生化制药大实验-葛根素的提取、分离和精制

葛根素得提取、分离和精制

一、实验目得、建立对生化物质提取、分离及精制过程得认识

1、了解溶剂萃取法、吸附分离法、柱层析法及结晶得基本原理

2、掌握大孔吸附树脂得分离原理和基本操作

3、掌握葛根素得提取、分离和精制方法4

二、实验原理葛根为豆科植物野葛得根，就就是常用Ra dixPuerwr/we uernri a1o bataW i11do hwi得中药，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻等功效葛根中含多种黄酮类成分,主要活性成分为大豆素、大豆式葛根素d ai dzein daid zin pu葛根素-木糖衣等其主要成分为葛根素，即葡萄叱匕喃erarin7-pu erarin-7-x ylos ide8—D—糖-二羟基异黄酮葛根素具有扩张冠脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进-4,7血液循环等作用适用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、视网膜动脉静脉阻塞、霰发鞫邺聋等疾病得治疗，效果显著

1、萃取萃取就就是利用溶质在互不相溶得两项之间分配系数得不同而使溶质得到纯化或e xtra ction浓缩得方法萃取就就是就就是工业生产中常用得分离、提取得方法之一如果含有目标产物得原料为固体,则称此操作为液固萃取或浸取;如果含有目标产物得原料为液体，则称此操作为液液萃取⑴液固萃取液固萃取通称浸取就就是用液体提取固体原料中得有用成分得扩散分leac hi ng,离操作生物分离过程中经常需要利用液固萃取法从细胞或生物体中提取目标产物或除去有害成分例如,从咖啡豆中脱咖啡因，从草莓中提取花色甘色素，从植物组织中提取生物碱、黄酮类皂甘等为了使固体原料中得溶质能够很快得接触溶剂,需对原料进行预处理，一般包括粉碎、研磨、切片等固液萃取操作主要包括不溶性固体中所含得溶质在溶剂中溶解得过程和分离残渣和浸取液得过程⑵液液萃取用溶剂从溶液中抽提物质叫液液萃取，也叫溶剂萃取根据所用萃取剂性质不同或萃取机制得不同，液液萃取可分为多种类型经典得液液萃取指得有机溶剂萃取，在生物产物中用于生物小分子得分离纯化即在液体混合物（原料液）中加入一种与其基本不相混溶得液体作为溶剂，构成第二相,利用原料液中各组分在两个液相中得溶解度不同而使原料液混合物得以分离选用得溶剂称为萃取剂，以表示;原料液中容易溶于得组分，称为溶质，以表示;难溶于得组分称为原溶剂S SA S（或稀释剂），以表示B液液萃取操作得基本过程:将一定量萃取剂加入原料液中，然后加以搅拌使原料液与萃取剂充分混合，溶质通过相界面由原料液向萃取剂中扩散搅拌停止后，两液相因密度不同而分层:一层以溶剂为主,并溶有较多得溶质，称为萃取相，以表示;另一层以原溶剂（稀释剂）为主，且含S EB有未被萃取完得溶质，称为萃余相，以表示实现组分分离得萃取过程即由混合、分层、萃取相R分离、萃余相分离等一系列步骤共同完成

2、吸附分离法吸附（）法就就是指利用吸附作用，将样品中得生物活性物质或杂质吸附于适当得吸adsorption附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力得差异，使目得物和其她物质分离，达到浓缩和提纯目得得方法在工业生产中常用得吸附剂有活性炭、白陶土、氧化铝、硅胶、大孔吸附树脂等

3、柱层析法柱色谱就就是常用色谱分析法得一种,她就就是将固定相装于色谱柱内，色谱过程在色谱柱内进行，按其粗细可分为一般柱色谱法、毛细色谱法及微填充柱色谱法，气相色谱与高效液相色谱都属于柱色谱范围其装置如图2箱d的所示，色谱柱内装有固体吸附剂（固定相），液体样品从柱顶加入，在顶部被吸附剂吸附，然后，从柱顶部加入作为洗脱剂得有机溶剂（流动相），由于吸附剂对各组分得吸附能力不同，各组分以不同速率下移，被吸附较弱得组分在流动相里得百分含量比吸附较强得组分要高，以较快得速率向下移动，而被吸附较强得组分则下移速率较慢，这样,样品中各组分经过反复多次得吸图2柱层析示意图附——洗脱而随溶剂以不同得时间从色谱柱下端流出，从而达到分离得目得如果各组分为有色物质，则可直接观察到不同颜色得谱带分离得到得各组分用不同容器盛取后，可进行定性、定量分析由于色谱法经济、简便、高效、准确等，在药物分离分析中获得了广泛得应用

三、实验材料、试剂和设备

1、实验材料葛根,葛根素（葡萄此喃糖一-二羟基异黄酮）8-p-D—4,

72、实验试剂工业乙醇,正丁醇（）无水乙醇（）甲醇（）AR,AR,AR

3、实验设备粉碎机，标准筛（目），加热回流装置（烧瓶、冷凝管、加热套、温度计、搅拌器），101000mL过滤装置（布氏漏斗、滤纸、抽滤瓶），分液漏斗，量筒，烧杯（、、）锥形50mL100mL500mL,瓶（）滴管，铁架台,旋转蒸发器，天平，容量瓶（、）移液管（）紫外100mL,100mL25mL,1mL;分光光度计

四、实验内容本实验先用乙醇从葛根中提取葛根素粗品，然后再用树脂吸附法对粗品进行分离纯化，具95%体实验操作流程如下葛根粉-碎加乙醇浸泡3次）合并提取液采用大孔吸附树脂水洗除猴）含葛根95%D=素的树脂乙醇洗脱＞乙醇洗脱液浓缩回收乙醇＞含葛根素水溶液正丁醇萃取＞70%正丁醇萃取液回收正丁醇〉葛根素精品

五、实验步骤

1、D101型大网格吸附树脂得预处理大孔吸附树脂（）就就是六十年代末发展起来得一类有机高聚物吸附macfo fe ti cu1af resin剂,她具有多孔网状结构和较好得吸附性能型大孔吸附树脂就就是苯乙烯型弱极性共聚D—101体,就就是一种多孔立体结构得聚合物吸附剂，就就是依靠她和吸附物之间得范德华力通过巨大比表面进行物理吸附具有物化性质稳定，对葛根异黄酮选择性吸附能力强、容易解析、再生简D-101单、不容易老化、可反复使用等优点把葛根醇提取液通过大孔吸附树脂,葛根素被吸附，而大量水溶性杂质随水流出,从而使葛根素与水溶性杂质分离大网格聚合物吸附剂在使用前使用要预处理，特别就就是新购买得大网格聚合物吸附剂，含有许多脂溶性杂质取树脂，用%乙醇溶液浸泡树脂充分溶胀后湿法装柱，以得流50g9524h,2BV/h速洗脱，至流出液与水混合（比例）不呈混浊为止，再用蒸锵水洗至无醇味，备用

152、葛根得预处理称取葛根,用粉碎机粉碎，过目筛将葛根粉末装入到提取瓶中，加入倍量得乙50g10695%醇,过夜

3、葛根素得粗提用加热回流装置从葛根中提取葛根素,一共加热回流次:第一次加倍量得乙醇加热回流3695%提取过滤;第二次滤渣加入倍量得乙醇加热回流提取、过滤;第三次滤渣加入倍量2h,495%15h,2得乙醇加热回流提取过滤合并三次提取液，减压浓缩得粗提浸膏95%1h,

4、葛根素得分离将葛根素粗提物用适量得水溶解后，滤去不溶物，以得流速通过处理好得大孔树脂柱2BV/h（吸附剂用量为粗提物得倍）穿透液重复吸附次，静置用蒸馅水洗去糖类、蛋白质、7330min糅质等水溶性杂质，至水清改用乙醇洗脱（乙醇用量为粗提物得倍）,流速收集70%122BV/h,洗脱液浓缩回收乙醇至无醇味

5、葛根素得精制洗脱液加等体积正丁醇萃取次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇至干

46、葛根素收率得测定将精制葛根素用甲醇溶解并定容至得容量瓶中移取用甲醇稀释至得容量100mL1mL,25mL瓶中，即为样品溶液分析方法:⑴配制一系列葛根素为标准溶液（至少个浓度梯度），以甲醇为空白，读取下得紫5248nm外吸收值以浓度为横坐标、吸收值为纵坐标，得线性回归方程，即为标准曲线（）样品溶液，以甲醇为空白，读取下得吸收值，利用标准曲线,计算溶液浓度Co2248nmnCV稀释倍数样品溶液浓度样品溶液体积x xmg/g葛根素收率葛根质量

六、注意事项、树脂一定要在充分溶胀以后才能装柱

1、预处理好得树脂,一直保持湿润，不能脱水

2、实验结束后，树脂回收到指定得容器中3备注

1、湿法装柱步骤装柱质量就就是确保柱层析分离效果得技术关键之一无论就就是手工、机械、自动化装柱都就就是一样得，要求装入柱中得分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常得溶胀形态和结构一般采用湿法填充,一般步骤为

①层析柱底部若没有石英砂，应放置少量玻璃丝或棉花;要求她们不漏不堵、不吸附样品,且能保持一定得流速；

②固定层析住，柱中加入柱高得溶剂；1/5

③树脂应充分溶胀开始装柱叱应立天柱端阀门，并保持一定得流速加入树脂，需连续、均匀，不要中断,使树脂颗粒均匀沉降，使不发生分层或倾斜；

④装柱之后，用溶剂充分洗涤，把树脂中得微粒、夹杂得尘埃溢流除去，同时驱逐树脂层得气泡，使树脂颗粒填充均匀

2、葛根标准品浓度与吸收值浓度、、、、、C mg/mL00040008001200160020吸收值、、、、、A04920792108813901702。