《分子生物学基本理论》课件

分子生物学基本理论目录第一部分基础理论第二部分进阶内容•第一章分子生物学概述•第四章基因结构与基因组•第二章细胞结构与分子基础•第五章基因表达调控•第三章遗传信息的传递与表达•第六章分子生物学实验技术基础第一章分子生物学概述研究对象与范围学科交叉与应用分子生物学是研究生命现象及其本质的分子基础和机理的科学，主要关注、和蛋白质等生物大分子的结构与功能，以及它们在生命活DNA RNA动中的作用机制分子生物学发展简史11869年米歇尔首次分离DNA21944年艾弗里实验证明是遗传物质DNA31953年沃森与克里克提出双螺旋结构模型DNA41961年尼伦伯格破译遗传密码52003年分子生物学与相关学科关系分子生物学细胞生物学研究生物大分子结构与功能，解析遗传信息的研究细胞结构与功能，分子机制在细胞水平的传递与表达机制整合与表现生物信息学生物化学研究生物体内化学物质及其反应，为分子生物学提供化学基础第二章细胞结构与分子基础原核细胞特点真核细胞特点•无核膜和膜bound细胞器•具有核膜和多种膜bound细胞器•环状DNA直接位于细胞质中•线状DNA与组蛋白结合形成染色质•无内含子，基因组较小•基因含有内含子，结构复杂•转录与翻译同时进行生物大分子概述蛋白质核酸脂类多糖由氨基酸组成的多肽链，具有结构作为遗传信息载体，参与构成生物膜的主要成分，提供细胞DNA RNA多样性和功能特异性，是细胞的主基因表达过程，共同构成遗传信息结构支持和隔离环境，也是信号分要功能执行者传递的基础子和能量储存的重要形式基本结构DNA核苷酸组成双螺旋特点每个核苷酸由三部分组成模型描述Watson-Crick•五碳糖（脱氧核糖）•两条多核苷酸链反向平行排列•含氮碱基（A、T、G、C）•碱基配对原则A=T（两个氢键），G≡C（三个氢键）•磷酸基团•糖-磷酸骨架在外，碱基在内核苷酸通过磷酸二酯键连接形成多核苷酸链结构与类型RNA信使RNA mRNA携带编码的遗传信息到核糖体，作为蛋白质合成的模板DNA特点单链结构，帽子和多聚尾（真核生物），含编码区和非编码区53A转运RNA tRNA负责将氨基酸运送到核糖体，与上的密码子配对mRNA特点三叶草结构，含反密码子环和氨基酸接受臂，多种修饰核苷酸核糖体RNA rRNA构成核糖体的主要成分，参与蛋白质合成过程的催化蛋白质结构层次一级结构氨基酸通过肽键连接形成的线性序列，决定蛋白质的基本性质和后续折叠方式二级结构多肽链局部区域形成的规则构象，主要包括螺旋和折叠，由氢键稳定α-β-三级结构整个多肽链的三维折叠形式，通过疏水相互作用、离子键、氢键和二硫键维持稳定四级结构生物膜结构与功能流动镶嵌模型特点生物膜的主要功能•脂质双分子层作为基本骨架•维持细胞内环境稳定•膜蛋白嵌入或附着于脂双层•选择性物质运输•具有流动性和不对称性•信号转导与细胞识别•含有糖脂和胆固醇等调节成分•能量转换（如线粒体内膜）物质跨膜运输机制1被动运输物质沿浓度梯度方向移动，无需能量消耗•简单扩散小分子直接通过脂双层•易化扩散通过通道蛋白或载体蛋白•离子通道特异性离子快速通过的膜蛋白通路2主动运输物质逆浓度梯度方向移动，需要能量消耗•原发性主动运输直接利用ATP（如Na⁺-K⁺泵）•继发性主动运输利用离子浓度梯度能量（如葡萄糖共转运体）•群体转运通过多步反应改变底物（细菌磷酸转移酶系统）3囊泡运输大分子物质通过膜泡运输进出细胞•胞吞作用细胞摄取外部物质•胞吐作用细胞分泌物质到外界第三章遗传信息的传递与表达DNA复制分子通过半保留复制机制产生两个完全相同的分子，实现遗传DNA DNA信息的准确传递转录的遗传信息被转录为，包括、和等，作为蛋DNA RNAmRNA tRNArRNA白质合成的中间产物翻译上的遗传信息被翻译成蛋白质，通过核糖体、和多种翻译因mRNA tRNA子共同作用完成复制的分子机制DNA半保留复制原理复制过程关键酶类双链DNA解旋后，每条母链作为模板合成新的互补链，最终形成两个相•解旋酶打开双螺旋结构同的双链分子，每个分子包含一条原有链和一条新合成链DNA•单链结合蛋白稳定单链状态•DNA聚合酶合成新链（5→3方向）•RNA引物酶合成RNA引物复制起始与调控DNADNA解旋复制起点识别解旋酶打开双螺旋，形成复制泡，单链DNA结合蛋白稳定单链细胞识别特定序列（），由起始蛋白DNA ORI结合形成起始复合物引物合成引物酶合成短片段作为引物，提供RNA3-端OH片段连接链延长移除引物并填补空缺，连接酶连接RNA DNA相邻片段形成连续链聚合酶根据模板链合成新链，引导链连DNA续合成，随动链形成岗崎片段复制高保真与修复DNA复制纠错机制主要DNA修复途径DNA聚合酶具有3→5外切酶活性，可以检测并修正错配的核苷酸，显•错配修复识别并修复复制过程中漏检的碱基错配著提高复制准确性复制保真度高达，错误率约为至

99.99%10⁻⁹•核苷酸切除修复修复紫外线等引起的碱基损伤10⁻¹⁰•碱基切除修复修复单个碱基损伤转录的分子机制终止阶段延长阶段起始阶段聚合酶沿模板链方向移动，催化RNA5→3RNA聚合酶识别并结合DNA上的启动子序游离核糖核苷酸按照碱基互补原则连接形成列，在转录因子协助下形成转录起始复合链，同时解旋与重结合不断进行RNA DNA物，局部解旋形成转录泡DNA真核原核转录调控差异/原核生物转录调控真核生物转录调控•操纵子结构一个启动子控制多个基因•复杂的启动子结构和远端增强子元件•调控蛋白直接作用于启动子或操纵基因•多种转录因子协同作用•转录与翻译同步进行•染色质结构参与调控•无内含子，RNA不需后处理•RNA需大量后处理（剪接、加帽、加尾）•主要在转录水平调控基因表达加工与成熟mRNA5帽子结构在前体端加上甲基鸟苷（）帽子结构，保护免受mRNA57-m⁷G mRNA核酸酶降解，辅助核糖体结合和出核mRNARNA剪接移除内含子并连接外显子，由剪接体（复合物）介导，识别剪接snRNP5位点、剪接位点和分支点序列33多聚A尾翻译的分子机制起始阶段起始复合物形成小核糖体亚基结合和起始（携带甲硫氨酸），定位mRNA tRNA于起始密码子，随后大亚基加入形成完整核糖体AUG延长阶段按密码子顺序将氨基酸带入核糖体，肽基转移酶催化肽键形成，核tRNA mRNA糖体沿移动一个密码子，过程循环进行mRNA终止阶段遗传密码与密码子遗传密码的特点密码子类型•三联体三个连续核苷酸编码一个氨基酸起始密码子•简并性多个密码子可编码同一氨基酸•AUG（编码甲硫氨酸）作为主要起始信号•无歧义性一个密码子只编码一种氨基酸•少数情况下GUG、UUG等也可作为起始密码子•普遍性大多数生物共用同一套密码终止密码子•无重叠性每个核苷酸通常只属于一个密码子•无标点符号密码子之间无分隔标记•UAA（赭石）•UAG（琥珀）•UGA（蛋白石）翻译后修饰磷酸化糖基化泛素化乙酰化蛋白激酶催化在内质网和高尔基体泛素分子通过多步酶ATP的磷酸基团转移到丝中，糖基转移酶将糖促反应连接到靶蛋白氨酸、苏氨酸或酪氨基加到蛋白质上影赖氨酸残基上标记酸残基上调控蛋白响蛋白质折叠、稳定蛋白质进入蛋白酶体质活性、亚细胞定位性和细胞间识别，对降解途径，也参与非和蛋白质间相互作分泌蛋白和膜蛋白尤降解性信号传导用，是信号转导的关为重要键机制第四章基因结构与基因组基因的定义与组成基因类型基因是DNA分子上具有遗传效应的功能单位，可编码蛋白质或功能•结构基因编码蛋白质典型基因包含RNA•调控基因控制其他基因表达•启动子区转录起始的调控序列•RNA基因编码功能RNA分子•转录单位包含编码序列和非编码序列•假基因失去功能的基因拷贝•终止区转录终止信号真核与原核基因组结构1原核基因组•通常为单一环状DNA分子•基因密集排列，基因间区短•多顺反子结构，可同时表达多个基因•无内含子，基因结构简单•少量非编码DNA，基因组紧凑•常有质粒等附加遗传元件2真核基因组•多条线性染色体，DNA与组蛋白结合•基因分散排列，基因间区长•单顺反子结构，每个基因独立转录•含有内含子，基因结构复杂•大量非编码DNA（包括重复序列）染色体与染色质染色质结构层次组蛋白修饰与功能•DNA双螺旋（2nm）基本遗传物质组蛋白尾部可发生多种共价修饰•核小体（11nm）DNA缠绕组蛋白八聚体•乙酰化通常与转录激活相关•30nm纤维核小体进一步螺旋化•甲基化可激活或抑制转录•染色质环通过支架蛋白固定•磷酸化与染色质凝缩和DNA修复相关•染色单体高度浓缩的染色质•泛素化影响染色质结构与功能、等重复序列LINEs SINEs1长散在重复序列（LINEs）•长度约6-8kb的自主转座元件•编码逆转录酶，可自我复制•通过RNA中间体复制-粘贴转座•人类基因组中占约21%，主要为LINE-1家族2短散在重复序列（SINEs）•长度约100-400bp的非自主转座元件•不编码蛋白质，依赖LINEs提供的转座酶•人类基因组中占约13%，主要为Alu家族•常插入基因间区和内含子3重复序列的功能影响•增加基因组可塑性，促进进化•参与染色质结构形成与调控•提供新的调控元件和外显子•插入可能导致基因突变和疾病细胞分裂与遗传信息传递有丝分裂特点减数分裂特点•分裂前染色体复制一次•染色体复制一次，但分裂两次•形成两个遗传信息完全相同的子细胞•形成四个遗传信息不同的子细胞•无同源染色体配对和交叉互换•同源染色体配对并发生交叉互换•染色体数目保持不变•染色体数目减半（二倍体→单倍体）•用于体细胞增殖和生长细胞周期基本概念G₁期S期细胞生长期，合成和蛋白质，细胞体积合成期，染色体复制，核内含量加RNA DNADNA2增大，为复制做准备倍DNAM期G₂期3有丝分裂期，包括前期、中期、后期和末期，分裂前准备期，合成分裂所需蛋白质，检查细胞质分裂形成两个子细胞复制完整性DNA损伤应答与细胞命运DNADNA损伤感知激酶识别双链断裂或单链暴露，激活下游信号通路ATM/ATR DNAp53活化通过磷酸化稳定蛋白，阻断其与的相互作用，提高ATM/ATR p53MDM2活性p53细胞命运决定活化的根据损伤程度调控不同基因表达，引导细胞进入以下命运p53•细胞周期阻滞轻度损伤，通过p21阻断细胞周期•DNA修复启动修复机制，修复损伤•细胞凋亡严重损伤，通过Bax/PUMA等诱导细胞死亡基因突变类型按分子水平分类按遗传效应分类•点突变单个核苷酸的替换•功能丧失突变基因产物失去功能•同义突变不改变氨基酸•功能获得突变基因产物获得新功能•错义突变改变一个氨基酸•显性负效应突变突变产物干扰野生型功能•无义突变产生终止密码子突变后果•插入/缺失核苷酸的增加或丢失•蛋白质功能改变或丧失•移码突变导致阅读框改变•遗传病与肿瘤发生•重复基因片段的重复基因重组和同源重组DNA双链断裂由核酸内切酶或外部因素如辐射导致DNA双链断裂，触发重组修复机制末端处理断裂末端被切除形成3单链突出，由RecA/Rad51蛋白包被形成核蛋白丝同源搜索与链入侵核蛋白丝侵入同源DNA双链，形成D-loop结构，以同源序列为模板进行DNA合成Holliday结合体形成与解析DNA链交换形成十字结构，解析酶根据切割方式产生交叉或非交叉重组产物第五章基因表达调控操纵子基本结构调控机制以大肠杆菌Lac操纵子为例•负调控阻遏蛋白结合操纵基因阻止转录•正调控CAP-cAMP复合物促进RNA聚合酶结合•调节基因I编码阻遏蛋白•诱导机制乳糖与阻遏蛋白结合使其失活•启动子PRNA聚合酶结合位点•操纵基因O阻遏蛋白结合位点•结构基因Z,Y,A编码代谢乳糖的酶真核基因表达调控DNA甲基化组蛋白修饰非编码RNA调控转录因子网络甲基转移酶在胞嘧啶组蛋白尾部氨基酸残和通miRNA siRNA位加入甲基基团，基的乙酰化、甲基过碱基互补配对靶向5多发生在岛区化、磷酸化等修饰，，引导其降CpG mRNA域高度甲基化通常改变染色质结构和基解或抑制翻译与基因沉默相关，参因可及性不同修饰参与染色质lncRNA与基因组印记和染组合构成组蛋白密重塑和转录调控，形X色体失活码，精确调控基因成复杂的调控RNA表达网络信号转导与分子调控信号识别细胞表面受体（如蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶）识别并结合配体，G引起构象变化信号级联放大通过蛋白激酶级联（如通路）或第二信使（如、）放大MAPK cAMPCa²⁺信号，激活多个下游效应分子核内转导信号最终传递至细胞核，激活或抑制转录因子（如、），调NF-κB STAT控特定基因表达细胞响应复杂性状的分子调控多基因互作模式环境因素与表观调控复杂性状通常由多个基因共同调控，形成复杂的遗传网络环境因素通过表观遗传机制影响基因表达•加性效应多个基因独立贡献•环境诱导的DNA甲基化变化•上位性基因间非加性互作•应激反应触发的组蛋白修饰•多效性一个基因影响多个性状•营养状况调控的ncRNA表达•基因冗余不同基因具有相似功能第六章分子生物学实验技术基础1核酸分离与纯化•基本原理细胞裂解、有机相分离、沉淀或柱层析•常用方法酚-氯仿抽提法、硅胶吸附法•质量评估浓度测定（分光光度法）和完整性检测（凝胶电泳）2电泳分析技术•原理带电分子在电场中按电荷和大小分离•琼脂糖凝胶电泳分离DNA/RNA片段•聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨率分离小片段核酸和蛋白质•脉冲场凝胶电泳分离大分子DNA•变性梯度凝胶电泳检测单核苷酸变异3分子杂交技术•原理互补链通过碱基配对结合•Southern/Northern/Western杂交检测DNA/RNA/蛋白质•原位杂交在细胞或组织中定位特定核酸序列与测序技术PCR聚合酶链式反应PCR DNA测序技术基本原理测序（第一代）Sanger•变性95°C加热使DNA双链分离•基于链终止法，使用ddNTPs•退火50-65°C引物与模板结合•读长长、准确率高，但通量低•延伸72°C DNA聚合酶合成新链高通量测序（）NGS体系组成PCR•平行大规模测序多个DNA片段•模板DNA、特异性引物对•Illumina基于合成测序•耐热DNA聚合酶（Taq聚合酶）•Ion Torrent检测释放的H⁺•dNTPs、缓冲液、Mg²⁺基因克隆与表达目标基因获取通过扩增、合成或基因合成获得目标基因序列PCR cDNA载体准备与连接使用限制性内切酶处理载体和目标基因，通过连接酶连接形成重组分子DNA转化与筛选将重组导入宿主细胞，通过抗性标记或报告基因筛选阳性克隆DNA重组蛋白表达与纯化在适当条件下诱导表达目标蛋白，通过亲和层析等方法纯化基因编辑与系统CRISPR/CasCRISPR/Cas9系统组成基因编辑应用•Cas9核酸酶产生DNA双链断裂•基因敲除通过非同源末端连接修复•引导RNA gRNA•基因敲入通过同源定向修复•CRISPR RNAcrRNA靶向特定序列•基因激活/抑制使用失活Cas9dCas9•反式激活CRISPR RNAtracrRNA结合Cas9•碱基编辑精确修改单个碱基•或使用单一引导RNA sgRNA•PAM序列Cas9识别的必需序列（NGG）杂交Northern/Western/SouthernSouthern杂交检测特定DNA序列限制性内切酶消化基因组DNA→凝胶电泳分离→转移至膜→标记探针杂交→显影检测用于基因定位、多态性分析和基因拷贝数测定Northern杂交检测特定RNA提取总RNA→变性凝胶电泳→转移至膜→标记探针杂交→显影检测用于分析基因表达水平、转录本大小和选择性剪接Western杂交细胞培养与转染技术细胞培养基本技术转染与基因导入方法化学法•无菌操作生物安全柜、灭菌器材•培养条件37°C、5%CO₂、湿度控制•磷酸钙沉淀经济但效率较低•培养基组成基础培养基、血清、抗生素•脂质体转染高效，适用多种细胞•贴壁细胞需胰蛋白酶消化传代物理法•悬浮细胞直接稀释传代•冻存与复苏液氮保存，DMSO作冻存保护剂•电穿孔适用难转染细胞•显微注射单细胞精确操作病毒载体•逆转录病毒整合型，长期表达•腺病毒非整合型，高效转导基因功能分析策略基因敲除（Knockout）通过同源重组或技术使基因失活，观察表型变化确定基因功能适用CRISPR于研究基因的必需性和致病性，但可能因基因冗余而无明显表型基因敲入（Knockin）在特定位点精确插入外源基因或序列，用于基因修复、荧光标记、突变体构建保持基因原有调控元件，但技术难度较高基因过表达使用强启动子驱动目标基因高水平表达，研究基因功能增强效应操作简便，但可能产生非生理状态下的假象RNA干扰技术第七章分子医学与基因工程遗传病分子基础分子诊断与治疗•单基因遗传病由单个基因突变导致•分子诊断方法•显性遗传如亨廷顿舞蹈病•PCR检测特定突变•隐性遗传如囊性纤维化•DNA测序确定序列变异•X连锁如血友病A•基因芯片高通量筛查•多基因疾病多个基因与环境因素互作•分子靶向药物•染色体异常如唐氏综合征•单克隆抗体如曲妥珠单抗•线粒体遗传病母系遗传•小分子抑制剂如伊马替尼•反义核酸药物如诺西那生基因治疗策略基因递送系统将治疗基因导入靶细胞的载体或方法•病毒载体腺病毒、慢病毒、AAV•非病毒载体脂质体、纳米颗粒•物理方法基因枪、电穿孔治疗策略选择根据疾病机制选择合适的基因治疗方式•基因替代补充功能缺失基因•基因抑制沉默有害基因表达•基因编辑修复致病突变•细胞基因治疗体外修饰后回输临床应用实例已获批的基因治疗产品及进展•Luxturna视网膜色素变性治疗•Zolgensma脊髓性肌萎缩症•CAR-T细胞疗法血液系统恶性肿瘤•CRISPR临床试验镰状细胞贫血等转基因与GMOs转基因技术原理应用领域与争议将外源基因整合到受体生物基因组，使其获得新性状主要应用•质粒载体和根癌土壤杆菌介导（植物）•抗虫/抗除草剂作物（Bt棉花、草甘膦抗性大豆）•显微注射（动物受精卵）•营养强化农作物（金大米）•基因枪法（直接DNA导入）•药物生产（人胰岛素，疫苗）•CRISPR/Cas9精准基因修饰•工业原料生产（生物塑料）争议焦点•生态影响与生物多样性•食品安全与过敏原•基因漂移与生物污染•知识产权与经济影响人工合成生物学设计构建利用计算机辅助设计基因线路、代谢途径或整通过合成、基因组装和基因编辑技术，DNA个基因组，基于标准化生物元件库构建设计的基因线路或合成基因组，如JCVI-（）构建模块化系统最小细菌基因组BioBricks syn

3.0应用测试工业化生产有价值产品，如药物前体、生物燃评估合成系统的功能、效率和稳定性，进行性料、材料或传感器，创造全新生物功能能优化，如合成代谢途径产量测定人工合成生物学通过工程化思维重新设计生命系统，创造新型细胞工厂和生物元件，为解决能源、环境、健康等全球性挑战提供创新方案分子生物学前沿与挑战1单细胞组学技术•单细胞测序揭示细胞异质性•单细胞RNA-seq分析转录组差异•单细胞ATAC-seq研究染色质可及性•单细胞多组学联合分析技术发展2空间组学与原位测序•保留空间信息的组织转录组分析•原位测序技术可视化单细胞基因表达•空间蛋白质组与空间代谢组技术•高分辨率三维组织重构3多组学整合与AI应用•整合基因组、转录组、蛋白质组数据•机器学习预测基因功能与相互作用•深度学习解析调控网络复杂性•生物信息学分析方法创新•AI辅助药物设计与精准医疗典型分子生物学实验案例染色体步移实验流程基因追踪实验研究蛋白质相互作用示踪基因表达时空模式DNA-甲醛交联固定蛋白质复合物构建目标基因启动子荧光蛋白报告载体

1.DNA-

1.-

2.染色质超声破碎至200-500bp

2.转染或转基因生物体构建使用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白荧光显微镜观察报告基因表达

3.

3.

4.洗脱并逆交联，释放DNA

4.流式细胞术定量分析表达水平

5.PCR或高通量测序分析结合区域

5.数据分析得出基因表达规律数据分析确定蛋白质结合位点

6.结果解读不同实验条件下荧光强度变化反映启动子活性，揭示基因表达调控机制分子生物学学习与科研能力培养文献检索与阅读掌握PubMed、Web ofScience等数据库使用方法，建立科学文献阅读习惯，学会提取关键信息和批判性分析研究结果，跟踪领域前沿发展实验设计与操作理解实验原理，掌握基本实验技能，学会设计包含适当对照的实验方案，养成规范记录实验过程和数据的习惯，确保实验可重复性数据分析与统计学习基本生物统计方法，掌握常用数据分析软件，培养数据可视化能力，理解组学数据分析流程，提高发现数据中规律的敏感性批判性思维培养质疑精神，不盲从权威，学会从多角度思考问题，理解科学理论的暂时性，在尊重已有知识的基础上寻求创新突破总结与展望分子生物学的理论贡献未来发展方向分子生物学通过揭示生命现象的分子基础，深刻改变了人类对生命本质分子生物学将继续引领生命科学革命的认识•多层次生命系统的整合性研究•阐明了遗传信息的分子本质与传递机制•合成生物学创造全新生命系统•建立了DNA-RNA-蛋白质的中心法则•精准医学个体化诊疗方案•解析了基因表达的复杂调控网络•生物计算与智能生物系统•为进化理论提供了分子层面的证据•生物技术解决全球性挑战•促进了生命科学各分支学科的整合面对日新月异的生命科学发展，保持开放探索的心态，不断学习新知识与技能，是走在科学前沿的必由之路。