱基于蛋白质表面电荷差异；定蛋白质的分离亲和色谱利用蛋白质与特定配体的特异性结合；凝胶过滤色谱基于分子大小差异；疏水相互作用色谱利用疏水性差异；高效液相色谱（HPLC）具有高分辨率和高效电泳技术4率不同色谱方法通常串联使用，逐步提高纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋白质分析和纯化的强大工具SDS-PAGE可分离变性蛋白质；天然PAGE保持蛋白质原生结构；等电聚焦电泳基于等电点差异分离；二维电泳结合等电聚焦和SDS-PAGE，提供高分辨率分离制备性电泳允许从纯度检测5凝胶中回收蛋白质，适用于小规模纯化电洗脱和电渗析技术可辅助蛋白质回收蛋白质纯度评估方法包括电泳分析观察条带数量；高分辨率色谱检测杂质峰；晶体学方法观察均一性；质谱分析检测杂质成分；活性测定评估功能纯度；免疫学方法检测特定杂质高纯度蛋白质通常表现为电泳单一条带，且多种检测方法结果一致蛋白质纯化过程中需不断检测纯度，指导后续纯化策略蛋白质的鉴定方法比色反应免疫学方法质谱鉴定比色法是蛋白质定性和定量的基础方法考马斯亮蓝免疫学方法利用抗体与抗原的特异性结合鉴定蛋白质免疫印质谱已成为蛋白质鉴定的主要方法典型流程包括蛋白质酶（Coomassie BrilliantBlue）结合蛋白质后颜色从棕红色迹（Western blot）结合电泳分离和抗体检测，能特异性识解（通常用胰蛋白酶）产生特征性肽段混合物；肽段通过液相变为蓝色，是SDS-PAGE凝胶染色的常用方法，检测限约为别复杂混合物中的目标蛋白质酶联免疫吸附测定（ELISA）色谱分离；电喷雾离子源将肽段电离；质量分析器测定肽段质

0.1-1μg蛋白质蛋白质的芳香氨基酸（主要是色氨酸和酪氨是高灵敏度的蛋白质定量方法，检测限可达皮克级免疫沉淀荷比；串联质谱（MS/MS）进一步碎裂肽段；获得的质谱图酸）在280nm处有特征吸收峰，可用于纯蛋白质溶液的快速可从混合物中分离特定蛋白质及其相互作用伙伴免疫组化和与蛋白质数据库比对，鉴定蛋白质这种自下而上的蛋白质定量比色法还包括双缩脲反应（检测肽键）、福林酚反应免疫荧光技术可在组织或细胞中定位蛋白质这些方法特异性组学方法能同时鉴定混合物中的多种蛋白质，并分析翻译后修（检测酪氨酸等）和茚三酮反应（检测氨基）等高，但依赖于高质量抗体的可获得性饰，是现代蛋白质组学研究的核心技术蛋白质鉴定通常需要结合多种方法以获得可靠结果例如，未知蛋白质的鉴定可能包括以下步骤SDS-PAGE确定分子量；质谱分析确定氨基酸序列；免疫学方法验证身份；活性测定确认功能针对已知蛋白质，可通过特征性生化性质（如特定酶活性）、免疫反应性或特征性肽图谱（肽指纹图谱）进行确认蛋白质的营养与代谢蛋白质的消化吸收氨基酸代谢蛋白质的消化始于胃部，胃蛋白酶在酸性环境中水解蛋氨基酸代谢的第一步通常是脱氨基，将氨基酸转化为相白质产生多肽大部分蛋白质消化发生在小肠，胰蛋白应的α-酮酸，同时产生氨氨以谷氨酰胺或丙氨酸形式酶、糜蛋白酶等胰腺酶将多肽进一步水解为短肽肠粘在组织间运输，最终在肝脏通过尿素循环转化为尿素排膜细胞表面的肽酶将短肽水解为氨基酸氨基酸和少量出体外α-酮酸骨架则进入不同代谢途径二肽、三肽通过肠上皮细胞主动转运进入血液，经门静•糖原氨基酸可转化为葡萄糖（如丙氨酸、谷氨脉送至肝脏肝脏是氨基酸代谢的中心，控制氨基酸向酸）外周组织的释放•酮原氨基酸可转化为酮体（如亮氨酸、赖氨酸）蛋白质合成•糖原和酮原氨基酸既可转化为葡萄糖又可转化为酮体（如苯丙氨酸、酪氨酸）蛋白质合成是将遗传信息翻译为蛋白质序列的过程，主要包括三个阶段蛋白质降解

1.起始起始因子识别mRNA上的起始密码子，招募蛋白质降解是蛋白质代谢的重要组成部分，主要通过两核糖体小亚基结合种途径进行

2.延伸核糖体沿mRNA移动，tRNA携带的氨基酸按密码子顺序连接•溶酶体途径主要降解内吞的膜蛋白和外源蛋白

3.终止遇到终止密码子，释放因子结合，蛋白质链•泛素-蛋白酶体途径主要降解细胞内异常或短寿命蛋白质释放，核糖体解离蛋白质合成是细胞内能量消耗最大的过程之一，每形成一个肽键需要消耗4个高能磷酸键合成后的蛋白质常需经过折叠、修饰、运输等步骤才能发挥功能蛋白质缺乏症55%38%1/3儿童营养不良率住院患者蛋白质缺乏比例营养不良相关死亡比例在全球某些发展中地区，儿童营养不良率可高达55%，其中蛋白质能量营养不良是研究显示，发达国家医院中约38%的患者存在不同程度的蛋白质营养不良，特别是在五岁以下儿童死亡病例中，约三分之一与营养不良直接或间接相关蛋白质缺乏主要形式营养不良儿童免疫力低下，易患感染性疾病，形成恶性循环老年患者、癌症患者和手术后患者，这显著影响疾病预后和康复进程降低抵抗力，使常见疾病成为致命威胁蛋白质能量营养不良特定蛋白质缺乏症蛋白质能量营养不良（PEM）是最常见的蛋白质缺乏症，在发展中国家尤为普遍根据临床表现，PEM可分为以下类型某些疾病与特定蛋白质的缺乏或异常相关•消瘦型（marasmus）严重能量和蛋白质缺乏，表现为极度消瘦、肌肉萎缩、皮下脂肪消失，但无明显水肿•恶液质慢性疾病（如癌症、AIDS）导致的进行性消瘦综合征，特征是骨骼肌加速分解，脂肪和蛋白质储备减少•水肿型（kwashiorkor）主要是蛋白质缺乏，表现为生长迟缓、肌肉萎缩、皮肤病变、肝肿大和明显水肿•侏儒症生长激素缺乏导致的生长发育障碍•混合型同时具有消瘦型和水肿型特征•贫血血红蛋白合成不足或异常导致的红细胞功能障碍PEM导致的主要生理改变包括血浆蛋白（如白蛋白）水平下降导致水肿；免疫功能减弱增加感染风险；代谢率降低；肝脏•凝血功能障碍凝血因子缺乏导致的出血倾向脂肪沉积；内分泌功能改变等严重的PEM可导致发育迟缓、智力障碍甚至死亡•免疫缺陷免疫球蛋白或补体蛋白缺乏导致的免疫功能障碍预防和治疗蛋白质缺乏症的预防主要依靠均衡饮食，确保足够的蛋白质摄入治疗包括•营养干预提供含优质蛋白质的饮食或特殊配方•治疗并发症控制感染、纠正电解质紊乱和贫血•缓慢恢复避免再喂养综合征蛋白质相关疾病蛋白质错误折叠蛋白质折叠是一个复杂的过程，受多种因素影响当蛋白质未能正确折叠时，会形成具有异常构象的分子这些错误折叠的蛋白质可能失去正常功能，更重要的是，它们倾向于聚集形成不溶性沉积物细胞通常通过蛋白质质量控制系统（如分子伴侣和蛋白酶体）识别并清除错误折叠的蛋白质，但这些系统可能随年龄增长或在病理条件下失效蛋白质聚集错误折叠的蛋白质暴露出通常隐藏在内部的疏水残基，这些残基倾向于相互结合，形成聚集体初始形成的小聚集体（如寡聚体）可能具有细胞毒性随着聚集过程继续，形成更大的聚集体，最终形成淀粉样纤维——高度有序的β折叠片层结构这些纤维可沉积在组织中，形成淀粉样斑块蛋白质聚集还可能触发炎症反应和氧化应激，进一步损伤细胞神经退行性疾病多种神经退行性疾病与特定蛋白质的错误折叠和聚集相关阿尔茨海默病中β-淀粉样蛋白和tau蛋白形成斑块和神经纤维缠结；帕金森病中α-突触核蛋白在多巴胺能神经元中形成路易体；亨廷顿病中含有扩增CAG重复序列的亨廷顿蛋白形成聚集体；脊髓侧索硬化症中超氧化物歧化酶1和TDP-43蛋白发生异常聚集这些蛋白质聚集导致神经元功能障碍和死亡，引起进行性神经功能丧失除淀粉样病变外，蛋白质相关疾病还包括多种遗传性疾病•囊性纤维化由CFTR蛋白基因突变导致，错误折叠的CFTR蛋白无法正确运输到细胞膜，导致氯离子通道功能障碍•α1-抗胰蛋白酶缺乏症突变导致蛋白质在肝细胞内聚集，无法分泌到血液中保护肺组织，导致肺气肿•血友病凝血因子VIII或IX基因突变导致蛋白质功能缺陷，引起出血倾向•镰状细胞贫血血红蛋白β链单点突变导致蛋白质在低氧条件下聚合，使红细胞变形为镰刀状蛋白质的现代研究技术结构预测人工智能技术，特别是深度学习算法，已彻底改变蛋白质结构预测领蛋白质组学域AlphaFold和RoseTTAFold等AI系统能从氨基酸序列预测高蛋白质组学是研究生物体内全部蛋白质的表达、功能和相互作用的学精度三维结构，其准确度接近实验方法这些技术已被用于预测数十科与基因组学不同，蛋白质组会随环境、发育阶段和疾病状态动态万种蛋白质结构，为结构生物学提供前所未有的信息AI辅助蛋白变化现代蛋白质组学技术包括高通量质谱、蛋白质芯片、蛋白质相质结构预测的成功源于大量已知结构数据积累、多序列比对信息利用互作用网络分析等定量蛋白质组学可比较不同条件下蛋白质表达差以及深度神经网络的强大学习能力异，鉴定疾病标志物；功能蛋白质组学研究蛋白质翻译后修饰和相互单分子技术作用，揭示功能调控机制单分子技术能直接观察和操作单个蛋白质分子，揭示传统整体分析方法无法获取的信息单分子荧光共振能量转移（smFRET）可实时监测蛋白质构象变化；原子力显微镜可测量蛋白质分子力学性质；光镊和磁镊可操纵单个蛋白质分子，研究其力学行为；单分子测序技术可分析单个蛋白质的氨基酸组成这些技术为理解蛋白质动态行为和功能机制提供了新视角药物开发蛋白质是药物开发的主要靶点和重要药物类型基于结构的药物设计蛋白质工程利用蛋白质三维结构信息，设计与靶蛋白结合的小分子抑制剂；抗体蛋白质工程是通过基因操作改变蛋白质结构，设计新功能蛋白质的技药物利用抗体高度特异性靶向疾病相关蛋白质；蛋白质降解靶向嵌合术定点突变可改变特定氨基酸，优化蛋白质性质；结构域重组可融体（PROTAC）技术能诱导特定蛋白质降解；mRNA疫苗通过传递4合不同蛋白质功能模块，创造嵌合蛋白；定向进化模拟自然选择过编码抗原蛋白信息诱导免疫反应随着蛋白质结构和功能研究深入，程，筛选具有所需性质的变异体CRISPR-Cas9基因编辑技术简化靶向蛋白质的精准治疗策略将不断涌现了蛋白质工程过程，使原位蛋白质改造成为可能蛋白质工程已广泛应用于生物催化剂改造、生物传感器开发和生物药物设计蛋白质在生命科学中的应用生物医药应用食品与营养应用蛋白质是现代生物医药的核心，其应用包括蛋白质在食品工业中的应用•蛋白质药物胰岛素、干扰素、生长激素等重组蛋白药物已•食品加工酶凝乳酶用于奶酪制作；淀粉酶用于面包改良；挽救无数生命果胶酶用于果汁澄清•单克隆抗体特异性靶向疾病相关分子，用于癌症、自身免•蛋白质基食品添加剂增稠剂、乳化剂、发泡剂和胶凝剂疫疾病等治疗•肉类替代品以大豆蛋白、豌豆蛋白为基础的植物肉•疫苗基于蛋白质抗原的疫苗提供对传染病的保护•功能性蛋白质生物活性肽具有抗氧化、降血压等健康功效•酶替代疗法为先天性酶缺陷疾病提供外源酶•培养肉技术以细胞培养方式生产动物蛋白，减少环境影响•诊断试剂酶标记抗体在体外诊断中的广泛应用研究工具蛋白质组学技术已成为疾病标志物发现的重要工具，为早期诊断和精准医疗提供依据基因治疗和细胞治疗的成功也离不开对关蛋白质作为研究工具的应用键蛋白质功能的理解和操控•限制性内切酶DNA分子克隆的关键工具工业酶制剂•DNA聚合酶PCR技术的核心组分•荧光蛋白细胞结构和蛋白质动态的可视化标记酶是生物催化剂，在工业生产中具有高效、特异和环保等优势•CRISPR-Cas9革命性基因编辑工具•洗涤剂工业蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等去除特定污渍•抗体试剂用于蛋白质检测、纯化和定位•纺织工业纤维素酶用于牛仔布水洗和面料柔软处理•蛋白质骨架用作纳米材料和生物传感器的基础•制革工业蛋白酶用于脱毛和软化皮革•造纸工业木聚糖酶改善纸浆性能，降低环境污染•生物燃料纤维素酶将纤维素转化为可发酵糖随着合成生物学和生物制造技术的发展，蛋白质应用正向更广阔的领域扩展设计蛋白质用于环境污染物降解、可降解生物材料制造、生物计算和纳米机器人等领域的研究正在进行这些创新应用将继续推动蛋白质科学向更深层次发展，为人类社会带来更多福祉总结蛋白质是生命的核心分子通过本课件的学习，我们已经系统了解了蛋白质作为生命物质基础的核心地位从最基本的氨基酸构成，到复杂的三维结构形成；从多样化的生物功能，到广泛的应用领域，蛋白质展现出令人惊叹的复杂性和重要性蛋白质不仅是细胞的结构支架，也是生命活动的功能执行者，从酶催化到信号传导，从免疫防御到遗传调控，蛋白质无处不在结构决定功能，功能多样蛋白质结构决定功能的原理贯穿整个课件我们看到，蛋白质从一级结构（氨基酸序列）开始，通过二级结构（α螺旋和β折叠）、三级结构（空间折叠）到四级结构（多亚基组装）的层层组织，形成精确的三维构象，这种构象决定了蛋白质的特定功能正是这种结构的多样性，赋予了蛋白质从结构支持到催化反应，从分子运输到信号传导的多种功能，使其成为生命活动中最多功能的分子理解蛋白质有助于生命科学发展随着现代研究技术的发展，我们对蛋白质的认识不断深入，从宏观功能到分子机制，从静态结构到动态行为这些认识不仅丰富了基础生命科学理论，也推动了生物技术和医药领域的创新发展从蛋白质药物到工业酶制剂，从疾病诊断到个性化治疗，蛋白质研究的成果正在改变人类健康和生活方式展望未来，随着人工智能和合成生物学等前沿技术的融合，蛋白质科学将迎来更加广阔的发展前景通过对蛋白质的深入学习，我们不仅获得了专业知识，也加深了对生命本质的理解蛋白质科学是一个不断发展的领域，新的发现和应用不断涌现希望本课件能为您打开探索蛋白质奇妙世界的大门，激发进一步学习和研究的兴趣无论是继续深造还是将来从事相关工作，这些基础知识都将成为您宝贵的智力财富。